Name: Microdissectie van het knaagdieroog (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: Leer microdissectie van het knaagdieroog voor oculair onderzoek met behulp van een verfijnd protocol. Deze methode minimaliseert weefselschade en verbetert de isolatie van retinale lagen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr. Alaknanda Mishra, Department of Cell Biology and Human Anatomy, University of California Davis, USA, trainde ons in deze methode aan het National Institute of Immunology, New Delhi. Dit werk werd ondersteund door de kernsubsidie ontvangen van het Department of Biotechnology, Government of India aan het National Institute of Immunology, New Delhi. P.S. kreeg een onderzoeksbeurs van de afdeling Biotechnologie.

Deze procedure werd goedgekeurd door de Institutional Animal Ethics Committee van het National Institute of Immunology, New Delhi. Het serienummer van de goedkeuring is IAEC#480/18. De experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de regelgevingsrichtlijnen van het Comité voor controle en toezicht op dierproeven, ministerie van Visserij, Veeteelt en Zuivel, regering van India, onder toezicht van een professionele dierenarts bij de SAF, NII.
1. Voorbereiding
<ol><li>Verwijd de knaagdierogen met een druppel van 0,8% tropicamide en 5% fenylefrine oftalmische oplossingen in elk oog. Plaats het dier gedurende 30 minuten vóór de procedure in een donker gebied. OPMERKING: Een pijnstiller is niet nodig omdat het dier onmiddellijk na het voltooien van de 30 minuten wordt geëuthanaseerd. De donkere aanpassing en verwijding van de ogen van het dier stellen de waarnemer in staat om vóór de procedure te controleren op oculaire scheuren en schade. Bovendien is verwijding voordelig tijdens het werken met het gepigmenteerde oogbolweefsel.</li>
	<li>Euthanaseer het dier door intraperitoneaal een dosis van 5x de anesthesie toe te dienen. Een typische dosis is 200 μL PBS met 10 mg ketamine en 1 mg xylazine. OPMERKING: De dosis voor het euthanaseren van het dier is ketamine bij 400-500 mg / kg lichaamsgewicht en xylazine bij 50 mg / kg lichaamsgewicht intraperitoneaal toegediend. Voor een typische muis met een gewicht van 20 g zou de dosis 200 μl PBS zijn met 10 mg ketamine (100 μl van een stamoplossing van 100 mg / ml ketamine) en 1 mg xylazine (100 μl van een stamoplossing van 10 mg / ml xylazine).</li>
	<li>Bevestig het volledige gebrek aan respons op een stimulus door de pedaalreflex te onderzoeken. De afwezigheid van een hartslag en ademhaling zijn ook belangrijke indicatoren.</li>
	<li>Plaats de muis in laterale lighouding om volledige toegang tot het oog mogelijk te maken.</li>
	<li>Bereid Colibri hechttangen, gebogen tangen, een micromes (15°, 3 mm groot), veermicroschaar en schuine veermicroschaar klaar voor de procedure.</li>
</ol>2. Enucleatie van het muisoog samen met het derde ooglid
<ol><li>Plaats de muis in laterale lighouding om volledige toegang tot het oog mogelijk te maken. Open de buitenste oogleden met de tang om het derde ooglid optimaal te visualiseren. OPMERKING: Het derde ooglid, ook bekend als het nictitating membraan, bevindt zich in de bovenhoek van de nasale tangens (figuur 1A).</li>
	<li>Identificeer het derde ooglid als een klein doorschijnend uitsteeksel met een gepigmenteerde grens (figuur 1B).</li>
	<li>Plaats een gebogen tang rond de oogbol en knijp om het oog te bevrijden van externe hulpstukken. Dit minimaliseert bloedingen in het oog van het omliggende weefsel.</li>
	<li>Vervang de gebogen tang door een veermicroschaar en knip rond de oogbol met het derde ooglid eraan. Gebruik kleine doorlopende sneden om de oogbol los te maken van de omliggende weefselaanhechtingen.</li>
	<li>Plaats een gebogen veermicroschaar onder de oogbol om het oog te bevrijden door de oogzenuw door te snijden. Zorg ervoor dat de oogbol volledig uit de oogkas wordt losgelaten.</li>
</ol>3. Het verwijderen van het vreemde weefsel
<ol><li>Plaats het enucleated oog van de geëuthanaseerde muis in een petrischaaltje met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) buffer bij pH 7,4, met de petrischaal zodanig gevuld dat de oogbol wordt ondergedompeld in PBS.</li>
	<li>Immobiliseer de enucleated oogbol van de muis met het aangesloten derde ooglid met één hand met behulp van een tang.</li>
	<li>Hang de oogbol op in vloeibaar medium om een efficiëntere hantering mogelijk te maken. Sommige extraoculaire spieren of weefsels beginnen weg te drijven van de oogbol. Verwijder ze door ze met een veermicroschaar van de oogbol af te knippen.</li>
	<li>Knip en verwijder de oogzenuw van de basis van de oogbol met behulp van een microschaar om de betere scheiding van het netvlies mogelijk te maken voor voorbereidingen voor de hele montage. OPMERKING: Het is niet nodig om de oogzenuw te verwijderen voor weefselsecties.</li>
	<li>Was de oogbol met PBS en breng deze over in een buis van 1,5 ml met 1 ml 4% paraformaldehyde (PFA) gedurende minimaal 2 uur bij 4 °C voor weefselfixatie. OPMERKING: De procedure kan bij deze stap worden gepauzeerd door het weefsel maximaal 12 uur bij 4 °C in PFA te laten. Voor de isolatie van levende cellen mogen de fixatiestappen echter niet worden uitgevoerd en moet de hele procedure zonder pauzes worden uitgevoerd.</li>
