Name: Isolatie van kleine preantrale follikels uit de runder eierstok met behulp van een combinatie van fragmentatie, homogenisatie en seriële filtratie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Leer een efficiënte methode voor de isolatie van kleine preantrale follikels uit runder eierstokken met behulp van fragmentatie, homogenisatie en seriële filtratie. Deze techniek ondersteunt onderzoek naar follikelontwikkeling en vruchtbaarheidsbehoud.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit project werd gedeeltelijk gefinancierd door USDA Multi-state project W4112 en UC Davis Jastro Shields award aan SM.
De auteurs willen hun waardering uitspreken voor Central Valley Meat, Inc. voor het leveren van de rundervliegen die in alle experimenten worden gebruikt. De auteurs bedanken ook Olivia Silvera voor hulp bij eierstokverwerking en follikelisolatie.

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het huidige protocol beschrijft een reproduceerbare methode om preantrale follikels in een vroeg stadium, met name in primaire en vroege secundaire stadia, uit de runderkolvisus te halen. Dit protocol bouwt voort op eerdere rapporten 20,25,30,34,35,36 en biedt optimalisaties die resulteren in de isolatie van een betekenisvol aantal follikels uit een individuele eierstok.<sup class="x...

Ovariële follikels zijn de functionele eenheden van de eierstok, verantwoordelijk voor de productie van het gameat (eicel) en hormonen die cruciaal zijn voor de voortplantingsfunctie en de algehele gezondheid. Primordiale follikels vormen zich in de eierstok tijdens de foetale ontwikkeling of in de neonatale periode, afhankelijk van de soort1, en ze vormen het ovariële reservaat van een vrouw. Folliculaire groei begint met de activering van primordiale follikels die de rustpool verlaten en de groeifase ingaan. Preantrale folliculogenese, die alle follikelstadia vóór de ontwikkeling van het antrum omvat, is een zeer dynamisch proces dat synchrone morfologische en metabole veranderingen in de eicel en de omliggende granulosacellen vereist, aangedreven door nauwe communicatie tussen deze twee celtypen 2,3. Preantrale follikels vormen de meerderheid van de folliculaire eenheden die op een bepaald moment in de eierstok worden aangetroffen4. De ontwikkeling door de preantrale stadia van folliculogenese wordt geschat op enkele weken langer dan antrale ontwikkeling 5,6, en deze tijd is nodig voor de eicel en somatische cellen om voldoende volwassenheid te verwerven om de laatste fase van ontwikkeling (d.w.z. het antrale stadium) in te gaan en zich voor te bereiden op ovulatie, bevruchting en embryonale ontwikkeling 7,8,9.
Veel van de huidige kennis over ovariële preantrale folliculogenese komt van muismodellen 10,11,12,13, deels vanwege het gemak bij het herstellen van een groot aantal van deze follikels uit een kleinere en minder vezelige eierstok. Hoewel meldingen van isolatie van grote aantallen preantrale follikels uit runderbieuze eierstokken ongeveer 30 jaar oud zijn14, is een vollediger begrip van de processen die de ontwikkeling van deze follikels in een vroeg stadium reguleren, niet gerealiseerd, grotendeels vanwege het gebrek aan geoptimaliseerde, efficiënte en herhaalbare methoden om voldoende aantallen levensvatbare preantrale follikels op te halen, vooral in vroege stadia van ontwikkeling. Met de toenemende belangstelling voor het behoud van de ovariële reserve voor toekomstig gebruik bij geassisteerde voortplanting bij mensen, worden koeien een aantrekkelijk model vanwege hun meer vergelijkbare ovariële structuur15. De runderkolvis is echter aanzienlijk rijker aan collageen in vergelijking met de eierstok van de muis16, waardoor mechanische isolatie met behulp van methoden die voor de muis zijn beschreven, zeer inefficiënt is. Inspanningen om vruchtbaarheidsbehoudstechnieken uit te breiden omvatten volledige in vitro groei van preantrale follikels tot het antrale stadium, gevolgd door in vitro rijping (IVM) van de ingesloten eicellen, in vitro fertilisatie (IVF) en embryoproductie en -overdracht17. Tot nu toe is dit hele proces alleen bereikt bij muizen18. Bij runderen is de vooruitgang in de richting van follikelgroei in vitro beperkt tot enkele rapporten met variabele follikelstadia aan het begin van de kweek, evenals variabele lengte van de cultuur tussen protocollen17,19.
