Name: Een high-throughput platform voor cultuur en 3D-beeldvorming van organoïden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Leer een high-throughput platform voor organoïdcultuur met 3D-beeldvorming. Deze methode gebruikt microtextuurcultuurschalen voor grootschalige groei en langetermijnmicroscopie, essentieel voor kankeronderzoek en medicijnscreening.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Het onderzoek wordt ondersteund door het CALIPSO-project dat wordt ondersteund door de National Research Foundation, Prime Minister's Office, Singapore, in het kader van het Campus for Research Excellence and Technological Enterprise (CREATE) -programma. V.V. erkent de steun van NRF-onderzoeker NRF-NRFI2018-07, MOE Tier 3 MOE2016-T3-1-005, MBI seed funding en ANR ADGastrulo. A.B. en G.G. erkennen de steun van de MBI-kernfinanciering. A.B. erkent Andor Technologies voor de bruikleen van de BC43 microscoop.

OPMERKING: Het eerste deel van dit protocol beschrijft de microfabricage van het celkweekapparaat. Een originele primaire mal met piramidale holtes kan in eigen huis worden geproduceerd - als microfabricagefaciliteiten beschikbaar zijn - of worden uitbesteed aan externe bedrijven. De primaire mal die in dit werk wordt gebruikt, wordt in eigen huis geproduceerd, met elders beschreven fabricageprocesstappen11,13. Een basisprotocol voor de microfabricage van de matrijs is beschikbaar in aanvullend dossier 1. KRITIEK: De bewerkingen in stap 1 tot en met 6 moeten in een stofvrije omgeving worden uitgevoerd. Een laminaire stromingskap of een cleanroom, indien beschikbaar, hebben de voorkeur. Tijdens deze stappen moeten persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM's) worden gebruikt, zoals handschoenen, een laboratoriumjas en een veiligheidsbril.
1. In blokjes snijden van PDMS-mal
<ol><li>Snijd kleine delen van de PDMS-mal tot de afmeting die nodig is voor het uiteindelijke apparaat (bijv. 1 cm x 1 cm [figuur 1B]). Knip ze parallel aan de XY-richtingen van de array. KRITISCH: Bij het snijden van de PDMS-mal in dobbelstenen van 1 cm x 1 cm, voert u de sneden in enkele stappen uit; gebruik een eenzijdig scheermesje, oefen druk uit en snijd in één stap door het PDMS. Dit is om de vorming van kleine deeltjes PDMS te voorkomen, die zich op het oppervlak van de mal kunnen afzetten en de kwaliteit van de replicastappen kunnen beïnvloeden (stap 3).</li>
</ol>2. Bereiding van vlakke PDMS-substraten
<ol><li>Weeg ~ 15-20 g PDMS-basishars en 1,5-2 g van het reticulatiemiddel (d.w.z. een verhouding van 10: 1), meng ze zorgvuldig en ontgas in een vacuümpot gedurende ~ 20 minuten.</li>
	<li>Giet het ontgaste PDMS langzaam op een plastic petrischaaltje van 15 cm breed (diameter).</li>
	<li>Hard het PDMS uit door de petrischaal 2 uur in een oven op 65° C te bewaren. Na het wachten op de uitharding is een platte PDMS-folie van ~1,5 mm dikte (in de petrischaal) klaar voor gebruik (figuur 2A).</li>
	<li>Snijd met een scherp mes stukken van 2 cm x 2 cm uit het PDMS (figuur 2B-D). OPMERKING: De exacte dikte van deze PDMS-plaat is niet kritisch; ~1-2 mm is een geschikt bereik. De afmeting voor de snede moet groter zijn dan de getextureerde mal, maar niet veel groter, wat zou resulteren in verspilling van materiaal.</li>
</ol>3. Productie van de getextureerde laag gemaakt van UV-uithardende lijm
<ol><li>Plaats één PDMS-maldobbelsteen (zoals voorbereid in stap 1) met de voorkant naar beneden bovenop de platte PDMS-snede (zoals voorbereid in stap 2) (figuur 3A, B). OPMERKING: Zorg ervoor dat de piramidale uitsteeksels in de mal zijn gericht op het platte PDMS-substraat en dat alleen het bovenste oppervlak van de afgeknotte piramides in contact is. Beoordeel de juiste plaatsing met een optische microscoop (figuur 3C,D).</li>
	<li>Laat aan de ene kant van de mal, met behulp van een pipet, een kleine hoeveelheid (twee druppels, ongeveer 0,1-0,2 ml) UV-uithardende lijm vallen (figuur 4A). OPMERKING: Naarmate de vloeistof in contact komt met de rand van de mal, zal capillariteit de vloeistof ertoe aanzetten om de holte tussen de mal zelf en de platte snede van PDMS die als substraat wordt gebruikt, te vullen.<ol><li>Volg de progressie van de vloeistof in de holte, bijvoorbeeld met behulp van een omgekeerde optische microscoop met een vergrotingsobjectief van 10x (figuur 4B,C).</li>
	</ol></li>
	<li>Stel de UV-uithardende lijm bloot aan UV-licht om het uit te harden. Pas de blootstellingstijd aan afhankelijk van de vermogensdichtheid van de gebruikte UV-bron (bijvoorbeeld een UV-LED-box met een vermogensdichtheid van 35 mW/cm2; 2 min bij 50% vermogen in dit protocol om de lijm volledig uit te harden).</li>