</ol>4. Dissectie van het enucleated oog om de voorste en achterste oogschelpen te verkrijgen
<ol><li>Na de PFA-fixatie (als levende cellen worden verzameld, ga dan verder zonder de fixatie van de oogbol), breng de oogbol over in een petrischaal met PBS en plaats deze onder een ontleedmicroscoop om de volgende procedure uit te voeren.</li>
	<li>Immobiliseer de oogbol door het derde ooglid stevig vast te houden met een Colibri-hechttang.</li>
	<li>Maak een kleine incisie bij de limbus door deze te doorboren met een micromesje. De limbus is de cornea-sclerale overgang. Maak de incisie bij voorkeur tegenover het derde ooglid en maak zo een toegangspunt voor de veermicroschaar. OPMERKING: Het gebruik van een microblade van 15° en 3 mm groot kan een betere controle geven over de diepte van deze incisie.</li>
	<li>Gebruik vervolgens deze incisie als uitgangspunt, maak met een microschaar kleine en continue sneden langs de omtrek van de cornea-sclerale limbus. Voltooi eerst een halve cirkel van sneden vanaf het incisiepunt tot het derde ooglid. Voltooi vervolgens de resterende halve cirkel van sneden aan de andere kant. Maak ten slotte een snee rond het derde ooglid om de achterste cup en de voorste cup te scheiden. OPMERKING: Afhankelijk van de oogschelp van belang, kan het nictitating membraan worden bevestigd aan de voorste of achterste oogschelp.</li>
	<li>Verwijder de lens van de achterste cup met behulp van een tang om de achterste cup te verkrijgen die bestaat uit de lagen neurale retina en retinale pigmentepitheel (RPE). De lens, achterste beker en voorste beker van het oog zijn dus gescheiden. OPMERKING: Als u met niet-gefixeerde weefsels werkt, kunnen de voorste en achterste cups nu enzymatisch worden verteerd om een hoornvlies- of retinale eencellige suspensie te verkrijgen.</li>
	<li>Voor het fixeren van de weefsels, breng deze cups over in een buis van 1,5 ml met 1 ml 4% PFA gedurende 12 uur bij 4 ° C. OPMERKING: Na fixatie kan het weefsel worden ingebed in een geschikt medium en kan cryo-sectie of paraffinesectie worden uitgevoerd om cornea- of retinale secties te verkrijgen.</li>
</ol>5. Isolatie van het neurale netvlies en de RPE-lagen
<ol><li>Breng de achterste beker opnieuw in de petrischaal met PBS-buffer om het weefsel onder te dompelen.</li>
	<li>Controleer op de aanwezigheid van het neurale netvlies. Dit kan worden gevisualiseerd als een ondoorzichtige laag op de gepigmenteerde RPE-laag, die is bevestigd aan de perifere omtrek van de beker.</li>
	<li>Houd het derde ooglid vast met een tang om de achterste cup te immobiliseren en verwijder het neurale netvlies vanaf de periferie met een tweede paar tangen. OPMERKING: Zeer zachte en lichte bewegingen van de hand worden ten zeerste aanbevolen om het weefsel niet te beschadigen. Bij de uitgang van de oogzenuw kan de gebogen veerschaar onder het neurale netvlies worden ingebracht en kan een snede worden gemaakt om de lagen volledig vrij te maken als het neurale netvlies bevestigd blijft zoals afgebeeld in figuur 3. Maak eventueel het netvlies vrij of los met zachte streken met een zachte borstel. Het zou echter niet gepast zijn om dit te doen als het netvlies wordt verzameld voor histologie. OPMERKING: Het neurale netvlies en de gepigmenteerde RPE-laag met het derde ooglid worden dus verkregen.</li>
</ol>6. Segmentatie van retinale en RPE-lagen voor wholemounts
<ol><li>Breng de voorste en achterste kopjes opnieuw in de petrischaal met PBS-buffer en plaats de schaal onder de ontleedmicroscoop.</li>
	<li>Immobiliseer de voorste cup door het derde ooglid ingedrukt te houden.</li>
	<li>Gebruik een schuine veermicroschaar om een snede te maken van ongeveer 3/4 van de diameter van de oogschelp naast het derde ooglid, waarbij u vanuit de periferie loodrecht op het optische centrum snijdt.</li>
	<li>Houd het derde ooglid vast en maak een snee naast de eerste snee.</li>
	<li>Maak een vergelijkbare snee tussen de tweede snee en het derde ooglid. OPMERKING: Drie of vier van dergelijke gelijke sneden openen de halfronde kopjes in een bloemvorm, die plat valt en gemakkelijk kan worden gemonteerd.</li>
	<li>Immobiliseer de achterste cup door het derde ooglid ingedrukt te houden.</li>
	<li>Volg dezelfde stappen als gegeven voor het maken van de sneden (stappen 6.3-6.5) op de voorste beker om drie of vier gelijke sneden op de achterste beker te maken. OPMERKING: Voor de histologie van het neurale netvlies geïsoleerd in stap 5, maak vergelijkbare sneden om ervoor te zorgen dat het plat op een oppervlak valt. Maak geen zeer diepe sneden naar het midden van de beker, omdat dit ervoor kan zorgen dat de bladsecties uit elkaar vallen of gemakkelijk scheiden.</li>
	<li>Voer de kleuring uit en monteer de weefsels in hun geheel voor effectieve visualisatie 7,8. OPMERKING: De aanwezigheid van het nictitating membraan fungeert als een constante fysieke indicator van de nasale kant van de oogschelp in wholemounts. Het helpt om de dorsale / ventrale kant van de oogschelp af te bakenen, omdat het derde ooglid van de oogschelp de nasale / ventrale oriëntatie aangeeft.</li>
</ol>