De in de literatuur beschreven methoden voor de oogst van preantrale follikels uit de runderkolvis hebben meestal mechanische en enzymatische technieken gebruikt, geïsoleerd of in combinatie 2,14,17,20. Het eerste rapport van een protocol voor runderpreantrale follikelisolatie gebruikte een weefselhomogenisator en seriële filtratie om hele eierstokken te verwerken20. Deze studie werd gevolgd door rapporten die mechanische en enzymatische procedures combineerden die collagenase14 gebruikten. Een terugkerend thema bij het gebruik van collagenase om het eierstokweefsel te verteren, is het potentiële risico op schade aan het folliculaire keldermembraan, wat de levensvatbaarheid van de follikel in gevaar kan brengen 14,21,22,23. Daarom zijn verschillende combinaties van mechanische methoden gebruikt, zoals het gebruik van een weefselhakselaar en herhaald pipetteren of een weefselhakselaar gecombineerd met homogenisatie 20,24,25,26. Een andere mechanische techniek die is beschreven, maakt gebruik van naalden om preantrale follikels rechtstreeks uit het eierstokweefsel te ontleden, wat vooral handig is voor het isoleren van grotere (> 200 μm) secundaire follikels. Dit proces is echter tijdrovend, inefficiënt voor het isoleren van kleinere preantrale follikels en is afhankelijk van vaardigheden wanneer het wordt geprobeerd in runderbieuze eierstokken 19,27,28.
Gebruikmakend van de verschillende technieken die in de literatuur worden beschreven, was dit protocol gericht op het optimaliseren van de isolatie van preantrale follikels uit enkele rundervliegen op een eenvoudige, consistente en efficiënte manier die incubatie in enzymatische oplossingen vermijdt. Het verbeteren van de methoden om preantrale follikels te isoleren zal een kans bieden om het begrip van dit stadium van folliculogenese te vergroten en de ontwikkeling van effectieve kweeksystemen mogelijk te maken om preantrale follikels tot het antrale stadium te ontwikkelen. De gedetailleerde procedures die hierin worden beschreven voor de isolatie van preantrale follikels van een groot zoogdier zoals de rundersoort zullen van vitaal belang zijn voor onderzoekers die vroege folliculogenese willen bestuderen in een niet-muizensoort die vertaalbaar is naar mensen.

```html
<table><tbody><tr><td>5-3/4" Soda Lime Disposable Glass Pasteur Pipette</td><td>Duran Wheaton Kimble</td><td>63A54</td><td>Pasteur pipet die kan worden gebruikt om follikels los te maken van puin tijdens het zoeken in de petrischaal</td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>Verdund tot 4%; fixatie van follikels voor immunokleuring</td></tr><tr><td>20 mL Luer-lock spuit</td><td>Fisher Scientific</td><td>Z116882-100EA</td><td>Spuit gebruikt met de 18 G naald om follikels los te maken van de 40 &mu;m celstrainer</td></tr><tr><td>#21 Steriele scalpelkling</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-365-023</td><td>Gebruikt om de eierstokken te snijden en de medula te verwijderen</td></tr><tr><td>40 &mu;m Cell Strainer</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>22-363-547</td><td>Gebruikt om het filtraat van de 300 &mu;m celstrainer te filteren</td></tr><tr><td>104 mm Plastic Trechter</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-348C</td><td>Grootte kan variëren, maar zorg ervoor dat de kaasdoek op de juiste manier wordt gesneden en dat het eierstokhomogenaat niet overloopt</td></tr><tr><td>300 &mu;m Cell Strainer</td><td>pluriSelect&nbsp;</td><td>43-50300-03</td><td>Gebruikt om het filtraat van de kaasdoek te filteren&nbsp;</td></tr><tr><td>500 mL Erlenmeyer Kolb</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB500500</td><td>Trechter en kolf gebruikt om het filtraat van de kaasdoek op te