Karakterisering van een pathogene Escherichia coli-stam afgeleid van Oreochromis spp. Boerderijen met behulp van whole-genome sequencing

Whole genome sequencing, WGS, kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op antimicrobieel resistent gebied door middel van genoomondervraging en de identificatie van moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan het fenotype van antimicrobiële resistentie. World genome sequencing verbetert de exploratie van DNA, bacterieel DNA op grote schaal, waardoor de diepgaande karakterisering van microben in een enkele run wordt vergemakkelijkt, inclusief nauw verwante pathogene varianten. Next generation sequencing biedt snelle identificatie en karakterisering van micro-organismen en hun antimicrobieel resistente profiel, waarbij een hulpmiddel wordt overwogen voor diagnose, behandeling, surveillance en brontracering van pathogenen in de klinische context.

Next generation sequencing methodologieën kunnen een bepalende rol spelen bij het monitoren en source tracking van pathogenen, niet alleen in de klinische context, maar ook in de omgevingsinstellingen en, belangrijker nog, in de voedselveiligheid. Momenteel is dit geen routinetechniek. Inderdaad, een beetje van de procedure zal het allemaal gemakkelijker maken om te begrijpen hoe succesvol ze het experiment uitvoeren.

De procedure wordt gedemonstreerd door Julissa Enciso-Ibarra, de genomics-technicus van onze werkgroep. Voeg na het extraheren en kwantificeren van bacterieel DNA 2,5 microliter tagmentatiebuffer toe. Twee microliter ingang G D N A in een buis van 0,2 milliliter en mengen door pipetteren.

Voeg een microliter versterkingsbuffer toe en pipetteer op en neer om te mengen. Draai vervolgens de buis op 280 G gedurende één minuut. Plaats de monsters in een thermocycler op 55 graden Celsius gedurende vijf minuten, gevolgd door vasthouden op 10 graden Celsius.

Voeg een microliter neutraliserende buffer toe aan de monsterbuizen en meng voorzichtig door te pipetteren. Draai de buis af en incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens 1,7 microliter van elke indexadapter en drie microliter indexerende PCR-mastermix toe.

Na het mengen van de componenten, spin naar beneden op 280 G gedurende één minuut bij kamertemperatuur. Plaats de monsters in de thermocycler en voer een tweede PCR-reactie uit zoals beschreven in het manuscript. Meng nu de commerciële magnetische kraaloplossing door vortexing.

Volgens de richtlijnen van de fabrikant. Breng het gelabelde of geïndexeerde G D N A-monster over in een nieuwe buis van vijf milliliter en voeg 0,6 microliter magnetische kralen toe voor elke microliter van het uiteindelijke volume van het G D N A-monster. Meng de componenten voorzichtig door te pipetteren en incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.

Plaats de monsterbuizen gedurende twee minuten op een magnetisch rek totdat het supernatant is verdwenen. Gooi het supernatant voorzichtig weg zonder de kralen te storen. Voeg vervolgens 200 microliter vers bereide 80% ethanol toe zonder te mengen.

Incubeer gedurende 30 seconden totdat de eluit is verdwenen en verwijder het supernatant voorzichtig zonder de kralen te storen. Herhaal deze procedure en droog de kralen gedurende 10 minuten aan de lucht. Voeg nu 15 microliter 10 millimol tris buffer toe aan de kralen die zachtjes worden gemengd door te pipetteren en gedurende twee minuten bij kamertemperatuur te incuberen.

Plaats de monsterbuizen gedurende twee minuten op het magnetische rek zodat het supernatant kan verdwijnen. Breng daarna voorzichtig 14 microliter van het supernatant over van de monsterbuis naar een nieuwe buis van 0,2 milliliter en haal de opgeruimde bibliotheek. Ontdooi de reagenspatroon volgens de instructies van de fabrikant.

Trek vijf microliter van de genormaliseerde bibliotheek in een buis met lage binding van 1,5 milliliter en verdun de gepoolde bibliotheek op vier nanomolaire met het juiste volume RSB. Voeg vervolgens vijf microliter toe aan elk van de gepoolde bibliotheek en 0,2 normaal natriumhydroxide in een nieuwe buis met lage binding, 1,5 milliliter. Om de gepoolde bibliotheek te denatureren in singles strengen, mengt u de buis door vortexing.