<ol><li>Choi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+cancer+immunotherapy+using+patient-derived+xenografts+%28PDXs%29+in+humanized+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Studying cancer immunotherapy using patient-derived xenografts (PDXs) in humanized mice.</a> Experimental and Molecular Medicine. 50 (8), 1-9 (2018).</li>
<li>Sutherland, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+Capture+Microdissection+of+Highly+Pure+Trabecular+Meshwork+from+Mouse+Eyes+for+Gene+Expression+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis.</a> J Vis Exp. (136), e57576(2018).</li>
<li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).</li>
<li>Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. S., Sinha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cell+cultures+from+the+mouse+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e56997(2018).</li>
<li>Claybon, A., Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+a+mouse+eye+for+a+whole+mount+of+the+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Dissection of a mouse eye for a whole mount of the retinal pigment epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (48), e2563(2011).</li>
<li>Steven, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+induction+and+three-dimensional+two-photon+imaging+of+conjunctiva-associated+lymphoid+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Experimental induction and three-dimensional two-photon imaging of conjunctiva-associated lymphoid tissue.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 49 (4), 1512-1517 (2008).</li>
<li>Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+mount+immunofluorescent+staining+of+the+neonatal+mouse+retina+to+investigate+angiogenesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), e50546(2013).</li>
<li>Ullmann, J. F., Moore, B. A., Temple, S. E., Fernandez-Juricic, E., Collin, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinal+wholemount+technique%3A+A+window+to+understanding+the+brain+and+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%2C+Behavior+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">The retinal wholemount technique: A window to understanding the brain and behaviour.</a> Brain, Behavior and Evolution. 79 (1), 26-44 (2012).</li>
<li>Nakao, S., Hafezi-Moghadam, A., Ishibashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatics+and+lymphangiogenesis+in+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Lymphatics and lymphangiogenesis in the eye.</a> Journal of Ophthalmology. 2012, 783163(2012).</li>
<li>Mishra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+blood-derived+monocytes+show+neuronal+properties+and+integration+in+immune-deficient+rd1+mouse+model+upon+phenotypic+differentiation+and+induction+with+retinal+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Peripheral blood-derived monocytes show neuronal properties and integration in immune-deficient rd1 mouse model upon phenotypic differentiation and induction with retinal growth factors.</a> Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 412(2020).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Oculaire microdissectie is een moeilijke taak gebleken vanwege de kleine omvang en bolvorm van het knaagdieroog, en het knaagdieroog vereist innovatieve technieken voor een efficiënte hantering8. 
In de huidige gedemonstreerde methode wordt de enucleated muisoogbol verkregen met het derde ooglid bevestigd voor een effectieve en eenvoudige hantering. Met behulp van het derde ooglid kan de oogbol volledig worden geïmmobiliseerd, waardoor de dissectie gemakkelijk en met mi...