vangen&nbsp;</td></tr><tr><td>Air-Tite Steriele Naalden 18 G</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-817-151</td><td>18 G biedt voldoende druk om follikels los te maken van de 40 &mu;m celstrainer</td></tr><tr><td>Air-Tite Steriele Naalden 27 G 13 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-817-171</td><td>Naalden die kunnen worden gebruikt om puin te manipuleren waarin follikels vastzitten</td></tr><tr><td>BD Hoechst 33342 Oplossing</td><td>Fisher Scientific</td><td>BDB561908</td><td>Fluorescente DNA-kleuring</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumine (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030-100G&nbsp;</td><td>Component van follikelwasmedium</td></tr><tr><td>Kaasdoek</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71748-00</td><td>Eerste filterfase van het eierstokhomogenaat bedoeld om groot weefseldebris te verwijderen</td></tr><tr><td>Classic Double Edge Veiligheidsscheermessen</td><td>Wilkinson Sword</td><td>N/A</td><td>Scheermessen die het beste passen in de McIlwain Tissue Chopper en snel dof worden</td></tr><tr><td>Donkey-Anti-Rabbit Secundair Antilichaam, Alexa Fluor 488</td><td>Fisher Scientific</td><td>A-21206</td><td>Secundair antilichaam voor immunokleuring</td></tr><tr><td>Eisco Latex Pipetbollen</td><td>Fisher Scientific</td><td>S29388</td><td>Rubbere bel om te gebruiken met Pasteur pipetten</td></tr><tr><td>HEPES Buffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>Component van follikelwasmedium</td></tr><tr><td>Homogenisator</td><td>VWR</td><td>10032-336</td><td>Eierstokweefsel homogeniseren om follikels vrij te maken&nbsp;</td></tr><tr><td>ImageJ/Fiji</td><td>NIH</td><td>v2.3.1</td><td>Software gebruikt voor analyse van fluorescentie-immunolocalisatie</td></tr><tr><td>McIlwain Tissue Chopper</td><td>Ted Pella</td><td>10184</td><td>Gebruikt om eierstokweefsel klein genoeg te snijden voor homogenisatie</td></tr><tr><td>Microscoop - Stereoscoop</td><td>Olympus</td><td>SZX2-ILLT</td><td>Dissectiemicroscoop gebruikt voor het zoeken en oogsten van follikels uit het filtraat</td></tr><tr><td>Microscoop - Omgekeerd</td><td>Nikon</td><td>Diaphot 300</td><td>Omgekeerde microscoop gebruikt voor hoogvergrotings helderveldvisualisatie van geïsoleerde follikels</td></tr><tr><td>Microscoop - Omgekeerd</td><td>ECHO</td><td>Revolve R4</td><td>Omgekeerde microscoop gebruikt voor hoogvergroting helderveld en epifluorescentievisualisatie van geïsoleerde follikels</td></tr><tr><td>Mineralolie</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8410-1L</td><td>Olie om de druppels follikelwasmedium te bedekken om verdamping tijdens het zoeken te voorkomen</td></tr><tr><td>Niet-essentiële Aminozuren (NEAA)</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td>Component van follikelwasmedium</td></tr><tr><td>Normaal Donkeizerum</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-001</td><td>Reagens voor immunokleuring blokkeringsbuffer</td></tr><tr><td>Nunc 4-wel dishes voor IVF</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>144444</td><td>4-wel dishes voor follikelisolering en wassen</td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine Oplossing 100x</td><td>Gibco</td><td>15-140-122</td><td>Component van follikelwasmedium</td></tr><tr><td>Petrischaal 60 mm OD x 13,7 mm</td><td>Ted Pella</td><td>10184-04</td><td>Petrischaal die het beste past in de McIlwain Tissue Chopper</td></tr><tr><td>Fosfaat Gebufferd Saline (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP665-1</td><td>Wasbuffer voor eierstokken en follikels</td></tr><tr><td>Plastiek Snijplank</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-002-24A</td><td>Snijplank van voldoende grootte om eierstokken veilig