Draai een minuut naar beneden en incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Voeg nu 10 microliter van de gedenatureerde gepoolde bibliotheek 990 microliter voorgekoelde hybridisatiebuffer toe en meng voorzichtig door pipetteren. Plaats de buis op ijs totdat de uiteindelijke verdunning voor het laden van de sequencer is uitgevoerd.

Giet en bereid een controlebibliotheek voor in een concentratie van vier nanomolar door twee microliter van de controlebibliotheek en drie microliter nucleasevrij water te mengen. Voeg vervolgens vijf microliter toe aan elk van de controlebibliotheek en vers bereid 0,2 normaal natriumhydroxide. Denatureer de besturingsbibliotheek in afzonderlijke strengen, zoals eerder gedemonstreerd.

Meng voorzichtig 10 microliter gedenatureerde besturingsbibliotheek en 990 microliter voorgekoelde hybridisatiebuffer door pipetteren en plaats deze op ijs totdat de uiteindelijke verdunning voor het laden van de sequencer is voltooid. In een nieuwe low bind, 1,5 milliliter buis, combineer je 594 microliter van de gedenatureerde gepoolde bibliotheek en zes microliter van de gedenatureerde controlebibliotheek. Meng de uiteindelijke bibliotheekmix goed en verdun tot een uiteindelijke laadconcentratie van 1,2 peco molair in een volume van 600 microliter met behulp van de voorgekoelde hybridisatiebuffer.

Voordat u de uiteindelijke bibliotheekmix op de reagenscartridge laadt, voert u een extra thermische voorbehandeling uit om een efficiënte belasting in de stroomcel te bereiken. Incubeer de uiteindelijke bibliotheekmix gedurende twee minuten bij 96 graden Celsius. Keer de buis om om te mengen en plaats de buis gedurende vijf minuten op ijs.

Laad 500 microliter van de uiteindelijke bibliotheekmix in het ontwerpreservoir op de reagenscartridge. Na het starten van de sequencer laadt u de reagenscartridge, de stroomcel en stelt u de sequencingrun in. Voor gegevensanalyse maakt u verbinding met de sequencing-gegevensserver en downloadt u de FASTQ-bestanden.

Evalueer de initiële kwaliteit van onbewerkte sequentiegegevens met software van derden. Verwijder resterende adaptersequenties, basissen van lage kwaliteit en korte reads uit de onbewerkte sequencinggegevens. Verzamel de volgordegegevens van de kwaliteitscontrole op contig- of steigerniveau met behulp van software van derden.

Voer genoomannotatie uit door het Phaster-bestand met het geassembleerde genoom in te dienen bij de RAST-server. Upload het Phaster-bestand naar het Center for Genome Epidemiology en Claremont typeringswebplatforms om epidemiologische kenmerken te identificeren. ARGS, VAGS en plasmiden.

Upload het Phaster-bestand naar de Phaster-server om prophage-sequenties te identificeren. Genoomannotatie onthulde 5.633 gecodeerde kenmerken, waarvan 5.524 eiwitcoatinggenen en 109 RNA-gerelateerde sequenties. De voorspelde Escherichia coli stam behoort tot de filogroep B één en sequentie type 40.

Een antimicrobiële resistentiedeterminant, het M D F A-gen dat codeert voor een breedspectrum multi-drug effluxpomp, werd geïdentificeerd. Genen die coderen voor een hittestabiel enterotoxine een serumresistentie-eiwit en het type drie secretiesysteem samen met de uitgescheiden effectoreiwitten werden ook geïdentificeerd. De coderende sequenties zijn gegroepeerd in verzamelingen van functioneel gerelateerde eiwitten die subsystemen worden genoemd, vooral die welke een functionele rol spelen in koolhydraten, eiwitten, aminozuren en afgeleide stofwisselingen en membraantransport.

Goede laboratoriumpraktijken zijn fundamenteel in het hele protocol. Er moet echter speciale aandacht worden besteed aan het verwerken van meerdere monsters tijdens de voorbereiding van de sectie-DNA-bibliotheek om kruisbesmetting te voorkomen.