Oculaire dissectie is een belangrijke techniek in oogheelkundig onderzoek en heeft onderzoekers in staat gesteld om toegang te krijgen tot de segmenten van het oog voor gerichte studies. Eerder vertrouwden oculaire onderzoekers op het oogweefsel van zieke personen voor hun studies. Het geleidelijk groeiende aantal stammen van oogheelkundige knaagdiermodellen1 in de loop der jaren heeft echter de behoefte aan menselijk oogweefsel verminderd. Deze muizenstammen hebben een dieper begrip van oogziekten en interventies mogelijk gemaakt. Toch hebben ze ook een behoefte aan innovatieve technieken van oculaire microdissectie gegenereerd. De kleine omvang en het beperkte werkgebied beperken de effectieve toegang tot de oculaire subdelen ernstig. Verder is het, vanwege de homogene cellulaire assemblage van de achterste en voorste oogschelpen, moeilijk om gerichte interventies na de dissectie uit te voeren. De huidige microdissectietechnieken van laser2 en chirurgische microdissectie 3,4 zijn ontoereikend om aan dergelijke eisen van oculair onderzoek te voldoen. Laser micro-dissectie is zeer effectief in single-cell analyse, maar het specifieke weefsel moet micro-ontleed worden vóór de laserprocedure2. De techniek kan kleine interessante gebieden isoleren van een vooraf ontleed weefsel voor moleculaire analyse. De techniek is dus niet geschikt voor het voorbereiden van wholemounts of voor het isoleren van axiaal verpakte oculaire lagen voor optimale visualisatie.
De chirurgische methode is de meest gebruikte techniek; Deze methode omvat het immobiliseren van het oog via de oogzenuw5 en vervolgens het uitvoeren van de dissectie. Deze oefening is zwaar en kan elk kwetsbaar weefsel beschadigen, omdat het bolvormige oog blijft bewegen tijdens de dissectie. Ondanks dat het gunstig is voor het isoleren van de verschillende delen van de retinale lagen, kan de techniek de ruimtelijke oriëntatie van het weefsel bij dissectie niet afbakenen.
Tijdens de dissectie biedt het handhaven van de aanwezigheid van het aangehechte nictitating membraan of het derde ooglid (figuur 1) unieke en significante voordelen. Bij deze methode wordt eerst de oogbol geënucleeerd met het derde ooglid. Vervolgens wordt het derde ooglid gebruikt om het oog6 te immobiliseren (figuur 2A). Dit wordt gevolgd door het doorboren van de oogbol door de corneale limbus en het gebruik van de incisie als het punt van binnenkomst (figuur 2B, C). Vervolgens worden de oogschelpen gescheiden door anterieur en posterieur langs de omtrek te snijden (figuur 2D-G). Door de achterste oogschelp verder te ontleden, kan de doorschijnende laag van het neurale netvlies worden geïdentificeerd en voorzichtig worden afgepeld. Drie of vier equidistante sneden worden vervolgens gemaakt in de verkregen halfronde voorste en achterste kopjes, waardoor deze bloemvormige kopjes plat op een glijbaan kunnen vallen (figuur 2H).
Het derde ooglid helpt bij een eenvoudige en efficiënte hantering tijdens de dissectie, waardoor minimale schade aan het weefsel wordt gegarandeerd tijdens de toegang tot de verschillende ooglagen en bij het produceren van hele mounts. Verder helpt de aanwezigheid van het derde ooglid om gelokaliseerde interventies tijdens visualisatie te lokaliseren en te onderzoeken.
De procedure, in ons laboratorium, is uitgevoerd op een CBA / J of een rd1-muizenstam op P28 van elk geslacht. De procedure kan worden uitgevoerd op elke stam, leeftijd of geslacht van het dier en heeft geen vooroordeel volgens deze kenmerken.