	<li>Gebruik de overtollige hoeveelheid lijm aan één rand en houd de uitgeharde lijm op het platte PDMS-substraat door voorzichtig met een vinger te drukken (figuur 5A, B). Gebruik ondertussen een pincet om een hoek van de mal naast dezelfde rand te knijpen die wordt vastgehouden en pel deze langzaam af terwijl u ervoor zorgt dat de getextureerde film ook niet wordt opgetild. OPMERKING: Figuur 5C toont het resultaat van een goede schimmelverwijderingsprocedure; Figuur 5E-G toont de verkeerde procedure.</li>
	<li>Snijd de overtollige lijm en het overtollige PDMS-substraat bij met behulp van een scheermesje om de uitgeharde, getextureerde, kleeflaag plat op het PDMS te laten met overtollig PDMS op slechts één rand (figuur 5D), die nodig is in stap 5.</li>
</ol>4. Coverslip substraat voorbereiding
OPMERKING: Als substraat voor het uiteindelijke apparaat worden standaard afgeronde 1,5H-coverslips met een diameter van 25 mm gebruikt. Voordat ze kunnen worden gebruikt, moeten ze worden gereinigd om stof en / of organische resten van hun oppervlak te verwijderen.
<ol><li>Coverslip reiniging<ol><li>Dompel de coverslips gedurende 5 minuten onder in een sopje terwijl de echografie wordt toegepast (40 kHz, 110 W sonische kracht).</li>
		<li>Was de coverslips in schoon gedeïoniseerd (DI) water, eerst door onderdompeling en ten slotte met stromend DI-water uit een kraan. Droog de coverslips af met een N2 gasblaaspistool.</li>
		<li>Dompel de coverslips gedurende 5 minuten onder in een acetonbad; ga onmiddellijk naar een 2-propanol (IPA) bad voor een extra 5 min.</li>
		<li>Spoel de coverslips af met schone IPA met behulp van een knijpfles. Droog de coverslips met het N2 gasblukker. OPMERKING: Coverslips die volgens deze procedure worden gereinigd, kunnen in een gesloten container worden bewaard totdat ze nodig zijn. Bewaar ze in een droge kast om te voorkomen dat vocht zich op hun oppervlak afzet.</li>
	</ol></li>
	<li>Wanneer klaar voor gebruik, behandel een schone coverslip met een kort O2 plasmaproces om de hydrofilie te verbeteren: O2 20 sccm, 3 mbar druk, 60 W bij de RF-stroomgenerator en 60 s duur.</li>
	<li>Ga onmiddellijk na de plasmaactivering verder met het spincoaten van de dunne laag UV-uithardende lijm door de coverslip op de vacuümhouder van een standaard spincoater te plaatsen en een kleine druppel lijm in het midden van de coverslip te gieten (figuur 6). Voer het spin-coatingproces uit: strooien gedurende 5 s bij 500 tpm, coaten bij 3.000 tpm gedurende 45 s (met de acceleratie en vertraging ingesteld op 100 tpm / s).<ol><li>Als spin-coating niet beschikbaar is, gebruik dan de volgende alternatieve manier om een dunne film uv-lijm op de coverslips te produceren:<ol><li>Laat op een schone coverslip ~0,1 ml UV-uithardende lijm vallen met behulp van een pipet (figuur 7A).</li>
			<li>Neem een tweede coverslip en plaats deze bovenop de eerste om de vloeibare lijm gelijkmatig tussen de twee coverslips te verspreiden (figuur 7B-D).</li>
			<li>Zodra de strooilijm de randen van de coverslips heeft bereikt, scheidt u ze voorzichtig door ze over elkaar te schuiven. Eenmaal gescheiden, zijn beide coverslips volledig bedekt met een dunne laag vloeibare lijm (figuur 7E). OPMERKING: De coating is mogelijk niet uniform en glad als de scheiding niet wordt uitgevoerd met een soepele en continue beweging.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Voorbewerking van UV-uithardende lijm<ol><li>Na het spin-coaten, precureer de lijm door blootstelling aan UV. Pas de blootstellingstijd aan afhankelijk van de vermogensdichtheid van de gebruikte UV-bron (hier werd een UV-LED-box met een vermogensdichtheid van 35 mW/cm2 gedurende 1 minuut bij 50% vermogen gebruikt). KRITIEK: De lijm die hier wordt gebruikt, is een optische lijm. Zie de discussie voor belangrijke punten met betrekking tot de energiedoses voor de uitharding ervan.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Overdracht van de getextureerde film naar het uiteindelijke substraat
<ol><li>Neem een van de getextureerde films (voorbereid in stap 3) en plaats deze in contact met de zelfklevende coverslip (voorbereid in stap 4). Zorg ervoor dat het contact tussen de gedeeltelijk uitgeharde lijm op de coverslip en de getextureerde film zo uniform mogelijk is (figuur 8A-C). KRITIEK: In dit stadium moet de lijm op de coverslip stevig genoeg zijn om opnieuw te laten stromen, wat de piramidale holtes van de getextureerde film zou vullen wanneer deze in contact wordt gebracht, maar ook plastic en klevend genoeg is dat contact kan worden geoptimaliseerd door zachtjes op de getextureerde film te drukken.</li>
