Name: Het verouderende slakkenhuis in beeld brengen met light-sheet fluorescentiemicroscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-28T14:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: Leer lichtveldmicroscopie voor niet-destructieve 3D-beeldvorming van de cochlea bij muizen. Deze methode maakt kwantitatieve analyse van spiral ganglion neuronen mogelijk voor onderzoek naar gehoorverlies.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek is ondersteund door subsidies van het National Institute on Deafness and Other Communication Disorders van de National Institutes of Health, de Kellogg Foundation en particuliere donaties van Bridget Sperl en John McCormick. TSLIM is ontwikkeld met de uitstekende hulp van Matthias Hillenbrand, Kerstin John, Meike Lawin, Michel Layher, Tobias Schroeter, Peter Schacht, Oliver Dannberg en Julian Wuester van de Technische Universiteit van Illmenau, Duitsland, onder supervisie van hun mentoren (Stefan Sinzinger en Rene Theska) en James Leger.

Alle procedures en het gebruik van levende dieren zijn beoordeeld en goedgekeurd (Protocol ID # 2010-38573A) door de University of Minnesota Institutional Care and Use Committee (IACUC) en onderzoekers die deze dieren gebruiken, zijn grondig getraind en getest door de Research Animal Resources (RAR) Dierenartsen voordat ze toegang hebben tot de dierfaciliteiten. Zowel mannelijke als vrouwelijke muizen werden gebruikt in deze studie.
1. Cochlea-verwijdering voor fixatie en weefselverwerking voor beeldvorming
<ol><li>Euthanaseer een muis met behulp van CO 2-inhalatie. Onthoofd de muis met een schaar en maak een dorsaal-ventrale incisie door de hersenen om de schedel te hemisecten. Verwijder de hersenen, identificeer de ronde bulla in het baso-ventrale deel van de schedel, open de bulla met rongeurs en visualiseer en verwijder het slakkenhuis.</li>
	<li>Fixatie: Voer deze procedure uit onder een zuurkast en met behulp van een dissectiemicroscoop bij 5x vergroting. Draag handschoenen en beschermende kleding. Doorprik het ovale venster en verwijder de nietjes met een scherpe pik. Steek een plectrum in het ronde venster om het membraan te doorboren.</li>
	<li>Bedek het geopende ronde venster met de gesneden punt van een infusieset die is bevestigd aan een spuit van 1 ml gevuld met 2 ml formaline. Infundeer formaline langzaam door de perilymfatische ruimtes van het slakkenhuis gedurende een periode van 2 minuten, waarbij wordt opgemerkt dat formaline het slakkenhuis verlaat via het geopende ovale venster. Snijd overtollig weefsel van het slakkenhuis en dompel het onder in een fles met 10% formaline en plaats het een nacht op een rotator.</li>
	<li>Ontkalking: Spoel het slakkenhuis in PBS 3x gedurende 5 minuten elk en dompel onder in een fles met 10% oplossing van dinatriumethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) met rotatie gedurende 4 dagen, waarbij de oplossing dagelijks wordt vervangen.</li>
	<li>Uitdroging: Perfuseer het slakkenhuis met PBS 3x en dompel 15 minuten onder tussen de veranderingen. Droog het slakkenhuis uit met oplopende concentraties ethanol 10%, 50%, 70%, 95%, 95%, 100%, 100%; gedurende 30 minuten in elke concentratie. OPMERKING: Het is belangrijk om alle EDTA te verwijderen voordat het uitdroogt, omdat EDTA neerslaat in ethanol. Ook kan slakkenhuis 's nachts in elke concentratie ethanol van meer dan 70% worden achtergelaten.</li>
	<li>Kleuring: Bevlek het hele slakkenhuis door onderdompeling in een oplossing van Rhodamine B-isothiocynaat (5 μg / ml in 100% ethanol) 's nachts met rotatie. Verwijder overtollige kleurstof uit het slakkenhuis met twee veranderingen van 100% ethanol, 5 min elke verandering.</li>
	<li>Clearing: Breng het gekleurde slakkenhuis over in twee veranderingen van Spalteholz12-oplossing (5:3 methylsalicylaat:benzylbenzoaat), 30 minuten per verandering en laat een nacht in de clearingoplossing met rotatie. Cochleae kan voor onbepaalde tijd in Spalteholz-oplossing worden achtergelaten.</li>
</ol>2. Beeldvorming van slakkenhuis
<ol><li>Bevestig het slakkenhuis aan een monsterstaaf aan het ovale en ronde venstermembraanuiteinde, zodat de opruimoplossing in het slakkenhuis blijft en er geen bellen worden gevormd (figuur 2). Er moet voor worden gezorgd dat er geen bubbels in het slakkenhuis ontstaan, omdat ze moeilijk te verwijderen zijn en als ze in het weefsel worden achtergelaten, zullen ze beeldvormingsartefacten veroorzaken.</li>
	<li>Gebruik een UV-activerende lijm om het natte slakkenhuis aan de droge monsterstaaf te bevestigen (figuur 2). Bevestig het slakkenhuis aan de ovale en ronde vensteruiteinden. Harde de UV-lijm 10 s uit door met het UV-licht rond het slakkenhuis te bewegen. OPMERKING: Een losse bevestiging van het slakkenhuis aan de monsterstaaf zal resulteren in beeldvormingsdefecten. Deze staaf is speciaal vervaardigd voor dit protocol (zie Santi et al.8 voor details) en is specifiek voor onze light-sheet microscoop.</li>
	<li>Suspensie van het slakkenhuis in de beeldvormingskamer gevuld met Spalteholz oplossing voor beeldvorming. De monsterkamer is een optisch heldere kwartsfluorometercel (Video 1).</li>
	<li>Bevestig de monsterstang aan een roterende houder die ook aan de XZ-vertaaltrap is bevestigd. De meeste stapels worden verkregen door het specimen in de XZ-vlakken te vertalen, maar er kunnen ook rotatiestapels worden verkregen.</li>
	<li>TSLIM optische sectie: Gebruik een blauwe of groene laser voor excitatie, afhankelijk van het type fluorochroomkleuring. Plaats het lichtvel in het midden van het weefsel om scherp te stellen en bepaal de vergroting die zal worden gebruikt om de volledige breedte van het slakkenhuis te verlichten. Gebruik vervolgens een op maat ontworpen programma om het monster door het lichtvel over het monster te bewegen in de X-as (het beeld naaien) en in Z-stappen om een stapel 2D-afbeeldingen door het slakkenhuis te maken.</li>
	<li>Voor de eerste afbeelding wordt de balktaille van het lichtblad aan de rand van het monster geplaatst en scant het programma de volledige breedte van het monster en verzamelt het kolommen met gegevens (zie afbeeldingsstiksels; Santi et al.8) die de breedte van de confocale parameter (figuur 3) zijn om een samengesteld 2D-beeld met maximale resolutie over de breedte van het monster te produceren. Het programma automatiseert het naaien van afbeeldingen voor elke Z-stap totdat het monster volledig in beeld is gebracht.</li>
	<li>Beeldverwerking: breng de afbeeldingsstapel over naar een andere computer en laad deze in een 3D-renderingprogramma voor 3D-reconstructie en kwantificering.</li>
</ol>