De dieren werden verkregen uit commerciële bronnen (zie tabel met materialen) en onderhouden in de Small Animal Facility (SAF) van het National Institute of Immunology (NII). Ze werden gehouden in individuele geventileerde kooien (IVC) en kregen ad libitum toegang tot verzuurd geautoclaveerd water en voedsel. Ze werden gehandhaafd bij 21-23 °C en met een licht/donkercyclus van 14 uur/10 uur.
Hieronder wordt een aangepaste chirurgische methode gegeven voor de microdissectie van een muizenoog.

```html
<table>
<tbody>
<tr>
<td>Acetaminophen (Biocetamol)</td>
<td>EG Pharmaceuticals</td>
<td></td>
<td>Geen specifiek catalogusnummer (lokale aankoop)</td>
</tr>
<tr>
<td>Alkaline Phosphatase Kit (DEA)</td>
<td>Coral Clinical System, India</td>
<td></td>
<td>Geen specifiek catalogusnummer (lokale aankoop)</td>
</tr>
<tr>
<td>Automated analyser</td>
<td>Tulip, Alto Santracruz, India</td>
<td>Screen Maaster 3000</td>
<td>Biochemische analyser voor leverfunctietest</td>
</tr>
<tr>
<td>Betadine (Povidon-Jodiumoplossing)</td>
<td>Win-Medicare; India</td>
<td></td>
<td>Geen specifiek catalogusnummer (lokale aankoop)</td>
</tr>
<tr>
<td>Biologische veiligheidskast (klasse I)</td>
<td>Kartos international; India</td>
<td></td>
<td>Geen specifiek catalogusnummer (lokale aankoop)</td>
</tr>
<tr>
<td>Heldere veld microscoop</td>
<td>Olympus, Japan</td>
<td>LX51</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>CBA/J ingebreide muizen</td>
<td>The Jackson Laboratory</td>
<td>Stock No. 000654</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Cefotaxime (Taxim)</td>
<td>AlKem; India</td>
<td></td>
<td>cefotaxime natriuminjectie, geen specifiek catalogusnummer (lokale aankoop)</td>
</tr>
<tr>
<td>Celzevener</td>
<td>Sigma; VS</td>
<td>CLS431752</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Collageenase Type I</td>
<td>Gibco by Life Technologies</td>
<td>17100-017</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Wattenstaafjes</td>
<td>Pure Swabs Pvt Ltd; India</td>
<td></td>
<td>Geen specifiek catalogusnummer (lokale aankoop)</td>
</tr>
<tr>
<td>DPX-medium</td>
<td>Sigma; VS</td>
<td>6522</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Drape Sheet</td>
<td>JSD Surgicals, Delhi, India</td>
<td></td>
<td>Geen specifiek catalogusnummer (lokale aankoop)</td>
</tr>
<tr>
<td>Eosine Y-oplossing, alcoholisch</td>
<td>Sigma; VS</td>
<td>HT110132</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Pincetten</td>
<td>Major Surgicals; India</td>
<td></td>
<td>Geen specifiek catalogusnummer (lokale aankoop)</td>
</tr>
<tr>
<td>Gasanesthesiesysteem</td>
<td>Ugo Basile; Italië</td>
<td>211000</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Glucose</td>
<td>Himedia, India</td>
<td>GRM077</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Haarverwijderingscrème (Veet)</td>
<td>Reckitt Benckiser, India</td>
<td></td>
<td>Geen specifiek catalogusnummer (lokale aankoop)</td>
</tr>
<tr>
<td>Hematoxylinfoplossing, Mayer's</td>
<td>Sigma; VS</td>
<td>MHS16</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Heparine-natriumzout</td>
<td>Himedia; India</td>
<td>RM554</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Hyaluronidase uit schapentesten</td>
<td>Sigma; VS</td>
<td>H6254</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>I.V. Cannula (Plusflon)</td>
<td>Mediplus, India</td>
<td>Ref 1732411420</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Insuline-spuit</td>