	<li>Stel de coverslips bloot aan UV-licht totdat de kleeflaag die op de coverslip is gecoat volledig is uitgehard. Dit verzegelt de getextureerde film op de coverslip en zorgt voor een lekvrije isolatie tussen de piramidale holtes.</li>
	<li>Verwijder ten slotte het PDMS-vlakke substraat (figuur 8D-F). Knijp met een pincet het PDMS op een hoek aan de rand waar overtollig materiaal achterbleef na het trimmen (stap 3.5). Op deze manier blijft de getextureerde filmlaag kleefbaar aan de coverslip met open toegang aan de bovenkant voor celzaaien. KRITISCH: Bij het afpellen van het platte PDMS moet de getextureerde film goed vast blijven zitten aan de coverslip. Adhesiefouten zijn gemakkelijk te bevestigen als de getextureerde film na uiteindelijke blootstelling aan UV zonder enige moeite van de coverslip kan worden afgepeld.</li>
</ol>6. Langdurige passivering van de celkweekdeksel voor celkweek
OPMERKING: Passivering wordt bereikt door het genereren van een conformale en continue coating van een biomimetisch copolymeer met een structuur die vergelijkbaar is met de polaire groep fosfolipiden in het celmembraan. Deze hoekgetrouwe coating voorkomt dat cellen hechten aan het celkweekapparaat
<ol><li>Bereid een oplossing met 0,5% (g/v) van het biomimetische copolymeer opgelost in zuivere ethanol. Bewaar de oplossing bij 4 °C voor toekomstig gebruik.</li>
	<li>Plaats de celkweekdeksel in een petrischaaltje van 35 mm en bedek deze volledig met de biomimetische copolymeeroplossing.</li>
	<li>Verwijder na 5 minuten de celkweekdeksel uit de container met de biomimetische copolymeeroplossing en laat deze drogen bij kamertemperatuur in de laatste schotel in een bioveiligheidskap (>1 uur). OPMERKING: Een dikkere coating kan worden geproduceerd door de concentratie van het biomimetische copolymeer in de coatingoplossing te verhogen; de resultaten van een dikkere coating zijn zichtbaar onder een brightfield microscoop (figuur 9A).</li>
</ol>7. Celzaaien
<ol><li>Ontgassen en steriliseren<ol><li>Geef vlak voor het zaaien van de cel steriele fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) af in de celkweekschalen (meestal 1 ml voor een petrischaaltje van 35 mm). Ontgas de schotel met de steriele PBS met behulp van een ultrasoon apparaat gedurende ~ 10 minuten, gevolgd door verschillende pipetteerrondes om alle bubbels te verwijderen. KRITIEK: Als lucht gevangen zit in de piramidale holtes, voorkomt dit dat de cellen ze binnendringen. Om ervoor te zorgen dat er geen lucht in de piramide gevangen zit voordat de cel wordt gezaaid, wordt aanbevolen om visueel te zorgen (onder een benchtop brightfield microscoop bij 10x of 20x vergroting) de afwezigheid van lucht in deze holtes (figuur 10).</li>
		<li>Vervang de PBS door steriel kweekmedium en steriliseer de plaat met UV-licht gedurende 30 minuten onder een celkweekkap. OPMERKING: Vanaf deze stap moet het gerecht als steriel worden beschouwd en gemanipuleerd met behulp van steriele technieken. Een alternatieve manier om opgesloten lucht uit het celkweekapparaat te verwijderen, is door een vacuümpot met een vacuümpomp te gebruiken.</li>
	</ol></li>
	<li>Celsuspensievoorbereiding OPMERKING: Cellen kunnen worden gezaaid als aggregaten van één of kleine cellen en de monsterputten binnenkomen via de bovenste opening. Na verloop van tijd aggregeren en groeien de ingebrachte cellen in de monsterputten tot sferoïden van een grootte groter dan de grootte van het diafragma. Gebruik als gevalideerde cellijnmodellen HCT116 (CCL-247 ATCC) of MCF7 (HTB-22 ATCC) kankercellen die worden onderhouden in het aanbevolen kweekmedium (ATCC-richtlijnen).<ol><li>Bereid een celsuspensie voor (bijvoorbeeld met behulp van een trypsinisatieproces volgens ATCC-richtlijnen). Volg trypsinisatie / celsuspensievoorbereidingsaanbevelingen voor de cellen van belang.</li>
		<li>Tel en pas de celconcentratie aan op 0,5 × 106 cellen/ml in het aanbevolen kweekmedium.</li>
	</ol></li>
	<li>Celdosering<ol><li>Verwijder de PBS-buffer uit de celkweekschaal van 35 mm en doseer vervolgens 1 ml van de aangepaste celsuspensie. Zie figuur 11A voor een optische microscoopafbeelding van een celzaaiprocedure met voldoende celdichtheid en homogeniteit.</li>
