Cellulaire affiniteit van deeltjesgestabiliseerde emulsie om antigeenintern internalisatie te stimuleren

We ontwikkelden de PLGA nanodeeltjes gestabiliseerde Pickering emulsie. De Pickering-emulsie verbeterde de cellulaire affiniteit met antigeeneiwitcellen, waardoor een efficiënte internalisatie van antigenen werd geïnduceerd. De nanodeeltjes gestabiliseerde Pickering-emulsies waren gemakkelijk te bereiden en leverden antigeen efficiënt af.

Daarnaast werd een methode gebruikt om de affiniteit van emulsie met cel te monitoren en de internalisatie uit te werken. Dit protocol biedt inzichten voor het ontwerpen van nieuwe formuleringen met een hoge celefficiëntie en efficiënte antigeeninneralisatie, die een platform bieden voor de ontwikkeling van efficiënte vaccins. Voeg om te beginnen 100 milligram polymelk-co-glycolzuur toe aan 10 milliliter aceton en ethanolmengsel in een verhouding van vier op één om als oliefase te dienen.

Plaats 20 milliliter PVA waterige oplossing onder de zuurkast en roer magnetisch met 400 omwentelingen per minuut. Voeg vijf milliliter van de oliefase druppelsgewijs toe aan de PVA-oplossing met behulp van een spuitpomp. Roer vervolgens het mengsel in de zuurkast totdat de organische oplosmiddelen volledig verdampen.

Na de vervluchtiging van organische oplosmiddelen, centrifugeer het mengsel op 15.000 G.Was drie of meer keer totdat het uiteindelijke waswater helder en transparant is. Suspensieer de gewassen PLGA-nanodeeltjes opnieuw in twee milliliter gedeïoniseerd water en vries het mengsel gedurende 24 uur in op 80 graden Celsius. Om de grootte en het zetapotentieel van PLGA-nanodeeltjes te karakteriseren, voegt u 10 microliter PLGA-nanodeeltjes toe aan één milliliter gedeïoniseerd water om een verdunningsoplossing te verkrijgen en de verdunningsoplossing over te brengen naar een DTS1070-cel.

Schakel de computer en de dynamic light scattering analyzer in. Plaats vervolgens de DTS1070-cel in het DLS-systeem. Klik op de Zetasizer-software en maak een nieuw meetbestand om de bepalingsprocedure in te stellen.

Start vervolgens de bepalingsprocedure om de deeltjesgrootte en zetapotentiaalverdeling te verkrijgen. Om PLGA-nanodeeltjes gestabiliseerde Pickering-emulsie of PNPE te bereiden, voegt u gevriesdroogde PLGA-nanodeeltjes toe aan gedeïoniseerd water in een concentratie van vier milligram per milliliter en voegt u vervolgens squalaan toe als de oliefase. Bereid PNPE voor via ultrasoonapparaat in één stap gedurende vijf minuten op 100 watt in een waterbadsonicator.

Verdun 20 microliter PNPE en één milliliter gedeïoniseerd water. Laat 20 microliter van de emulsie op de dia vallen. Observeer de morfologie en homogeniteit van de emulsie met behulp van optische microscopie bij 40 keer vergroting en verkrijg foto's.

Schakel de spin coater in door op de aan/uit-knop te drukken. Druk op de bedieningsknop en stel de coatingtijd en -snelheid in. Sluit de stikstofleiding aan op de spincoater en pas de fractionering van de gasfles aan op 0,4 kilopascal.

Plaats de schone chip op de zuignap van de spin coater. Voeg 100 microliter poly-l-lysine druppelsgewijs toe aan het midden van de siliciumdioxidesensor en sluit de bovenklep van de spincoater. Druk op de startknop om het monster te coaten en stop de machine wanneer deze klaar is.

Schakel de vacuümpomp uit, schakel de aan /uit- en bedieningsknoppen uit en verwijder de poly-l-lysine gemodificeerde siliciumdioxidesensor. Om de hechting van biomimetische extracellulaire blaasjes op PNPE te bepalen, schakelt u de computer, de elektronische eenheid en de peristaltische pomp in en activeert u de temperatuurregeling rechtsonder in de software om ervoor te zorgen dat de ingestelde temperatuur ongeveer één graad Celsius onder kamertemperatuur is. Plaats de poly-l-lysine gemodificeerde siliciumdioxidesensoren in de stroomcel volgens de gebruiksaanwijzing en sluit de meetlijn tussen de stroomcel en de stroompomp aan.

Plaats de stroomcel in het stroommodulesysteem. Klik op de acquisitiewerkbalk en selecteer Setup Measurement om te zoeken naar 1, 3, 5, 7, 9 en 11 octaven van de chip in het gebruikte kanaal. Om de basislijn te corrigeren, klikt u op Meting starten om lucht in de stromingsmodule toe te laten totdat de luchtbasislijn glad is.