te snijden</td></tr><tr><td>Polyvinylpyrrolidon (PVP)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP431-100</td><td>Toevoeging van PVP (0,1% w/v) aan PBS voorkomt dat follikels aan de plaat of aan elkaar blijven plakken&nbsp;</td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36930</td><td>Montagemedium voor fluorescent gelabelde cellen of weefsel</td></tr><tr><td>Qiagen RNeasy Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td>RNA zuiveringskit</td></tr><tr><td>R</td><td>The R Foundation</td><td>v4.1.2</td><td>Statistische analyse software</td></tr><tr><td>Rabbit-Anti-Human Cx37/GJA4 Polyklonaal Antilichaam</td><td>Abcam</td><td>ab181701</td><td>Cx37 primaire antilichaam voor immunokleuring</td></tr><tr><td>RevertAid RT Reverse Transcriptie Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K1691</td><td>cDNA synthesekit</td></tr><tr><td>Rstudio</td><td>RStudio, PBC</td><td>v2021.09.2</td><td>Statistische analyse software</td></tr><tr><td>Natriumhydroxide Oplossing (1N/Gecertificeerd)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS266-1</td><td>Gebruikt om de media pH te verhogen tot 7,6-7,8</td></tr><tr><td>Natrium Pyruvaat (NaPyr)</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td>Component van follikelwasmedium</td></tr><tr><td>Vierkante Petrischaal 100 mm x 15 mm&nbsp;</td><td>Thermo

isolatie van kleine preantrale follikels uit de runder eierstok met behulp van een combinatie van fragmentatie, homogenisatie en seriële filtratie

Isolation of Small Preantral Follicles from the Bovine Ovary Using a Combination of Fragmentation, Homogenization, and Serial Filtration

Het begrijpen van het volledige proces van folliculogenese van zoogdieren is cruciaal voor het verbeteren van geassisteerde voortplantingstechnologieën bij vee, mensen en bedreigde soorten. Onderzoek is meestal beperkt gebleven tot antrale en grote preantrale follikels vanwege moeilijkheden bij de isolatie van kleinere preantrale follikels, vooral bij grote zoogdieren zoals runderen. Dit werk presenteert een efficiënte aanpak om grote aantallen kleine preantrale follikels uit een enkele runder eierstok op te halen. De cortex van individuele runderbitussen werd gesneden in kubussen van 500 μm met behulp van een weefselhakselaar en gedurende 6 minuten gehomogeniseerd bij 9.000-11.000 tpm met behulp van een 10 mm-sonde. Groot puin werd van het homogenaat gescheiden met behulp van een kaasdoek, gevolgd door seriële filtratie door celzeefmachines van 300 μm en 40 μm. De inhoud die in de zeef van 40 μm werd achtergebleven, werd gespoeld in een zoekschaal, waar follikels werden geïdentificeerd en verzameld in een druppel medium. De levensvatbaarheid van de verzamelde follikels werd getest via trypan blue-kleuring. Deze methode maakt de isolatie van een groot aantal levensvatbare kleine preantrale follikels uit een enkele runder eierstok in ongeveer 90 minuten mogelijk. Belangrijk is dat deze methode volledig mechanisch is en het gebruik van enzymen vermijdt om het weefsel te dissociëren, wat de follikels kan beschadigen. De follikels verkregen met behulp van dit protocol kunnen worden gebruikt voor downstream-toepassingen zoals isolatie van RNA voor RT-qPCR, immunolokalisatie van specifieke eiwitten en in vitro cultuur.

Overzicht en kritieke stappen Met behulp van dit protocol kunnen kleine boviene preantrale follikels betrouwbaar worden geïsoleerd uit enkele eierstokken in experimenteel relevante aantallen. Uit een totaal van 30 replicaties werden gemiddeld 41 follikels per replicatie verkregen, met een bereik van 11 tot 135 follikels (figuur 4A). In 14 replicaties werden de follikels gekarakteriseerd voor het stadium van ontwikkeling zoals eerder beschreven26 do...