		<li>Plaats de celkweekschaal terug in de celincubator (37 °C, 5% CO2 en 100% vochtigheid) gedurende 10 minuten. Ongeveer 80-100 cellen zullen elke piramidale holte binnendringen. OPMERKING: Het is mogelijk om het aantal cellen per celkweekschaal te verhogen door de celconcentratie of de tijd die wordt besteed aan het verwijderen van de celsuspensie te verhogen. Meestal duurt de vorming van sferoïden enkele uren (afhankelijk van het celtype) na het zaaien van cellen en kan worden gevolgd met een brightfield-microscoop (4x tot 40x doelstellingen; Figuur 11). Vanaf hier kunnen kweekmedium, extracellulaire matrices en differentiatiegroeifactoren worden gewijzigd of toegevoegd aan de celkweekschaal die de sferoïden bevat in overeenstemming met typische differentiatieprotocollen die een paar dagen, weken of maanden kunnen duren.</li>
		<li>Na de incubatie van 10 minuten, herstel de celkweekschaal uit de incubator en aspirateer voorzichtig de cellulaire suspensie om niet-gevangen cellen te verwijderen. Voeg 1 ml kweekmedium toe aan een schaal van 35 mm en plaats het terug in de celincubator. KRITISCH: In dit stadium, omdat sferoïden zich nog niet hebben gevormd, is het erg belangrijk om sterke aspiratie of afgifte te voorkomen die zal resulteren in verlies van de cellen. Visuele controle met behulp van een benchtop brightfield microscoop wordt ten zeerste aanbevolen bij deze stap.</li>
	</ol></li>
</ol>8. Immunostaining en beeldvorming
<ol><li>Fixatie en vlekken OPMERKING: Verschillende klassieke procedures van fixatie en immunostaining zijn volledig compatibel met de celkweekschaal. Een typisch protocol wordt hier beschreven.<ol><li>Bevestig de organoïden/sferoïden in de celkweekschaal gedurende 20 minuten in 4% paraformaldehyde bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Permeabiliseer de organoïden gedurende 24 uur in 1% oppervlakteactieve oplossing in steriele PBS bij 4 °C op een orbitale shaker en incubeer gedurende 24 uur in blokkerende buffer (2% runderserumalbumine [BSA] en 1% oppervlakteactieve stof in steriele PBS) bij 4 °C op een orbitale shaker.</li>
		<li>Incubeer de monsters met primaire antilichamen van belang bij een verdunning tussen 1/50 en 1/200 (of volgens de aanbevelingen van de fabrikant) in antilichaamverdunningsbuffer (2% BSA en 0,2% oppervlakteactieve stof in steriele PBS) bij 4 °C gedurende 48 uur.</li>
		<li>Spoel de monsters 3x met wasbuffer op een orbitale shaker (3% NaCl en 0,2% oppervlakteactieve stof in steriel PBS) en incubeer met overeenkomstige secundaire antilichamen in antilichaamverdunningsbuffer (verdunning tussen 1/100 en 1/300 of volgens de aanbevelingen van de fabrikant), 0,5 μg/ml 4',6-diamidino-2-fenylalandool (DAPI) en 0,2 μg/ml Alexa Fluor 647 of 488 falloïdine bij 4 °C gedurende 24 uur op een orbitale shaker, gevolgd door vijf spoelstappen met PBS. Monteer de monsters optioneel met een in water oplosbaar opruimmiddel dat is voorgewarmd tot 37 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Beeldvorming OPMERKING: In dit stadium kunnen de organoïden in de microwellplaat worden beschouwd als een normale kweekschaal met vaste en gekleurde monsters voor beeldvorming: elke standaard beeldvormingsprocedure kan worden gebruikt zonder dat aanpassing of wijziging vereist is. Figuur 12 illustreert een representatief resultaat van beelden en 3D-reconstructie verkregen met behulp van een draaiende schijf confocale microscoop, met een 40x lucht objectief (numeriek diafragma 0,75).<ol><li>Gebruik constructorsoftware voor een automatisch beeldacquisitieproces met de volgende instellingen: belichtingstijd = 50 ms, met een z gemotoriseerde trap om een z-stack te verkrijgen (1 μm Z-stap, voor een totale hoogte van 70 μm).</li>
		<li>Voer 3D-reconstructie uit met behulp van beeldanalysesoftware.</li>
	</ol></li>
</ol>9. Vrijgeven en verzamelen van de organoïden
OPMERKING: De getextureerde kleeflaag van de celkweekschaal kan worden losgemaakt van de coverslip om de levende sferoïden / organoïden (vóór fixatie) in de piramidale holtes vrij te geven voor analyse van de cellen met andere procedures zoals RNA-sequencing, -omic-benaderingen, in vitro experimenten en in vivo transplantatie.
<ol><li>Met het monster nog in de petrischaal en in een bioveiligheidskap, gebruik je een mes zoals een scalpel om een hoek van de getextureerde kleeflaag te snijden.</li>
	<li>Knijp met een pincet de getextureerde kleeflaag op de snijrand en pel deze voorzichtig af van de glazen afdekplaat, maar houd deze ondergedompeld in het medium (sommige organoïden kunnen bij de kleeflaag achterblijven, figuur 13).</li>
	<li>Spoel 3x af met kweekmedium en verzamel de organoïden door te pipetteren.</li>
</ol>