<ol><li>Deafness and hearing loss. World Health Organization. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.who.int/news-room/fact-sheets/deafness-and-hearing-loss">https://www.who.int/news-room/fact-sheets/deafness-and-hearing-loss</a> (2021).</li>
<li>Vater, M., Kössl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+aspects+of+cochlear+functional+organization+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Comparative aspects of cochlear functional organization in mammals.</a> Hearing Research. 273 (1-2), 89-99 (2011).</li>
<li>Santi, P. A., Blair, A., Bohne, B. A., Lukkes, J., Nietfeld, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+digital+cytocochleogram%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">The digital cytocochleogram.</a> Hearing Research. 192 (1-2), 75-82 (2004).</li>
<li>Voie, A. H., Burns, D. H., Spelman, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthogonal-plane+fluorescence+optical+sectioning%3A+three-dimensional+imaging+of+macroscopic+biological+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens.</a> Journal of Microscopy. 170, 229-236 (1993).</li>
<li>Voie, A. H., Spelman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+the+cochlea+from+two-dimensional+images+of+optical+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Computerized+Medical+Imaging+and+Graphics%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of the cochlea from two-dimensional images of optical sections.</a> Computerized Medical Imaging and Graphics. 19 (5), 377-384 (1995).</li>
<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li>
<li>Santi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+fluorescence+microscopy%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Light sheet fluorescence microscopy: a review.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59 (2), 129-138 (2011).</li>
<li>Santi, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thin-sheet+laser+imaging+microscopy+for+optical+sectioning+of+thick+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Thin-sheet laser imaging microscopy for optical sectioning of thick tissues.</a> BioTechniques. 46 (4), 287-294 (2009).</li>
<li>Schröter, T. J., Johnson, S. B., John, K., Santi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+thin-sheet+laser+imaging+microscopy+%28sTSLIM%29+with+structured+illumination+and+HiLo+background+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Scanning thin-sheet laser imaging microscopy (sTSLIM) with structured illumination and HiLo background rejection.</a> Biomedical Optics Express. 3 (1), 170-177 (2012).</li>
<li>Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+zebrafish+early+embryonic+development+by+scanned+light+sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy.</a> Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).</li>
<li>Buytaert, J. A. N., Dirckx, J. J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+quantitative+resolution+measurements+of+an+optical+virtual+sectioning+three-dimensional+imaging+technique+for+biomedical+specimens%2C+featuring+two-micrometer+slicing+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Design and quantitative resolution measurements of an optical virtual sectioning three-dimensional imaging technique for biomedical specimens, featuring two-micrometer slicing resolution.</a> Journal of Biomedical Optics. 12 (1), 014039(2007).</li>
<li>Spalteholz, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSpalteholz%2C+W+%22On+making+human+and+animal+preparations+transparent%22">On making human and animal preparations transparent</a>. , S. Hierzel. Leipzig, Germany. (1914).</li>
<li>Johnson, S., Schmitz, H., Santi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TSLIM+imaging+and+a+morphometric+analysis+of+the+mouse+spiral+ganglion%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">TSLIM imaging and a morphometric analysis of the mouse spiral ganglion.</a> Hearing Research. 278 (1-2), 34-42 (2011).</li>
<li>Santi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+of+Corti+surface+preparations+for+computer-assisted+morphometry%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Organ of Corti surface preparations for computer-assisted morphometry.</a> Hearing Research. 24 (3), 179-187 (1986).</li>
<li>Brown, D., Pastras, C., Curthoys, I., Southwell, C., Van Roon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endolymph+movement+visualized+with+light+sheet+fluorescence+microscopy+in+an+acute+hydrops+model%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Endolymph movement visualized with light sheet fluorescence microscopy in an acute hydrops model.</a> Hearing Research. 339, 112-124 (2016).</li>
<li>White, J. A., Burgess, B. J., Hall, R. D., Nadol, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+of+degeneration+of+the+spiral+ganglion+cell+and+its+processes+in+the+C57BL%2F6J+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Pattern of degeneration of the spiral ganglion cell and its processes in the C57BL/6J mouse.</a> Hearing Research. 141 (1-2), 12-18 (2000).</li>
<li>Grierson, K. E., Hickman, T. T., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+and+cholinergic+innervation+in+the+mouse+cochlea+after+noise-induced+or+age-related+synaptopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic and cholinergic innervation in the mouse cochlea after noise-induced or age-related synaptopathy.</a> Hearing Research. 422, 108533(2022).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Optische doorsnede door lichtplaatmicroscopie voor onderzoek van cochleaire structuren is niet mechanisch destructief zoals andere meer traditionele histologische methoden, en het biedt een volledig digitaal beeld van cochleaire structuren ten opzichte van elkaar. Eerdere methoden zoals oppervlaktepreparaten van het orgaan van Corti14 leverden een kaart op van haarcelverlies langs de lengte van het basilaire membraan, maar SGN-verlies kon niet worden beoordeeld omdat het weefsel was ontleed om het...