Na 10 tot 15 minuten gedeïoniseerd water te hebben laten stromen om het basislijnevenwicht van de oplossing weer mogelijk te maken, pompt u de bereide PNPE-oplossing in de stroommodule met een stroomsnelheid van 50 microliter per minuut om evenwichtsadsorptie op de siliciumdioxidesensor te bereiken. Pomp de bereide biomimetische extracellulaire blaasjesoplossing in de stroommodule met een stroomsnelheid van 50 microliter per minuut om het proces van bEV-hechting aan het PNPE-oppervlak te volgen. Incubeer de beenmergdendritische cellen met 1640 volledige media gedurende zeven dagen en zaai ze vervolgens in kleine confocale laserschalen op 1 keer 10 tot de 6 per put 's nachts bij 37 graden Celsius en een 5% kooldioxide-incubator.

Meng 0,5 milliliter cyanine 5 gelabeld ovalbumine, met 0,5 milliliter PNPE gedurende één uur en verwijder het vloeibare antigeen door centrifugatie bij 5.000 G gedurende 20 minuten om vaccinformulering te ontwikkelen. Voeg na re-suspensie met 200 microliter gedeïoniseerd water 10 microliter van de formulering toe aan de kleine confocale laserschalen onder een superschone bank en co-kweek met beenmergdendritische cellen gedurende zes uur. Nadat u de kweekvloeistof uit de cellen hebt verwijderd, wast u ze twee keer met voorverwarmd fosfaat gebufferde zoutoplossing.

Bevestig de cellen met 4% formaldehyde-oplossing en PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Was de cellen met PBS twee of drie keer op kamertemperatuur gedurende 10 minuten elk. Permeabiliseer de cellen met 100 microliter 0,5% Triton X-100-oplossing gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.

Nadat u de cellen opnieuw met PBS hebt gewassen, bedekt u de cellen op de glazen bodemschaal van de kleine confocale laserschalen met 200 microliter fluoresceïne-isothiocyanaat geconjugeerde falloïdine-werkoplossing en incubeert u gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Na het wassen van de cellen met PBS drie keer gedurende vijf minuten elk, herain de kernen met 200 microliter DAPI-oplossing gedurende ongeveer 30 seconden. Schakel voor beeldanalyse de confocale microscoophardware in volgorde in, inclusief de laser, confocale, microscoop en computer.

Klik op de software en selecteer Nikon Confocal om het testsysteem te openen. Schakel in het confocale microscoopsysteem de verschillende eenheden in de aangegeven volgorde in. Stel eerst de FITC-, DAPI- en Cy5-kanalen in en pas de bijbehorende HV en offset aan.

Plaats vervolgens na het selecteren van de 100 keer olielens en plaats een druppel cederolie op de bovenkant de kleine confocale laserschalen met gekleurde beenmergdendritische cellen op het microscoopstadium. Klik op de scanknop. Onder fluorescentiemicroscoop lokaliseer je interessante cellen door de x-as, y-as en z-as te bewegen.

Stem de laserintensiteit, beeldgrootte en andere parameters af om het scannen van confocale beelden van hoge kwaliteit mogelijk te maken. Klik ten slotte op de knop Vastleggen en sla de afbeeldingen op. De hechting van biomimetische extracellulaire blaasjes aan PNPE werd gevolgd met behulp van QCM-D.

Een onmiddellijke afname van de frequentie wees op een snelle hechting van biomimetische extracellulaire blaasjes aan PNPE na de ontmoeting. Bovendien nam delta F af met toenemende biomimetische extracellulaire blaasjesconcentratie, wat een concentratieafhankelijk effect weerspiegelt. PLGA-microdeeltjes en oppervlakteactieve nano-emulsie waren zwak gebonden aan biomimetische extracellulaire blaasjes, zelfs bij een hoge concentratie van 80 microgram per milliliter, wat waarschijnlijk het gevolg was van een gebrek aan contactplaatsen met de immuuncellen.

Het cyanine-5 ovalbumine fluorescerende signaal gaf aan dat de totale hoeveelheid antigeen geïnternaliseerd in cellen significant hoger is in de met PNPE behandelde groep in vergelijking met die in de PLGA-microdeeltjes en oppervlakteactieven-gestabiliseerde nano-emulsie behandelde groep. De kwantitatieve analyse van cellulaire opname toonde een significant hogere relatieve intensiteit van fluorescentie en beenmergdenndritische cellen behandeld met PNPE dan bij cellen behandeld met PLGA-microdeeltjes en oppervlakteactieve nano-emulsie. De verkregen resultaten toonden aan dat de PNPE de antigeeninneralisatie bevorderde en het antigeen effectief intracellulair afleverde.

Om homogene emulsie te verkrijgen, moet het mengsel tijdens het ultrasoonapparaat continu worden geschud.