<ol><li>Kim, J., Koo, B. -K., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+organoids%3A+model+systems+for+human+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Human organoids: model systems for human biology and medicine.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).</li>
<li>Takebe, T., Wells James, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+by+design%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Organoids by design.</a> Science. 364 (6444), 956-959 (2019).</li>
<li>Kratochvil, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+materials+for+organoid+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Materials%22%5BJournal%5D)">Engineered materials for organoid systems.</a> Nature Reviews Materials. 4 (9), 606-622 (2019).</li>
<li>Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+potential+in+organoid+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Progress and potential in organoid research.</a> Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).</li>
<li>O'Connell, L., Winter, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids%3A+past+learning+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Organoids: past learning and future directions.</a> Stem Cells and Development. 29 (5), 281-289 (2020).</li>
<li>Vives, J., Batlle-Morera, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+challenge+of+developing+human+3D+organoids+into+medicines%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">The challenge of developing human 3D organoids into medicines.</a> Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 72(2020).</li>
<li>Busslinger, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+and+challenges+of+patient-derived+organoids+in+guiding+the+multimodality+treatment+of+upper+gastrointestinal+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biology%22%5BJournal%5D)">The potential and challenges of patient-derived organoids in guiding the multimodality treatment of upper gastrointestinal malignancies.</a> Open Biology. 10 (4), 190274(2020).</li>
<li>Lukonin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+landscape+of+intestinal+organoid+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Phenotypic landscape of intestinal organoid regeneration.</a> Nature. 586 (7828), 275-280 (2020).</li>
<li>Rios, A. C., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+organoids%3A+a+bright+future+ahead%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging organoids: a bright future ahead.</a> Nature Methods. 15 (1), 24-26 (2018).</li>
<li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).</li>
<li>Galland, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+high-+and+super-resolution+imaging+using+single-objective+SPIM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">3D high- and super-resolution imaging using single-objective SPIM.</a> Nature Methods. 12 (7), 641-644 (2015).</li>
<li>Beghin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+content+3D+imaging+method+for+quantitative+characterization+of+organoid+development+and+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">High content 3D imaging method for quantitative characterization of organoid development and phenotype.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Beghin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+high-speed+3D+imaging+of+organoid+cultures+with+multi-scale+phenotypic+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated high-speed 3D imaging of organoid cultures with multi-scale phenotypic quantification.</a> Nature Methods. 19 (7), 881-892 (2022).</li>
</ol>

