Microdissectie van het knaagdieroog

Oculair onderzoek in vroegere tijden was vooral gebaseerd op het oogweefsel van overleden personen. In de loop der jaren zijn er echter veel oogheelkundige knaagdiermodellen ontwikkeld en is de behoefte aan menselijk oogweefsel afgenomen. Vanwege de kleine omvang en het beperkte operatiegebied in het oog van het knaagdier, is de effectieve toegang tot de oculaire subonderdelen ernstig beperkt.

Typisch, om het oog van een knaagdier te opereren, wordt het oog geïmmobiliseerd via de oogzenuw en wordt de dissectie uitgevoerd. Deze oefening is zwaar en kan het fragiele weefsel beschadigen omdat het bolvormige oog blijft bewegen tijdens de dissectie. Ondanks dat het nuttig is bij het isoleren van de verschillende secties van retinale lagen, kan deze techniek de ruimtelijke oriëntatie van het weefsel bij dissectie van het weefsel niet afbakenen.

Verder is een gerichte interventie moeilijk te lokaliseren na dissectie vanwege de homogene cellulaire assemblage van de achterste en voorste oogcup. In deze video wordt een aangepaste chirurgische methode voor microdissectie gedemonstreerd. De aanwezigheid van het bijgevoegde nictitating membraan, of het derde ooglid, biedt unieke en significante voordelen.

Bij deze methode wordt eerst de oogbol geënucleeerd met het derde ooglid, waarna het derde ooglid wordt gebruikt om het oog te immobiliseren. Het wordt gevolgd door het doorboren van de oogbol door de corneale limbus en de incisie wordt gebruikt als het punt van binnenkomst. Vervolgens worden door langs de omtrek te snijden, voorste en achterste oogschelpen gescheiden.

Door de achterste oogschelp verder te ontleden, wordt de doorschijnende laag van het neurale netvlies geïdentificeerd en voorzichtig afgepeld. De neurale en RPE-lagen worden zo verkregen voor verdere verwerking. Het derde ooglid zal ons in staat stellen om de ruimtelijke oriëntatie van de oogpost-enucleatie af te bakenen.

Laten we nu een gedetailleerde stapsgewijze procedure volgen. Verwijd de knaagdierogen met behulp van een druppel 0,8% tropicamide en 5% fenylefrine oftalmische oplossingen en plaats het dier gedurende 30 minuten vóór de procedure in een donker gebied. Euthanaseer het dier door intraperitoneaal vijf keer doses anesthesie toe te dienen.

Een typische dosis is 200 microliter PBS met 10 mg ketamine en één mg xylazine. Bevestig het volledige gebrek aan respons op stimulus door de pedaalreflex te onderzoeken. Plaats de muis in laterale lighouding om volledige toegang tot het oog mogelijk te maken.

Houd een Colibri-hechttang, een gebogen tang, een micromesje van 15 graden en drie millimeter groot, een veermicroschaar en een schuine veermicroschaar klaar voor de procedure. Plaats een gebogen tang rond de oogbol en knijp om het oog te bevrijden van externe aanhechtingen. Het derde ooglid, ook bekend als het nictitating membraan, bevindt zich in de bovenhoek van de nasale tangens en kan worden geïdentificeerd als een kleine doorschijnende uitstulping met gepigmenteerde grenzen.

Gebruik vervolgens een veermicroschaar en knip rond de oogbol. Kleine, doorlopende sneden bevrijden de oogbol van sclerale hulpstukken. Plaats een gebogen veermicroschaar onder de oogbol om het oog te bevrijden door de oogzenuw door te snijden.

Plaats het enucleated oog in een petrischaaltje met PBS-buffer, zodat de oogbol wordt ondergedompeld in PBS. Sommige extraoculaire spieren of weefsels beginnen weg te drijven van de oogbol. Verwijder ze door ze met een veermicroschaar van de oogbol af te knippen.

Verwijder vervolgens de oogzenuw van de basis van de oogbol om een betere scheiding van het netvlies mogelijk te maken voor hele voorbereidingen. Het is niet nodig om de oogzenuw te verwijderen voor weefselsecties. Breng de oogbol over in een tube van 1,5 ml met één ml 4% paraformaldehyde of PFA.

Bewaar het twee uur bij vier graden Celsius voor weefselfixatie. Het is mogelijk om bij deze stap te pauzeren door het weefsel maximaal 12 uur in PFA te laten bij vier graden Celsius. Voor de isolatie van levende cellen mogen de fixatiestappen echter niet worden uitgevoerd en moet de hele procedure in continuüm worden uitgevoerd.

