Het verouderende slakkenhuis in beeld brengen met light-sheet fluorescentiemicroscopie

We hebben een lichtplaatmicroscoop ontwikkeld die het hele slakkenhuis kan digitaliseren. Deze microscoop heeft op lucht gemonteerde objectieven met een lange werkafstand die kleine muizenslakkenhuizen tot een groot menselijk temporale bot kunnen afbeelden. Het snijdt het slakkenhuis serieel met een laserstraal zonder mechanische vernietiging te veroorzaken.

Onze beeldvormingsmethode kan worden gebruikt om pathologische veranderingen in het slakkenhuis te beoordelen, zoals het verlies van haarcellen en spiraalvormige ganglionneuronen als gevolg van veroudering. Na het euthanaseren en onthoofden van een muis, maak je een dorsale-ventrale incisie door de hersenen om de schedel te hemisecteren. Verwijder de hersenen en identificeer de ronde bulla in het basoventrale deel van de schedel.

Open de bulla met rongeurs. Visualiseer en verwijder vervolgens het slakkenhuis. Onder een dissectiemicroscoop bij vijf keer vergroting, doorboort u het ovale venster en verwijdert u de nietjes met een scherpe pik.

Steek vervolgens een plectrum in het ronde venster om het membraan te doorboren. Om fixatie uit te voeren, bedek het geopende ronde venster met de gesneden punt van een infusieset die is bevestigd aan een spuit van één milliliter gevuld met twee milliliter formaline. Infundeer formaline langzaam door de perilymfatische ruimtes van een slakkenhuis gedurende een periode van twee minuten, en zorg ervoor dat formaline het slakkenhuis verlaat via het geopende ovale venster.

Snijd overtollig weefsel van het slakkenhuis. Dompel het onder in een fles met 10% formaline en plaats het een nacht op een rotator. Voor ontkalking, spoel het slakkenhuis in PBS driemaal gedurende vijf minuten elk.

Dompel onder in een fles met 10% oplossing van EDTA. Incubeer het gedurende vier dagen met rotatie en verander de oplossing dagelijks. Perfuseer vervolgens het slakkenhuis driemaal met PBS en dompel gedurende 15 minuten onder tussen de veranderingen om alle EDTA te verwijderen.

Droog na het wassen het slakkenhuis uit met oplopende concentraties ethanol gedurende 30 minuten in elke concentratie. Bevlek het hele slakkenhuis door onderdompeling in rhodamine B-oplossing gedurende een nacht met rotatie. Verwijder overtollige kleurstof uit het slakkenhuis met twee veranderingen van 100% ethanol met incubatie gedurende vijf minuten voor elke verandering.

Breng het gekleurde slakkenhuis over in twee verversingen van Spalteholz-oplossing gedurende 30 minuten bij elke verandering. Laat een nacht in de opruimoplossing met rotatie. Bevestig het slakkenhuis aan een monsterstaaf aan het ovale en ronde raammembraanuiteinde.

Zorg ervoor dat de opruimoplossing in het slakkenhuis blijft en dat er geen bubbels worden gevormd. Bevestig de ovale en ronde vensteruiteinden van het natte slakkenhuis met UV-activerende lijm aan de droge monsterstaaf. Laat de UV-lijm 10 seconden uitharden door met een UV-licht rond het slakkenhuis te bewegen.

Suspensie het slakkenhuis in de beeldvormingskamer in een optisch heldere kwartsfluorometercel gevuld met Spalteholz-oplossing met de monsterstaaf bevestigd aan een roterende houder die ook is bevestigd aan de X/Z-translatiefase. Gebruik vervolgens een speciaal ontworpen programma om het monster door het lichtblad in de X-as en Z-stappen te verplaatsen en maak een stapel 2D-afbeeldingen door het slakkenhuis. Als u de afbeelding wilt verwerken, brengt u de afbeeldingsstapel over naar een andere computer en laadt u deze in een 3D-renderingprogramma voor 3D-reconstructie en kwantificering.

Directe volumeweergave van een muizenslakkenhuis toonde de ovale en ronde vensters, orgaan van Corti met haarcellen, Rosenthal's kanaal was gesegmenteerd en volume gerenderd, en toonde spiraalvormige ganglionneuronen, of SGN's, over de lengte. Met behulp van TSLIM werden het slakkenhuis van een drie maanden oude jonge muis en een 23 maanden oude muis in beeld gebracht en geteld voor SGN's. SGN-celtellingen als functie van Rosenthal's kanaalafstand afgebeeld in een lineaire plot toonden grotere SGN's bij het jongere dier in het midden en apicale uiteinden van het slakkenhuis in vergelijking met het oudere dier.

Dit schijnbare verlies van SGN's werd gevisualiseerd met behulp van clusteranalyse en 3D-renderingsoftware. SGN-dichtheidsverschillen werden weergegeven op een kleurenschaal waarbij clusters met hoge dichtheid geel zijn en blauw regio's met een lagere dichtheid vertegenwoordigt. De clusteranalyse toonde duidelijk de gebieden met een lagere celdichtheid langs de lengte van het kanaal van Rosenthal.

Light-sheet microscopie is ontworpen om een goed uitgelijnde stapel afbeeldingen te produceren waaruit 3D-volumeweergaven van structuren kunnen worden geproduceerd. 3D-renderingprogramma's maken de kwantitatieve beoordeling van structuren en anatomische relaties tussen verschillende structuren mogelijk. Omdat 3D-renderingprogramma's echter veel verschillende gebruikersparameters bieden, is er een aanzienlijke leercurve om deze programma's effectief te gebruiken.