Het slakkenhuis is het perifere sensorische orgaan voor het gehoor bij zoogdieren. Het heeft een complexe spiraalvormige anatomie van herhalende sensorische en ondersteunende cellen die anatomisch gespecialiseerd zijn om geluidstrillingen te detecteren en deze naar de hersenen door te geven voor de perceptie van het gehoor. De belangrijkste sensorische elementen zijn de binnenste en buitenste haarcellen en hun innervervende zenuwvezels waarvan de cellichamen het spiraalvormige ganglion vormen, dat zich in het kanaal van Rosenthal bevindt (figuur 1). Deze sensorische en neurale structuren zijn tonotopisch zo gerangschikt dat hoogfrequente geluiden worden getransduceerd in de cochleaire basis en laagfrequente geluiden worden getransduceerd in de cochlea apex2. Een anatomische kaart van deze sensorische celverdeling langs de spiraallengte van het ondersteunende basilaire membraan wordt een cytocochleogram3 genoemd en kan worden vergeleken met gehoorverlies als functie van de frequentie zoals afgebeeld in een audiogram.
Het vliezige labyrint van het slakkenhuis, dat is omgeven door dicht bot, maakt het technisch moeilijk om meer dan één cochleaire structuur tegelijk te onderzoeken. Daarom is de reden voor het ontwikkelen van een lichtplaatmicroscoop om goed uitgelijnde seriële secties van het volledige slakkenhuis te produceren, zodat alle cochleaire structuren ten opzichte van elkaar kunnen worden onderzocht in 3D-reconstructies. Voie et al.4 en Voie en Spelman5 ontwierpen de eerste lichtplaatmicroscoop, genaamd orthogonal plane fluorescence optical sectioning (OPFOS) microscoop, om het hele slakkenhuis optisch te snijden. Deze microscoop is echter nooit commercieel ontwikkeld; Ons doel was dus om een lichtplaatmicroscoop te construeren die een thin sheet laser imaging microscope (TSLIM; Figuur 2). De ontwerp- en constructiedetails voor TSLIM zijn eerder gepubliceerd8. TSLIM heeft verschillende verbeteringen aangebracht ten opzichte van de OPFOS, waaronder het gebruik van een digitale camera bij weinig licht versus een CCD-camera voor het verzamelen van afbeeldingen, optisch gecodeerde micropositioners voor nauwkeurige en reproduceerbare beweging van het monster door de lichtplaat, het gebruik van een in de handel verkrijgbare, optisch heldere monsterkamer en Rhodamine-kleuring in ethanol in plaats van in de opruimoplossing om vlekneerslag in het weefsel te voorkomen. Commerciële ontwikkeling van lichtplaatmicroscopen zoals SPIM6 hebben zich gericht op hoge-resolutie beeldvorming van levende, kleine transparante monsters, maar zijn niet geschikt voor hele cochleaire beeldvorming omdat ze onvoldoende werkafstand hebben. Een overzicht van de ontwikkeling van andere lichtplaatmicroscopen werd gepubliceerd door Santi7. Het belangrijkste voordeel van TSLIM ten opzichte van andere histologische methoden om het slakkenhuis te onderzoeken, is het optisch doorsneden van weefsels voor 3D-reconstructie met behoud van de integriteit van het monster, zodat het kan worden gebruikt door andere histologische methoden. Een ander voordeel van TSLIM-beeldvorming is dat alleen een dunne lichtplaat geproduceerd door een laser wordt blootgesteld aan het weefsel, vergeleken met blootstelling van hele weefseldikte aan de laser zoals bij confocale microscopie. Weefselverwijdering om lichtverstrooiing te minimaliseren en het feit dat slechts een klein deel van het weefsel aan de laser wordt blootgesteld, resulteert in minimale fluorochroomvervaging (fotobleaching) met light-sheet laserbeeldvorming. Het proces van fixatie, uitdroging en clearing verandert echter de morfologie van cochleaire structuren en resulteert in weefselkrimp in vergelijking met levend weefsel. De werkelijke hoeveelheid weefselkrimp die optreedt, is niet bepaald.
TSLIM is ontwikkeld door Shane Johnson en acht Duitse studenten optische techniek (zie Dankbetuigingen). TSLIM constructiedetails werden verstrekt door Santi et al.8 en een scanversie (sTSLIM) door Schröter et al.9. TSLIM functioneert als een niet-destructief microtoom om specimens optisch te snijden en als een microscoop om 2D-seriële secties te verzamelen over de volledige breedte en dikte van het slakkenhuis. TSLIM kan zowel kleine (mm) als grote (cm), dikke exemplaren in beeld brengen. Lenzen zijn in de lucht gemonteerd om lange werkafstanden mogelijk te maken met verzamelobjectieven van 1x en 2x op een dissectiemicroscoop. De dissectiemicroscoop heeft ook zoomoptiek waarmee TSLIM subcellulaire en synaptische structuren op cellen kan oplossen. TSLIM is uitgerust met zowel een blauwe (473 nm) als groene (532 nm) laser voor verlichting waarmee een verscheidenheid aan fluorescerende sondes kan worden gebruikt voor beeldvorming. Het doel van TSLIM is om goed uitgelijnde 2D optische secties te produceren door een heel slakkenhuis voor een volledige digitale reconstructie van cochleaire weefsels. Omdat het een fluorescerende methode is, kunnen liganden en immunohistochemie ook worden gebruikt om specifieke cochleaire structuren te identificeren.