<td>BD; VS</td>
<td>REF 303060</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Isofluraan (Forane)</td>
<td>Asecia Queenborough</td>
<td>Geen B506</td>
<td>Inhalatieanesthesie</td>
</tr>
<tr>
<td>Ketamine (Ketamax)</td>
<td>Troikaa Pharmaceuticals Ltd.</td>
<td></td>
<td>Ketaminehydrochloride IP, geen specifiek catalogusnummer (lokale aankoop)</td>
</tr>
<tr>
<td>Meloxicam (Melonex)</td>
<td>Intas Pharmaceuticals Ltd; India</td>
<td></td>
<td>Geen specifiek catalogusnummer (lokale aankoop)</td>
</tr>
<tr>
<td>Micronaaldhouders recht & gebogen</td>
<td>Mercian; Engeland</td>
<td>BS-13-8</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Micronaaldhouders recht & gebogen</td>
<td>Mercian; Engeland</td>
<td>BS-13-8</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Microtoom</td>
<td>Histo-Line Laboratories, Italië</td>
<td>MRS3500</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Nylondraad</td>
<td>Mighty; India</td>
<td></td>
<td>Geen specifiek catalogusnummer (lokale aankoop)</td>
</tr>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>Himedia; India</td>
<td>GRM 3660</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Percoll</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-0891-01</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Refresh Tears/Eyemist Gel</td>
<td>Allergan India Private Limited/Sun Pharma, India</td>
<td>P3060</td>
<td>Geen specifiek catalogusnummer</td>
</tr>
<tr>
<td>RPMI</td>
<td>Himedia; India</td>
<td></td>
<td>Geen specifiek catalogusnummer (lokale aankoop)</td>
</tr>
<tr>
<td>Scalpel</td>
<td>Major Surgicals; India</td>
<td></td>
<td>Geen specifiek catalogusnummer (lokale aankoop)</td>
</tr>
<tr>
<td>Scharen</td>
<td>Major Surgicals; India</td>
<td></td>
<td>Geen specifiek catalogusnummer (lokale aankoop)</td>
</tr>
<tr>
<td>SGOT (ASAT) KIT</td>
<td>Coral Clinical System, India</td>
<td></td>
<td>Geen specifiek catalogusnummer (lokale aankoop)</td>
</tr>
<tr>
<td>SGPT (ALAT) KIT</td>
<td>Coral Clinical System, India</td>
<td></td>
<td>Geen specifiek catalogusnummer (lokale aankoop)</td>
</tr>
<tr>
<td>Shandon Cryotome E Cryostat</td>
<td>Thermo Electron Corporation; VS</td>
<td></td>
<td>Geen specifiek catalogusnummer</td>
</tr>
<tr>
<td>Sucrose</td>
<td>Sigma; VS</td>
<td>S0389</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Chirurgisch mes nr. 22</td>
<td>La Medcare, India</td>
<td></td>
<td>Geen specifiek catalogusnummer (lokale aankoop)</td>
</tr>
<tr>
<td>Chirurgisch bord</td>
<td>Locaal gemaakt</td>
<td></td>
<td>Geen specifiek catalogusnummer (lokale aankoop)</td>
</tr>
<tr>
<td>Chirurgisch wit plakband</td>
<td>3M India; India</td>
<td>1530-1</td>
<td>Micropore chirurgisch plakband</td>
</tr>
<tr>
<td>Hechtdraad</td>
<td>Ethicon, Johnson & Johnson, India</td>
<td>NW 5047</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Spuiten (1 ml, 26 G)</td>
<td>Dispo Van; India</td>
<td></td>
<td>Geen specifiek catalogusnummer (lokale aankoop)</td>
</tr>
<tr>
<td>Trimmer (Klipper)</td>
<td>Philips</td>
<td>NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Weegmachine</td>
<td>Braun</td>
<td></td>
<td>Geen specifiek catalogusnummer (lokale aankoop)</td>
</tr>
<tr>
<td>William's E Media</td>
<td>Himedia; India</td>
<td>AT125</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Xylazine (Xylaxin)</td>
<td>Indian Immunologicals Limited</td>
<td></td>
<td>Sedativum, pre-anestheticum, pijnstiller en spierverslapper</td>
</tr>
</tbody>
</table>
```

