Kwantificeren van de antischimmelactiviteit van peptiden tegen Candida albicans

Peptiden worden bestudeerd als nieuwe antischimmelmoleculen. Dit protocol kan worden gebruikt om de antischimmelwerking tegen de menselijke schimmelpathogeen Candida albicans te bestuderen. Deze techniek biedt kwantitatieve gegevens over antischimmelactiviteit en vermindert de experimentele tijd en het plastic afval in vergelijking met de andere methoden die het maken op agar vereisen.

Naast het testen van de activiteit tegen Candida albicans, kan dit protocol worden gebruikt om de activiteit tegen andere gistvormende cellen te testen en om de activiteit van antischimmelmiddelen met kleine moleculen te testen Begin met het inenten van de gewenste Candida albicans-stam in 10 milliliter vloeibaar gistextract-pepton-dextrose, of YPD-medium, in een kweekbuis. Kweek de cultuur 's nachts op 30 graden Celsius en 230 tpm op een roterende schudder. Subcultuur is de nachtcultuur van C.albicans en groeit tot een optische dichtheid van ongeveer 1,0 tot 1,2 bij een golflengte van 600 nanometer.

Solubiliseer elk peptide in steriel water en verdun het tot tweemaal de gewenste hoogste concentratie, voeg vervolgens 40 microliter van de gewenste peptide-stamoplossingen toe aan de eerste put van elke rij in een plaat met ronde bodem van 96 putten. Voeg vervolgens 20 microliter steriel ultrazuiver water toe aan kolommen 2 tot 12 van de rijen met het peptide. Om de peptide-stamoplossingen serieel over de plaat te verdunnen tot kolom 10, brengt u 20 microliter over van kolom 1 naar kolom 2 en mengt u deze door op en neer te pipetteren.

Herhaal het verdunningsproces tot kolom 10, die 40 microliter peptideoplossing bevat bij een verdunning van 1 tot 512 van de kolom 1-concentratie. Als u klaar bent, verwijdert u 20 microliter peptideoplossing uit kolom 10 en gooit u deze weg. Breng de C.albicans-subcultuur over in een centrifugebuis van 15 milliliter en centrifugeer gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur op 3.900 g.

Verwijder het supernatant door pipetteren of decanteren. Resuspendeer de pellet met 1 milliliter 2-millimolaire natriumfosfaatbuffer en breng de suspensie over naar een centrifugebuis van 1,7 milliliter. Pellet de cellen door te centrifugeren en gooi het supernatant weg.

Nogmaals, resuspensie van de pellet in 1 milliliter 2-millimolaire natriumfosfaatbuffer en was nog 2 keer om de gewassen cellen in 1 milliliter natriumfosfaatbuffer te laten. Bepaal de celdichtheid van de gewassen celsuspensie en verdun de suspensie tot 5 maal 10 tot de 5e cel per milliliter in een 2-millimolaire natriumfosfaatbuffer. Neem verdunde C.albicans-celsuspensie en voeg 20 microliter toe aan de kolommen 1 tot en met 10 en kolom 12 van elke rij en voeg vervolgens 20 microliter 2-millimolaire natriumfosfaatbuffer toe aan kolom 11.

Dek plaat 1 af en plaats deze gedurende 30 minuten in een couveuse bij 30 graden Celsius. Bereid een nieuwe kweekplaat met 96 putten voor om de levensvatbaarheid te kwantificeren door 100 microliter YPD toe te voegen aan alle putten van plaatnummer 2 en voeg vervolgens 100 microliter 2-millimolaire natriumfosfaatbuffer toe aan alle putten van plaat 2. Om de monsters in plaat 1 te verdunnen, haalt u plaat 1 uit de incubator en voegt u 280 microliter 1-millimolaire natriumfosfaatbuffer toe in elke put.

Nadat u de inhoud goed hebt gemengd met een pipet, brengt u 8 microliter over van plaat 1 naar de overeenkomstige put van plaat 2. Als u klaar bent, plaatst u de afgedekte plaat 2 op een microtiterplaatschudder bij 350 tpm gedurende 17 uur bij 30 graden Celsius. Meng alle putjes in plaat 2 door op en neer te pipetteren, zodat alle cellen worden geresuspendeerd.

Verkrijg optische dichtheidsmetingen bij een golflengte van 600 nanometer voor elke put in plaat 2 met behulp van een absorptieplaatlezer. Plot de vermindering van de levensvatbaarheid als een functie van de peptideconcentratie om het groeiremmingspercentage te berekenen en om het effect van de peptiden op de groei van C.albicans te bepalen. Na het incuberen van de peptiden met de C.albicans-cellen, werd de antischimmelactiviteit gekwantificeerd met behulp van de kolonievormende eenheden of CFU-telmethode en het beschreven protocol met optische dichtheidsmetingen.

De gegevens met behulp van de optische dichtheidsmetingen waren zeer reproduceerbaar, zoals aangegeven door de kleine standaardafwijkingen van de replicaties. Bij het uitvoeren van dit protocol, handhaven de Candida albicans cellen in de gistvorm door de cellen te incuberen bij 30 graden Celsius, omdat optische dichtheidsmetingen niet betrouwbaar zijn in de hyphal-cellen. De efficiëntie van deze methode heeft onderzoekers in staat gesteld om hoge drievoudige studies uit te voeren naar peptideactiviteit door grotere aantallen peptiden en peptideconcentraties te testen.