Aanvankelijk werd een cilindrische lens gebruikt om twee tegengestelde Gaussische lichtplaten te produceren, maar het produceerde absorptiebeeldartefacten. Door het werk van Keller et al.10 werd de vaste cilindrische lens vervangen door een scanning galvanometer spiegel om het lichtblad9 te produceren. Aangezien het midden van het lichtblad het dunst is bij de taille van de bundel, worden sTSLIM 2D-beelden bovendien geproduceerd door een samenstelling van X-as kolommen met gegevens over de breedte van het monster te verzamelen (figuur 3). Deze methode werd voor het eerst beschreven door Buytaert en Dircks11. TSLIM aangepaste software voor het aansturen en verzamelen van beelden is ontwikkeld met behulp van een grafisch programma voor instrumentbesturing. Het lichtblad reist door het monster en verlicht een fluorescerend vlak in het weefsel. Dit fluorescerende vlak wordt orthogonaal door het transparante monster geprojecteerd en wordt verzameld door een dissectiemicroscoop. Optisch gecodeerde micropositioners maken het mogelijk om door de straaltaille in de X-as te scannen om een enkel samengesteld 2D-beeld te verzamelen en vervolgens verplaatst de Z-as micropositioner het monster naar een dieper vlak in het weefsel om een stapel seriële, doorsnedede 2D-beelden te verkrijgen (Video 1, Figuur 4). Een stapel translationele afbeeldingen wordt verzameld over de gehele breedte, dikte en lengte van het slakkenhuis en het naaien van afbeeldingen is niet vereist (video 2). De afbeeldingsstapel wordt overgebracht naar een andere computer en geladen in een 3D-renderingprogramma voor 3D-reconstructie en kwantificering. De beeldstapels bevatten alle digitale informatie over de morfologie van een slakkenhuis bij de resolutie van de microscoop. Als echter een hogere resolutie vereist is, kan het intacte slakkenhuis verder worden verwerkt door destructieve histologische methoden zoals microtoomsectie, scannen en transmissie-elektronenmicroscopie.
Het 3D-renderingprogramma wordt gebruikt om verschillende cochleaire structuren te segmenteren voor 3D-rendering en kwantitatieve analyse. Voor segmentatie wordt elke structuur in elke 2D-afbeelding van de stapel met een andere kleur overgetrokken door een grafisch tablet en pen (afbeelding 5). Tot op heden zijn 20 verschillende cochleaire structuren gesegmenteerd (figuur 6). Na segmentatie kunnen verschillende 3D-analyses worden uitgevoerd. 3D-renderingsoftware kan bijvoorbeeld het slakkenhuis virtueel resectieren in elk vlak langs het centrum van de structuur. Video 3 toont secties die raken aan het orgaan van Corti, waardoor de haarcellen over de lengte van het basilaire membraan worden onthuld. Dit proces vereist eerst handmatige segmentatie van de structuur van belang. Vervolgens wordt de centroïde van de structuur berekend op basis van de kleinste vierkanten die passen bij splinepunten die langs het midden van de structuur van de basis tot de top zijn geplaatst, waardoor een benadering van de lengte van de structuur mogelijk is (Video 4). Een soortgelijk proces genaamd skeletonisatie kan worden gebruikt om de radiale breedte van de structuur over de lengte te visualiseren met behulp van een kleurenkaart (Video 4). Het totale volume van elke structuur wordt na segmentatie door het programma berekend, maar relatieve afstanden kunnen ook worden gekwantificeerd en gevisualiseerd met kleurenkaarten in een 3D-renderingsoftware (figuur 7). Gesegmenteerde structuren kunnen ook worden geëxporteerd om vergrote, massief-plastic modelweergaven te produceren (figuur 8). Daarnaast kan semi-geautomatiseerde celtelling ook worden uitgevoerd met behulp van 3D-renderingsoftware (figuur 9). Immunohistochemie en ligandbinding kunnen worden gebruikt om specifieke cochleaire structuren te kleuren en deze structuren kunnen worden geïsoleerd van andere cochleaire structuren voor morfometrische beoordeling, zoals het produceren van een cytocochleogram (figuur 10). Lengte, breedte, oppervlak, volume en aantal van alle cochleaire structuren kunnen worden bepaald uit de 3D-modellen, waardoor deze aanpak ideaal is voor het in kaart brengen van cochleaire schade aan functionele beperkingen. In het bijzonder kan cochleaire schade als gevolg van veroudering, door lawaai veroorzaakt trauma of andere beledigingen worden getoond en gekwantificeerd in 3D-cochleaire reconstructies van 2D-optische secties. Zodra een slakkenhuis is gedigitaliseerd, zijn er tal van beeldvormingsalgoritmen die kunnen worden gebruikt om cochleaire schade van elk weefsel in het slakkenhuis in het anatomische register aan andere cochleaire weefsels te beoordelen.