microdissectie van het knaagdieroog

Microdissection of the Rodent Eye

De oculaire microdissectie van het knaagdieroog omvat de segmentatie van de enucleated oogbol met het aangehechte nictitating membraan, of derde ooglid, om de voorste en achterste oogschelpen te verkrijgen. Met deze techniek kunnen de subdelen van het oog, inclusief het hoornvliesweefsel, neuraal weefsel, retinale pigmentepitheel (RPE) weefsel en lens, worden verkregen voor wholemounts, cryo-sectie en / of eencellige suspensies van een specifiek oogweefsel. De aanwezigheid van het derde ooglid biedt unieke en significante voordelen, omdat het het behoud van de oriëntatie van het oog ten goede komt, wat belangrijk is voor het begrijpen van de oogfysiologie na een gelokaliseerde interventie of in studies met oculaire analyse met betrekking tot de ruimtelijke topografie van het oog.
Bij deze methode enucleeerden we de oogbol bij de oogkas samen met het derde ooglid door voorzichtig en langzaam door de extraoculaire spieren te snijden en de oogzenuw door te snijden. De oogbol werd met behulp van een microblade door de corneale limbus gestoken. De incisie werd gebruikt als het punt van binnenkomst, waardoor langs de cornea-sclerale overgang kon worden gesneden door microscharen door het incisiepunt in te brengen. Kleine en continue sneden langs de omtrek werden gemaakt totdat de kopjes gescheiden waren. Deze kunnen verder worden ontleed door de doorschijnende laag van het neurale netvlies voorzichtig af te pellen met behulp van een Colibri-hechttang om het neurale netvlies en de RPE-lagen te verkrijgen. Verder werden drie/vier equidistante sneden gemaakt van de periferie loodrecht op het optische centrum totdat de oogzenuw werd bereikt. Hierdoor werden de halfronde kopjes in een roosvorm geopend zodat ze plat vielen en gemakkelijk gemonteerd konden worden. Deze techniek is in ons lab gebruikt voor cornea wholemounts en retinale secties. De aanwezigheid van het derde ooglid bakent de nasale-temporele oriëntatie af, wat de studie van verschillende celtherapie-interventies na transplantatie mogelijk maakt en dus de gerichte fysiologische validatie die van vitaal belang is voor visualisatie en nauwkeurige weergave in dergelijke studies.

Een hele verzameling rd1 muis oog/hoornvliesweefsel werd voorbereid om potentiële lymfe-angiogenese in het voorste/hoornvliesweefsel in een zieke toestand te bestuderen. Het aangehechte conjunctivale weefsel van het derde ooglid fungeerde als een positieve controle, omdat het hoornvlies geen lymfevaten heeft. Voor het onderzoek werd het hoornvliesweefsel ontleed met het bindvlies en gefixeerd met 4% PFA, gevolgd door permeabilisatie en blokkering. Het weefsel werd vervolgens gekleurd met een primair antilichaam tegen de ...

Dit artikel presenteert een protocol voor oculaire microdissectie bij knaagdieren. Het proces omvat de enucleatie van de oogbol samen met het nictitating membraan (d.w.z. het derde ooglid). Dit wordt dan gevolgd door de scheiding van de achterste en voorste oogschelpen.

Microdissectie van het knaagdieroog

The ocular micro-dissection of the rodent eye involves the segmentation of the enucleated eyeball with the attached nictitating membrane, or third eyelid, ...

Oculair onderzoek in vroegere tijden was vooral gebaseerd op het oogweefsel van overleden personen. In de loop der jaren zijn er echter veel oogheelkundige knaagdiermodellen ontwikkeld en is de behoefte aan menselijk oogweefsel afgenomen. Vanwege de kleine omvang en het beperkte operatiegebied in het oog van het knaagdier, is de effectieve toegang tot de oculaire subonderdelen ernstig beperkt.Typisch, om het oog van een knaagdier te opereren, wordt het oog geïmmobiliseerd via de oogzenuw en wordt de dissectie uitgevoerd. Deze oefening is zwaar en kan het fragiele weefsel beschadigen omdat het bolvormige oog blijft bewegen tijdens de dissectie. Ondanks dat het nuttig is bij het isoleren van de verschillende secties van retinale lagen, kan deze techniek de ruimtelijke oriëntatie van het weefsel bij dissectie van het weefsel niet afbakenen.Verder is een gerichte interventie moeilijk te lokaliseren na dissectie vanwege de homogene cellulaire assemblage van de achterste en voorste oogcup. In deze video wordt een aangepaste chirurgische methode voor microdissectie gedemonstreerd. De aanwezigheid van het bijgevoegde nictitating membraan, of het derde ooglid, biedt unieke en significante v

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Een formele demonstratie van het ontleden van een muis oog, wat resulteert in een hele berg van het retinale pigment epitheel.