Er is een internationale octrooiaanvraag gepubliceerd met publicatienummer WO 2021/167535 A1.

De procedure voor de fabricage van de microwellcultuurschaal, die organoïde cultuur en differentiatie met hoge dichtheid mogelijk maakt, is in dit artikel beschreven. Dankzij de geometrie en rangschikking van de microcaviteiten kunnen duizenden sferoïden gedurende lange tijd (enkele weken of langer) in een enkele plaat worden gekweekt en gekleurd met bijna geen verlies van materiaal. Ter vergelijking: een gebied van 4 mm x 2 mm op de celkweekplaat kan evenveel sferoïden bevatten als een enkele 384-well plaat met een oppe...

In organotypische 3D-celculturen, hierna organoïden genoemd, differentiëren stamcellen en organiseren ze zichzelf in ruimtelijke structuren die sterke morfologische en functionele overeenkomsten delen met echte organen. Organoïden bieden waardevolle modellen om de menselijke biologie en ontwikkeling buiten het lichaam te bestuderen 1,2,3. Er wordt een groeiend aantal modellen ontwikkeld die de lever, hersenen, nieren, longen en vele andere organen nabootsen 2,4,5. Differentiatie in organoïden wordt gestuurd door de toevoeging van oplosbare groeifactoren en een extracellulaire matrix in een precieze tijdsvolgorde. In schril contrast met organen is de ontwikkeling van organoïden echter vrij heterogeen.
Naast tal van biologische uitdagingen 6,7, vormen organoïde culturen ook technologische uitdagingen op het gebied van celkweekmethoden, karakterisering van transcriptomica en beeldvorming. In vivo orgaanontwikkeling vindt plaats in een biologische omgeving die resulteert in een zeer stereotiepe zelforganisatie van celarrangementen. Elke fenotypische verandering kan worden gebruikt als een proxy om een zieke toestand te diagnosticeren. Daarentegen ontwikkelen organoïden zich in vitro in minimaal gecontroleerde micro-omgevingen die compatibel zijn met celkweekomstandigheden, wat resulteert in grote variabiliteit in het ontwikkelingspad en de vormvorming voor elke individuele organoïde.
Een recente studie8 toonde aan dat kwantitatieve beeldvorming van organoïde vorm (fenotype descriptoren) gekoppeld aan de beoordeling van een paar genetische markers de definitie van fenotypische ontwikkelingslandschappen mogelijk maakt. Ongetwijfeld is het vermogen om de diversiteit van genomische expressie in organoïden te relateren aan hun fenotypische gedrag een belangrijke stap in de richting van het ontketenen van het volledige potentieel van organotypische culturen. Het smeekt dus om de ontwikkeling van speciale, high-content beeldvormingsbenaderingen die de karakterisering van organoïde kenmerken op subcellulaire, meercellige en geheel-organoïde schalen in 3D 9,10 mogelijk maken.
We ontwikkelden een veelzijdig high-content screening (HCS) platform dat gestroomlijnde organoïde cultuur mogelijk maakt (van geïsoleerde menselijke embryonale stamcellen [hESCs], door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen [hIPSC's], of primaire cellen naar 3D, meercellige, gedifferentieerde organoïden) en snelle, niet-invasieve 3D-beeldvorming. Het integreert een next-generation, geminiaturiseerd, 3D-celcultuurapparaat, de JeWells-chip (de chip hierna), dat duizenden goed gerangschikte microwells bevat, geflankeerd door 45 ° -spiegels die snelle, 3D-beeldvorming met hoge resolutie mogelijk maken door single-objective light-sheet microscopie11. Dit systeem is compatibel met elke standaard, commerciële, omgekeerde microscoop en maakt de beeldvorming van 300 organoïden in 3D mogelijk met subcellulaire resolutie in <1 uur.
De microfabricage van het celkweekapparaat vertrekt vanuit een bestaande microgestructureerde mal, die honderden micropyramiden bevat (figuur 1A) met een vierkante basis en zijwanden op 45° ten opzichte van de basis. Figuur 1C toont elektronenmicroscoop (EM) beelden van dergelijke structuren. De mal zelf is gemaakt van poly (dimethylsiloxaan) (PDMS) en kan worden gemaakt als een replica gegoten van een primaire mal (hier niet weergegeven) met overeenkomstige kenmerken (als holtes) met behulp van standaard soft-lithografische procedures. De primaire mal kan door verschillende procedures worden geproduceerd. Degene die voor dit protocol werd gebruikt, werd gemaakt met behulp van silicium nat etsen zoals gerapporteerd in Galland et al. 11; de procedure voor de fabricage van de primaire mal is niet van cruciaal belang voor dit protocol. De piramides zijn gerangschikt in een vierkante array, met dezelfde toonhoogte voor de X- en Y-richting (in dit geval is de toonhoogte 350 μm).
Ter illustratie werden proof-of-concept experimenten12 gepubliceerd om aan te tonen dat de chip langdurige kweek (maanden) en differentiatieprotocollen mogelijk maakt, terwijl het aantal initiële cellen in de putten nauwkeurig wordt gedefinieerd. De individuele ontwikkeling van een groot aantal organoïden kan automatisch live worden gevolgd met behulp van standaard brightfield- en 3D-lichtplaatfluorescentiemicroscopen. Bovendien kunnen organoïden worden opgehaald om verder biologisch onderzoek uit te voeren (bijv. transcriptomische analyse). Dit artikel schetst gedetailleerde protocollen voor de fabricage van de celkweek coverslips, de zaai- en kleuringsprocedure voor fluorescentiemicroscopie, evenals het ophalen van de organoïden.

<table><tbody><tr><td>2-Propanol</td><td>Thermofisher scientific</td><td>AA19397K7</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Thermofisher scientific</td><td>AA19392K7</td><td></td></tr><tr><td>BC43 Benchtop Confocal Microscope</td><td>Andor Technology</td><td></td><td>spinning disk confocal microscope</td></tr><tr><td>bovine serum albumin&nbsp;</td><td>Thermofisher scientific</td><td>37525</td><td></td></tr><tr><td>Buffered oxide etching solution</td><td>Merck</td><td>901621-1L</td><td></td></tr><tr><td>CEE Spin Coater</td><td>Brewer Science</td><td>200X</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermofisher scientific</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>Developer AZ400K</td><td>Merck</td><td>18441223164</td><td></td></tr><tr><td>DI Milliq water</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslips</td><td>Marienfled</td><td>117650</td><td>1.5H, round 25 mm diameter</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Invitrogen</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Imaris software</td><td>BitPlane</td><td></td><td>image analysis software</td></tr><tr><td>Inverted Transmission optical microscope</td><td>Nikon</td><td>TSF100-F</td><td></td></tr><tr><td>Labsonic M</td><td>Sartorius Stedium Biotech</td><td></td><td>Ultrasonic homogenizer</td></tr><tr><td>Lipidure</td><td>NOF America</td><td>CM5206</td><td>bio-mimetic copolymer</td></tr><tr><td>NOA73</td><td>Norland Products</td><td>17-345</td><td>UV curable adhesive</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin</td><td>Thermofisher scientific&nbsp;</td><td>A12379</td><td>Alexa Fluor</td></tr><tr><td>Phosphate Buffer Solution</td><td>Thermofisher scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Photo Resist AZ5214E</td><td>Merck</td><td>14744719710</td><td></td></tr><tr><td>Pico Plasma tool</td><td>Diener Electronic GmbH + Co. KG</td><td>Pico Plasma</td><td>For O2 plasma treatment</td></tr><tr><td>RapiClear 1.52</td><td>Sunjin lab</td><td>RC 152001</td><td>water-soluble clearing agent</td></tr><tr><td>RCT Hot Plate/Stirrer</td><td>IKA (MY)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reactive Ion Etching tool</td><td>Samco Inc. (JPN)</td><td>RIE-10NR</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>11875093</td><td>culture medium for HCT116 cells</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td><td>Dow Corning</td><td>4019862</td><td>Polydimethylsiloxane or in short, PDMS</td></tr><tr><td>Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>448931-10G</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9284</td><td>surfactant</td></tr><tr><td>Trypsin EDTA</td><td>Thermofisher scientific</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasonic Cleaner</td><td>Bransonic</td><td>CPX2800</td><td></td></tr><tr><td>UV-KUB 2</td><td>KLOE</td><td></td><td>UV-LED light source, 365 nm wavelength, 35 mW/cm2 power density</td></tr><tr><td>UV mask aligner</td><td>SUSS Microtec Semiconductor (DE)</td><td>MJB4</td><td></td></tr></tbody></table>