<table><tbody><tr><td>Amira 3D Rendering Software</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>Adres: 501 90th Ave NW, Coon Rapids, MN 55433</td></tr><tr><td>benzyl benzoate (W213810)</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. </td><td></td><td>Adres: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178</td></tr><tr><td>Bondic </td><td>Bondic </td><td></td><td>Adres: 235 Industrial Parkway S., Unit 18 Aurora, ON L4G 3V5 Canada</td></tr><tr><td>Ethanol 95% en 100% </td><td>University of Minnesota</td><td></td><td>Adres: General Storehouse, Minneapolis, MN 55455</td></tr><tr><td>Ethyleendiaminetetraazijnzuur dinatriumzout dihydraat (EDTA)  (E5134)</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. </td><td></td><td>Adres: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178</td></tr><tr><td>LabVIEW grafisch programma en Vision</td><td>National Instruments</td><td></td><td>Adres: 11500 N Mopac Expwy Austin, TX 78759-3504</td></tr><tr><td>methyl salicylaat (M6742)</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. </td><td></td><td>Adres: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178</td></tr><tr><td>Olympus MVX10 dissectiemicroscoop</td><td>Olympus Corp</td><td></td><td>Adres: 3500 Corporate Parkway, Center Valley, PA 18034</td></tr><tr><td>Rhodamine B isothiocyanate, (283924) </td><td>Sigma-Aldrich, Inc. </td><td></td><td>Adres: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178</td></tr><tr><td>Starna Fluorometer Cell (3-G-20)</td><td>Starna Cells</td><td></td><td>Adres: PO Box 1919, Atascadero, CA 82423</td></tr></tbody></table>