Breng na PFA-fixatie de oogbol over in een petrischaaltje met PBS en plaats het onder een ontleedmicroscoop om de volgende procedure uit te voeren. Immobiliseer de oogbol door het derde ooglid stevig vast te houden met een Colibri-hechttang. De limbus is de corneale sclerale overgang.

Maak een kleine incisie bij de limbus door deze te doorboren met een microblade. De incisie wordt bij voorkeur tegenover het derde ooglid gemaakt. Vervolgens, met deze incisie als uitgangspunt, maak je met de microschaar kleine en continue sneden langs deze corneale sclerale limbusomtrek.

Voltooi eerst een halve cirkel van sneden vanaf het incisiepunt tot het derde ooglid. Voltooi vervolgens de resterende halve cirkel van sneden aan de andere kant. Maak ten slotte een snee rond het derde ooglid om de achterste en de voorste cup te scheiden.

Verwijder de lens van de achterste cup met behulp van een tang om de achterste cup te verkrijgen die bestaat uit het neurale netvlies en de RPE-laag en de corneale voorste cup. Bij het werken met niet-gefixeerde weefsels kunnen de voorste en achterste cups nu enzymatisch worden verteerd om corneale of retinale eencellige suspensie te verkrijgen. Voor het fixeren van de weefsels, breng deze cups over in een buis van 1,5 ml met 1 ml 4% PFA gedurende 12 uur bij vier graden Celsius.

Na fixatie kan het weefsel worden ingebed in het juiste medium en kan cryosectionering of paraffinesectie worden uitgevoerd om cornea- of retinale secties te verkrijgen. Breng de achterste beker opnieuw in de petrischaal met PBS-buffer. Een ondoorzichtige laag op de gepigmenteerde RPE-laag is het neurale netvlies.

Verwijder het neurale netvlies met een tweede tang. Een zeer zachte en lichte beweging van de hand wordt ten zeerste aanbevolen om het weefsel niet te beschadigen. Bij de oogzenuw, uitgang, kan de gebogen veerschaar onder het neurale netvlies worden ingebracht en kan een snede worden gemaakt om de lagen volledig vrij te maken als het neurale netvlies vast blijft zitten.

Het netvlies kan ook worden bevrijd of losgemaakt door het zachtjes te aaien met een zachte borstel. Breng de voorste en achterste kopjes opnieuw in de petrischaal met PBS-buffer. Gebruik een schuine veermicroschaar om een snede te maken naast het derde ooglid van de periferie loodrecht op het optische centrum.

Houd het derde ooglid vast en maak een snee naast de eerste snede. Maak een vergelijkbare snee tussen de tweede snee en het derde ooglid. Drie of vier van dergelijke gelijke sneden openen de halfronde kopjes in een bloemvorm, die plat valt en gemakkelijk kan worden gemonteerd.

Maak geen zeer diepe sneden tot het midden van de beker, omdat dit ervoor kan zorgen dat de bladsecties uit elkaar vallen of gemakkelijk scheiden. Het vloeibare medium zorgt ervoor dat de voorste oogschelp een gebogen structuur krijgt. Volg dezelfde stappen als gegeven voor het maken van sneden op de achterste beker om drie of vier gelijke sneden op de voorste beker te maken.

De weefsels zijn nu klaar voor verdere kleuring. In deze figuur wordt de hele voorste beker getoond. Het hoornvliesweefsel werd zoals beschreven gemicrodissecteerd om de lymfevaten in het aangehechte conjunctivale weefsel van de hoornvliesblaadje te onthullen.

In deze figuur wordt het geheel van het neurale netvlies getoond. De retinale vasculatuur van het neurale netvlies was gekleurd met isolectine en is zichtbaar als groene bloedvaten. Bij deze methode wordt de enucleated oogbol van de muizen verkregen met het bijgevoegde derde ooglid voor effectieve en eenvoudige hantering.

Het derde ooglid immobiliseert de oogbol volledig en laat de dissectie met gemak en minimale fouten verlopen. Deze methode is voordelig voor oculaire weefselspecifieke secties, eencellige analyse en wholemounts. De noodzaak van repetitieve weefselfixatie maakt het weefsel echter niet levensvatbaar voor celkweek of dergelijke levende celbehoeften.

Daarom moet de procedure in continuüm worden uitgevoerd voor levende celisolatie.