Ontleding van een muis Oog voor een hele berg van de retinaal pigment epitheel

De dissectie techniek illustreert enucleatie van de muis oog voor weefsel fixatie te fenotypering presteren in high-throughput-schermen.

Mouse Eye Enucleatie voor Remote High-throughput Fenotypering

Dit rapport beschrijft uitgebreide methoden voor de voorbereiding van bevroren muis Retina secties voor Immunohistochemistry (IHC).  Beschreven methoden omvatten dissectie van de oculaire posterior Cup, Paraformaldehyde fixatie, inbedding in optimale snij-temperatuur (OCT) media en weefsel oriëntatie, sectioneren en immunokleuring.

Voorbereiding van de muis netvlies Cryo-profielen voor Immunohistochemistry

Dit protocol presenteert twee technieken om de subcellulaire compartimenten van muizenstaaffotoreceptoren te isoleren voor eiwitanalyse. De eerste methode maakt gebruik van levend retinae en cellulosefilterpapier om de buitenste segmenten van de staaf te scheiden, terwijl de tweede gebruik maakt van gelyofiliseerd netvlies en plakband om de binnenste en buitenste segmentlagen van de staaf weg te pellen.

Twee peelingmethoden voor de isolatie van fotoreceptorcelcompartimenten in het netvlies van de muis voor eiwitanalyse

Het doel van dit protocol is het karakteriseren van een nieuw model van glaucoomneurodegeneratie op basis van 360° thermische cauterisatie van de limbale vasculaire plexus, die subacute oculaire hypertensie induceert.

Volledige cirkel Cauterisatie van limbale vasculaire plexus voor chirurgisch geïnduceerd glaucoom bij knaagdieren

Dit manuscript presenteert een protocol voor de histologische voorbereiding van dia's van oogbollen van knaagdieren. Met de voorgestelde methode kan het binnenste netvlies eenvoudig worden gevisualiseerd en beoordeeld onder een lichtmicroscoop. De procedure wordt gepresenteerd voor de oogbollen van muizen en ratten.

Voorbereiding en analyse van histologische objectglaasjes van de oogbollen van ratten en muizen om het netvlies te evalueren

Retinaal pigmentepitheel (RPE) fungeert als een cruciale barrière tussen het vaatvlies en het netvlies en bevordert de gezondheid en functie van retinale celtypen, zoals fotoreceptoren. Hierin beschrijven we een eenvoudig en effectief protocol voor het isoleren en kweken van RPE van volwassen muizen.

Een vereenvoudigde methode voor isolatie en kweek van retinale pigmentepitheelcellen van volwassen muizen

Dit protocol beschrijft de procedure voor het isoleren van het netvlies van de hele muis en het uitvoeren van immunokleuring om alle retinale ganglioncellen (RGC's) te labelen. Het proces wordt gevolgd door het in beeld brengen en automatisch tellen van RGC's met behulp van op AI gebaseerde software, waardoor een eenvoudige, snelle en nauwkeurige methode wordt geboden voor het kwantificeren van RGC's in het hele netvlies van de muis.

Immunokleuring en automatische telling van retinale ganglioncellen van muizen

Er wordt een protocol beschreven voor het voorbereiden van retinale cryosecties van muizen en het uitvoeren van immunokleuring op fotoreceptoren. Dit artikel stelt onderzoekers in staat om consequent bevroren secties van het netvlies van muizen te produceren met goed bewaarde morfologie en hoogwaardige immunokleuringsresultaten.

Cryosectie en immunokleuring van het netvlies van de muis

Het netvlies vertoont een complexe ruimtelijke organisatie over zijn laminaire structuur. Moderne ruimtelijke transcriptomics en sequencingtechnieken vereisen weefselcoupes &lt; 20 μm dik, waardoor hun toepasbaarheid voor retinaal onderzoek wordt beperkt. Deze vers ingevroren cryosectiemethode produceert dunne delen van het netvlies van de muis met behoud van vlakke ruimtelijke relaties, waardoor uitgebreide moleculaire kartering over laminae mogelijk is.

En gezicht Cryosectie van het netvlies van de muis voor hoogdimensionale ruimtelijke moleculaire analyse

Leer microdissectie van het knaagdieroog voor oculair onderzoek met behulp van een verfijnd protocol. Deze methode minimaliseert weefselschade en verbetert de isolatie van retinale lagen.

Microdissectie van het knaagdieroog

Meer video's verkennen