het verouderende slakkenhuis in beeld brengen met light-sheet fluorescentiemicroscopie

Imaging the Aging Cochlea with Light-Sheet Fluorescence Microscopy

Doofheid is de meest voorkomende zintuiglijke beperking en treft ongeveer 5% of 430 miljoen mensen wereldwijd volgens de Wereldgezondheidsorganisatie1. Veroudering of presbycusis is een primaire oorzaak van perceptief gehoorverlies en wordt gekenmerkt door schade aan haarcellen, spiraalvormige ganglionneuronen (SGN's) en de stria vascularis. Deze structuren bevinden zich in het slakkenhuis, dat een complexe, spiraalvormige anatomie heeft van vliezige weefsels die in vloeistof zijn gesuspendeerd en omgeven door bot. Deze eigenschappen maken het technisch moeilijk om histopathologische veranderingen te onderzoeken en te kwantificeren. Om aan deze behoefte te voldoen, ontwikkelden we een lichtplaatmicroscoop (TSLIM) die het hele slakkenhuis in beeld kan brengen en digitaliseren om de studie van structuur-functierelaties in het binnenoor te vergemakkelijken. Goed uitgelijnde seriële secties van het hele slakkenhuis resulteren in een stapel afbeeldingen voor driedimensionale (3D) volumeweergave en segmentatie van individuele structuren voor 3D-visualisatie en kwantitatieve analyse (d.w.z. lengte, breedte, oppervlak, volume en aantal). Cochleae vereisen minimale verwerkingsstappen (fixatie, ontkalking, uitdroging, kleuring en optische clearing), die allemaal compatibel zijn met daaropvolgende beeldvorming met hoge resolutie door scanning en transmissie-elektronenmicroscopie. Omdat alle weefsels in de stapels aanwezig zijn, kan elke structuur afzonderlijk of ten opzichte van andere structuren worden beoordeeld. Omdat beeldvorming fluorescerende sondes gebruikt, kunnen immunohistochemie en ligandbinding bovendien worden gebruikt om specifieke structuren en hun 3D-volume of -verdeling binnen het slakkenhuis te identificeren. Hier gebruikten we TSLIM om slakkenhuizen van oude muizen te onderzoeken om het verlies van haarcellen en spiraalvormige ganglionneuronen te kwantificeren. Daarnaast werden geavanceerde analyses (bijv. clusteranalyse) gebruikt om lokale reducties van spiraalvormige ganglionneuronen in het kanaal van Rosenthal langs het 3D-volume te visualiseren. Deze benaderingen tonen het vermogen van TSLIM microscopie aan om structuur-functierelaties binnen en tussen slakkenhuizen te kwantificeren.

Omdat het thema van dit speciale nummer het in beeld brengen van de effecten van veroudering in het slakkenhuis is, zal een jong (3 maanden oud, HS2479, CBA-stammuis) en oud (23 maanden oud, HS2521, C57-stammuis) slakkenhuis als voorbeeld worden gebruikt. Opgemerkt moet worden dat TSLIM in staat is om een verscheidenheid aan exemplaren af te beelden, waaronder slakkenhuizen van mensen, zoogdieren, andere knaagdieren en vissen, evenals andere organen zoals de hersenen.
Johnson et al. <sup class...

Er werd een lichtplaatmicroscoop ontwikkeld om het hele slakkenhuis in beeld te brengen en te digitaliseren.

Het verouderende slakkenhuis in beeld brengen met light-sheet fluorescentiemicroscopie

Deafness is the most common sensory impairment, affecting approximately 5% or 430 million people worldwide as per the World Health Organization1. Aging or ...