een high-throughput platform voor cultuur en 3d-beeldvorming van organoïden

A High-Throughput Platform for Culture and 3D Imaging of Organoids

De karakterisering van een groot aantal driedimensionale (3D) organotypische culturen (organoïden) op verschillende resolutieschalen wordt momenteel beperkt door standaard beeldvormingsbenaderingen. Dit protocol beschrijft een manier om microgefabriceerde organoïde kweekchips te bereiden, die multiscale, 3D live imaging mogelijk maken op een gebruiksvriendelijk instrument dat minimale manipulaties vereist en in staat is tot 300 organoïden / h imaging-doorvoer. Deze kweekchips zijn compatibel met zowel lucht- als onderdompelingsdoelen (lucht, water, olie en siliconen) en een breed scala aan gangbare microscopen (bijv. Draaiende schijf, puntscanner confocal, breed veld en brightfield). Bovendien kunnen ze worden gebruikt met light-sheet modaliteiten zoals de single-objective, single-plane illumination microscopy (SPIM) technologie (soSPIM). 
Het hier beschreven protocol geeft gedetailleerde stappen voor de bereiding van de microgefabriceerde kweekchips en de kweek en kleuring van organoïden. Er is slechts een korte tijd nodig om vertrouwd te raken en verbruiksartikelen en apparatuur zijn gemakkelijk te vinden in normale biolabs. Hier zullen de 3D-beeldvormingsmogelijkheden alleen worden gedemonstreerd met commerciële standaardmicroscopen (bijv. Draaiende schijf voor 3D-reconstructie en wide field microscopie voor routinematige monitoring).

Figuur 8F toont het typische aspect van een celkweekdeksel na succesvolle fabricage. De UV-uithardende lijmlaag ziet er plat uit en hecht goed aan de coverslip. De overdracht van de kleeflaag op de coverslip kan mislukken als de laag op de coverslip overstroomt of als de verwijdering van het platte PDMS-substraat verkeerd gebeurt (zoals weergegeven in figuur 8G, H). In beide gevallen is de storing duidelijk omdat er geen getextureerde film wordt...

Dit artikel presenteert een fabricageprotocol voor een nieuw type kweeksubstraat met honderden microcontainers per mm2, waarin organoïden kunnen worden gekweekt en waargenomen met behulp van microscopie met hoge resolutie. De protocollen voor het zaaien en immunostainen van cellen zijn ook gedetailleerd.

Een high-throughput platform voor cultuur en 3D-beeldvorming van organoïden

The characterization of a large number of three-dimensional (3D) organotypic cultures (organoids) at different resolution scales is currently limited by ...

Dit protocol demonstreert een microtextuur celkweekschaal ontworpen voor de groei van honderden organoïden met kennis van materiaal en volledig compatibel met microscopie. Onze techniek maakt het efficiënt mogelijk om duizenden organoïden te genereren, volledig compatibel met langetermijnbeeldvorming en celkweek op lange termijn. Dit protocol is van groot belang voor biomedische toepassingen zoals de pijplijn voor geneesmiddelenscreening en kankeronderzoeksdomeinen.De techniek die in dit protocol wordt gepresenteerd, is gemakkelijk onder de knie te krijgen na een paar pogingen van iedereen die ervaring heeft met laboratoriumprocedures en optische microscopie. Snijd om te beginnen kleine delen van de PDMS-mal tot de dimensie die nodig is voor het uiteindelijke apparaat. Knip ze parallel aan de XY-richtingen van de array.Plaats een van de voorbereide PDMS-maldobbelstenen met de voorkant naar beneden op het platte PDMS-gedeelte. Voeg vervolgens met een pipet ongeveer 0,1 tot 0,2 milliliter UV-uithardende lijm toe aan één kant van de mal. Volg de progressie van de vloeistof in de holte met behulp van een omgekeerde optische microscoop bij 10X vergroting.Stel de lijm bloot aan UV-licht