We hebben een lichtplaatmicroscoop ontwikkeld die het hele slakkenhuis kan digitaliseren. Deze microscoop heeft op lucht gemonteerde objectieven met een lange werkafstand die kleine muizenslakkenhuizen tot een groot menselijk temporale bot kunnen afbeelden. Het snijdt het slakkenhuis serieel met een laserstraal zonder mechanische vernietiging te veroorzaken.Onze beeldvormingsmethode kan worden gebruikt om pathologische veranderingen in het slakkenhuis te beoordelen, zoals het verlies van haarcellen en spiraalvormige ganglionneuronen als gevolg van veroudering. Na het euthanaseren en onthoofden van een muis, maak je een dorsale-ventrale incisie door de hersenen om de schedel te hemisecteren. Verwijder de hersenen en identificeer de ronde bulla in het basoventrale deel van de schedel.Open de bulla met rongeurs. Visualiseer en verwijder vervolgens het slakkenhuis. Onder een dissectiemicroscoop bij vijf keer vergroting, doorboort u het ovale venster en verwijdert u de nietjes met een scherpe pik.Steek vervolgens een plectrum in het ronde venster om het membraan te doorboren. Om fixatie uit te voeren, bedek het geopende ronde venster met de gesneden punt van een infusieset die is bevestigd aan een spuit van één milliliter gevuld met twee milliliter formaline. Infundeer formaline langzaam door de perilymfatische ruimtes van een slakkenhuis gedurende een periode van twee minuten, en zorg ervoor dat formaline het slakkenhuis verlaat via het geopende ovale venster.Snijd overtollig weefsel van het slakkenhuis. Dompel het onder in een fles met 10% formaline en plaats het een nacht op een rotator. Voor ontkalking, spoel het slakkenhuis in PBS driemaal gedurende vijf minuten elk.Dompel onder in een fles met 10% oplossing van EDTA. Incubeer het gedurende vier dagen met rotatie en verander de oplossing dagelijks. Perfuseer vervolgens het slakkenhuis driemaal met PBS en dompel gedurende 15 minuten onder tussen de veranderingen om alle EDTA te verwijderen.Droog na het wassen het slakkenhuis uit met oplopende concentraties ethanol gedurende 30 minuten in elke concentratie. Bevlek het hele slakkenhuis door onderdompeling in rhodamine B-oplossing gedurende een nacht met rotatie. Verwijder overtollige kleurstof uit het slakkenhuis met twee veranderingen van 100% ethanol met incubatie gedurende vijf minuten voor elke verandering.Breng het gekleurde slakkenhuis over in twee verversingen van Spalteholz-oplossing gedurende 30 minuten bij elke verandering. Laat een nacht in de opruimoplossing met rotatie. Bevestig het slakkenhuis aan een monsterstaaf aan het ovale en ronde raammembraanuiteinde.Zorg ervoor dat de opruimoplossing in het slakkenhuis blijft en dat er geen bubbels worden gevormd. Bevestig de ovale en ronde vensteruiteinden van het natte slakkenhuis met UV-activerende lijm aan de droge monsterstaaf. Laat de UV-lijm 10 seconden uitharden door met een UV-licht rond het slakkenhuis te bewegen.Suspensie het slakkenhuis in de beeldvormingskamer in een optisch heldere kwartsfluorometercel gevuld met Spalteholz-oplossing met de monsterstaaf bevestigd aan een roterende houder die ook is bevestigd aan de X/Z-translatiefase. Gebruik vervolgens een speciaal ontworpen programma om het monster door het lichtblad in de X-as en Z-stappen te verplaatsen en maak een stapel 2D-afbeeldingen door het slakkenhuis. Als u de afbeelding wilt verwerken, brengt u de afbeeldingsstapel over naar een andere computer en laadt u deze in een 3D-renderingprogramma voor 3D-reconstructie en kwantificering.Directe volumeweergave van een muizenslakkenhuis toonde de ovale en ronde vensters, orgaan van Corti met haarcellen, Rosenthal's kanaal was gesegmenteerd en volume gerenderd, en toonde spiraalvormige ganglionneuronen, of SGN's, over de lengte. Met behulp van TSLIM werden het slakkenhuis van een drie maanden oude jonge muis en een 23 maanden oude muis in beeld gebracht en geteld voor SGN's. SGN-celtellingen als functie van Rosenthal's kanaalafstand afgebeeld in een lineaire plot toonden grotere SGN's bij het jongere dier in het midden en apicale uiteinden van het slakkenhuis in vergelijking met het oudere dier.Dit schijnbare verlies van SGN's werd gevisualiseerd met behulp van clusteranalyse en 3D-renderingsoftware. SGN-dichtheidsverschillen werden weergegeven op een kleurenschaal waarbij clusters met hoge dichtheid geel zijn en blauw regio's met een lagere dichtheid vertegenwoordigt. De clusteranalyse toonde duidelijk de gebieden met een lagere celdichtheid langs de lengte van het kanaal van Rosenthal.Light-sheet microscopie is ontworpen om een goed uitgelijnde stapel afbeeldingen te produceren waaruit 3D-volumeweergaven van structuren kunnen worden geproduceerd. 3D-renderingprogramma's maken de kwantitatieve beoordeling van structuren en anatomische relaties tussen verschillende structuren mogelijk. Omdat 3D-renderingprogramma's echter veel verschillende gebruikersparameters bieden, is er een aanzienlijke leercurve om deze programma's effectief te gebruiken.

imaging-the-aging-cochlea-with-light-sheet-fluorescence-microscopy

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Live beeldvorming van de embryonale zoogdieren slakkenhuis is uitdagend omdat de ontwikkelingsprocessen bij de hand werken op een tijdelijke helling van meer dan tien dagen. Hier presenteren we een methode voor het kweken en dan het afbeelden embryonale cochleair explant weefsel afkomstig van een fluorescerende reporter muis over vijf dagen.

Langdurige Time Lapse Imaging van Muis Cochlear Explantaten

Primaire cilia beïnvloeden verschillende signaalroutes. De cochlea van zoogdieren is ideaal voor het onderzoeken van planaire celpolariteit (PCP) signalering. Cilia-disfunctie beïnvloedt cochleaire uitgroei, cellulaire patterning en oriëntatie van haarcellen, uitlezingen van PCP. Ons doel is om PCP-signalering in muis cochlea te analyseren via fenotypische analyse, immunohistologie en rasterelektronenmicroscopie.

Evaluatie van Planar-Cell-Polariteit Phenotypes in ciliopathie Mouse Mutant Cochlea

We presenteren een methode om de volwassen orgaan van Corti isoleren drie intacte cochleaire windingen (apex, midden en base). We tonen ook een procedure voor immunokleuring met fluorescent gelabelde antilichamen. Samen technieken maken het bestuderen van haarcellen, steuncellen en andere celtypen in de cochlea.

Hele Mount Dissection en Immunofluorescentie van de Adult Mouse Cochlea

Hier beschrijven we een protocol voor het visualiseren van motor neuron projectie en axon arborization in transgene Hb9::GFP muis embryo's. Na immunokleuring voor motorische neuronen, we gebruikten licht blad fluorescentie microscopie op afbeelding embryo's voor verdere kwantitatieve analyse. Dit protocol is van toepassing op andere neuron navigatie processen in het centrale zenuwstelsel.

Visualisatie van Motor Axon navigatie en kwantificering van Axon Arborization In muis embryo's met behulp van licht blad fluorescentie microscopie

De zebravis is een modelsysteem dat heeft veel waardevolle eigenschappen met inbegrip van optische helderheid, snelle externe ontwikkeling, en, met name van belang op het gebied van gehoor en evenwicht extern gelegen zintuiglijke haarcellen. Dit artikel schetst hoe transgene zebrafish kan worden gebruikt voor de gehaltebepaling van zowel de Haarcel mechanosensation en de presynaptische functie in toto.

In Vivo Calcium beeldvorming van dwarslijn haarcellen in larvale zebravis

Dit manuscript beschrijft een experimenteel protocol voor het evalueren van de morfologische kenmerken en functionele status van het lint synapsen in normale muizen. Het huidige model is ook geschikt voor door lawaai geïnduceerde en leeftijdsgebonden cochlear synaptopathy-beperkte modellen. De correlatieve resultaten van eerdere muizen studies worden ook besproken.

Morfologische en functionele evaluatie van het lint synapsen op specifieke frequentiegebieden van de muis cochlea

Hier presenteren we een methode voor het visualiseren van de opname van 3 kDa Texas Red-gelabelde dextran in auditieve haarcellen met functionele mechanotransductiekanalen. Daarnaast kan dextrans van 3-10 kDa worden gebruikt om endocytose in haar en ondersteunende cellen van het orgaan van Corti te bestuderen.

Dextran Labeling and Uptake in Live and Functional Murine Cochlear Hair Cells

Hier presenteren we een protocol voor de Hopping Probe Ion Conductance Microscopy (HPICM), een contactloze scanning probe-techniek die beeldvorming op nanoschaal van stereocilia-bundels in levende auditieve haarcellen mogelijk maakt.

Stereocilia bundel beeldvorming met nanoschaalresolutie in levende auditieve haarcellen van zoogdieren

Een protocol voor het verwerken van jongvolwassen en oud gerbil slakkenhuis door immunolabeling van de afferente synaptische structuren en haarcellen, het blussen van autofluorescentie in verouderd weefsel, het ontleden en schatten van de lengte van het slakkenhuis en het kwantificeren van de synapsen in beeldstapels verkregen met confocale beeldvorming wordt gepresenteerd.

Immunolabeling en counting ribbon synapsen bij jongvolwassen en oude Gerbil Cochleae

Het kuiken is een kosteneffectief, toegankelijk en algemeen beschikbaar modelorganisme voor verschillende onderzoeken. Hier wordt een reeks protocollen beschreven om de moleculaire mechanismen te begrijpen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling en regeneratie van het aviaire binnenoor.

In Ovo en Ex Ovo methoden om aviaire binnenoorontwikkeling te bestuderen

Hier presenteren we een protocol voor een muismodel van lawaai-geïnduceerd gehoorverlies (NIHL). Om NIHL te induceren, ontwikkelden we een nieuw en eenvoudig apparaat met golfkarton, een rattenvangkooi en een luidspreker. Auditieve hersenstamrespons en immunofluorescentie beeldvorming werden gebruikt om respectievelijk de gehoorfunctie en de buitenste haarcelbeschadiging te beoordelen.

Gewijzigde experimentele omstandigheden voor lawaai-geïnduceerd gehoorverlies bij muizen en beoordeling van de gehoorfunctie en schade aan de buitenste haarcellen

Leer lichtveldmicroscopie voor niet-destructieve 3D-beeldvorming van de cochlea bij muizen. Deze methode maakt kwantitatieve analyse van spiral ganglion neuronen mogelijk voor onderzoek naar gehoorverlies.

Het verouderende slakkenhuis in beeld brengen met light-sheet fluorescentiemicroscopie

Meer video's verkennen