a-high-throughput-platform-for-culture-and-3d-imaging-of-organoids

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De gehele 3D-structuur en cellulaire inhoud van organoïden, evenals hun fenotypische gelijkenis met het oorspronkelijke weefsel kan worden vastgelegd met behulp van de single-cell resolutie 3D imaging protocol hier beschreven. Dit protocol kan worden toegepast op een breed scala van organoïden variërend in oorsprong, grootte en vorm.

Single-Cell Resolutie driedimensionale beeldvorming van intacte organoïden

Hier bieden we gedetailleerde, robuuste en complementaire protocollen voor het uitvoeren van kleuring en subcellulaire resolutie beeldvorming van vaste driedimensionale celkweekmodellen variërend van 100 μm tot enkele millimeters, waardoor de visualisatie van hun morfologie, celtypesamenstelling en interacties mogelijk wordt.

Kleuring en beeldvorming met hoge resolutie van driedimensionale organoïde en sferoïde modellen

Een zeer nauwkeurig in vitro high-throughput testsysteem werd ontwikkeld om geneesmiddelen tegen kanker te evalueren met behulp van patiënt-afgeleide tumororganoïden (BOB's), vergelijkbaar met kankerweefsels, maar zijn ongeschikt voor in vitro high-throughput testsystemen met 96-well en 384-well platen.

High-Throughput In Vitro Assay met behulp van patiënt-afgeleide tumor organoïden

Dit protocol beschrijft een semi-geautomatiseerde methode voor medium- tot high-throughput organoïde medicijnscreenings en microscoop-agnostische, geautomatiseerde beeldanalysesoftware om multiparametrische, single-organoïde geneesmiddelresponsen te kwantificeren en te visualiseren om intratumor heterogeniteit vast te leggen.

Multiparametrische tumor organoïde drug screening met behulp van Widefield Live-Cell Imaging voor bulk en single-organoïde analyse

De huidige studie beschrijft methodologieën voor het kweken, bevriezen, ontdooien, verwerken, kleuren, labelen en onderzoeken van volledige sferoïden en organoïden onder verschillende microscopen, terwijl ze intact blijven in een hydrogel in een multifunctioneel apparaat.

Kweken, invriezen, verwerken en afbeelden van volledige organoïden en sferoïden terwijl ze nog in een hydrogel zitten

Dit protocol documenteert de fabricage en assemblage van SPOT, een op steigers gebaseerd cultuurplatform met hoge doorvoer, in formaten met 96 en 384 putjes. Het beschrijft ook het zaaiproces voor SPOT, zowel handmatig als met behulp van een in de handel verkrijgbare vloeistofverwerker.

Reproduceerbare productie van SPOT als een op steigers gebaseerd cultuurplatform met hoge doorvoer

We presenteren een stapsgewijs protocol voor hoge-resolutie, labelvrije en driedimensionale beeldvorming van organoïden met behulp van low-coherence holotomografie. Dit protocol beschrijft de voorbereiding van de organoïdecultuur, de beeldvorming en de computationele beeldanalyse, waardoor real-time visualisatie van structurele dynamiek en geneesmiddelresponsen in levende organoïden mogelijk is.

Labelvrije 3D-beeldvorming met hoge resolutie en machine learning-analyse van darmorganoïden via holotomografie met lage coherentie

We ontwikkelden een nieuw meerdere compartimenten neuron co-cultuur microsysteem platform voor in-vitro CNS axon-glia interactie onderzoek. Het platform is in staat het uitvoeren van maximaal zes onafhankelijke experimenten in parallel en werd vervaardigd met behulp van een nieuw ontwikkelde macro / micro hybrid fabricage methode.

Een Multi-compartimenten CNS Neuron-glia Co-cultuur Microfluïdische Platform

Lensfree on-chip beeldvorming en karakterisering van de cellen wordt geïllustreerd. Deze on-chip cell imaging benadering biedt een compacte en kosteneffectief instrument voor medische diagnostiek en high-throughput celbiologie toepassingen, waardoor het bijzonder geschikt voor de arme bevolking.

Lensless On-chip Beeldvorming van cellen verschaft een nieuw instrument voor High-throughput Cell-Biologie en Medische Diagnostiek

We stellen robuuste biochemische en microscopische methoden voor het...

Biochemische en High Throughput microscopische beoordeling van Fat Mass in<em&gt; Caenorhabditis Elegans</em

Leer een high-throughput platform voor organoïdcultuur met 3D-beeldvorming. Deze methode gebruikt microtextuurcultuurschalen voor grootschalige groei en langetermijnmicroscopie, essentieel voor kankeronderzoek en medicijnscreening.

Een high-throughput platform voor cultuur en 3D-beeldvorming van organoïden

Meer video's verkennen