Het bevorderen van de studie van preantrale folliculogenese vereist efficiënte methoden voor follikelisolatie van enkele eierstokken. Hier wordt een gestroomlijnd, mechanisch protocol gepresenteerd voor follikelisolatie van runderbitussen met behulp van een weefselhakselaar en homogenisator. Deze methode maakt het mogelijk om een groot aantal levensvatbare preantrale follikels uit een enkele eierstok te verzamelen.

Isolatie van kleine preantrale follikels uit de runder eierstok met behulp van een combinatie van fragmentatie, homogenisatie en seriële filtratie

Understanding the full process of mammalian folliculogenesis is crucial for improving assisted reproductive technologies in livestock, humans, and ...

Dit protocol maakt de efficiënte en herhaalbare isolatie mogelijk van pre-antrale follikels in een vroeg stadium van een enkele runder eierstok en het creëert nieuwe mogelijkheden voor de studie van ovariële folliculogenese bij een niet-rundersoort. Door een groter aantal follikels uit een enkele eierstok te gebruiken, maakt deze techniek in vivo behandelingen mogelijk vóór de eierstokoogst, of obtentie van meerdere monsters in de loop van de tijd van hetzelfde dier via ovariumbiopsie. Isolatie en cryo-conservering van pre-antrale follikels in een vroeg stadium kan een waardevolle optie zijn voor vruchtbaarheidsbehoud bij jonge vrouwen die een gonadotoxische behandeling ondergaan, zoals chemotherapie, evenals kiemplasmabehoud van bedreigde soorten.De procedure wordt gedemonstreerd door Stephanie McDonnell, Amanda Morton en Juliana Candelaria, promovendi uit mijn laboratorium. Breng om te beginnen eierstokken over in het laboratorium naar warme, steriele PBS met Pen-Strep en selecteer eierstokken met veel kleine antrale follikels en geen prominent corpus lutetium. Verwijder overtollig bindweefsel en vet uit de eierstokken met een schaar.Breng een eierstok over op de snijplank op het bankpapier. Snijd met behulp van een scalpel de eierstok in de lengterichting doormidden van de ene ligamentaanhechtingsplaats naar de tegenovergestelde aanhechtingsplaats. Bewaar de ene helft van de eierstok op de te verwerken snijplank en plaats de andere helft van de eierstok terug in warme PBS met Pen-Strep.Om het medulla te verwijderen, snijdt u langs de kromming van de eierstok op ongeveer 2 millimeter afstand van het oppervlak zonder door de cortex te snijden met het blootgestelde medulla naar boven gericht. Snijd door de snede naar beneden om het grootste deel van de medulla te verwijderen. Draai de eierstok half om zodat het epitheel naar boven is gericht en gebruik het scalpel om het medulla weg te snijden van de cortex en snijd het resterende witte bindweefsel rond de rand van het eierstokstuk weg dat verbonden was met de ligamenten.Zodra het grootste deel van het medulla is verwijderd, gebruikt u het scalpel om de cortex tot ongeveer 1 millimeter dikte te snijden terwijl u het scalpel manipuleert met kleine heen-en-weer bewegingen om de rest van het medulla weg te scheren en snijdt u vervolgens elke eierstokschors in twee stukken. Houd de cortexstukken in warme PBS met Pen-Strep totdat ze klaar zijn om te hakken. Breng een enkel stuk van de cortex over naar de petrischaal op de weefselhakselaar en maak het weefsel nat met drie of vier druppels warme PBS met Pen-Strep.Terwijl u het stuk weefsel stabiel houdt met een tang, drukt u eenmaal op de Reset-knop om de weefselhakselaar te starten. Nadat het hele stuk van de cortex in stroken is gesneden, gebruikt u de knop van de meshouder om het mes van de petrischaal te tillen en de tang om weefsel van het mes te verwijderen. Nadat u de plaathouder 90 graden hebt gedraaid, drukt u nogmaals op de Reset-knop en passeert u het mes volledig door de weefselstrips.Gebruik de knop van de meshouder om het mes van de petrischaal en de tang te tillen om weefsel van het mes te verwijderen, zoals eerder is aangetoond. Was met behulp van een transferpipet en warme PBS met Pen-Strep het gehakte weefsel in een voorverwarmde conische buis van 50 milliliter. Breng de conische buis terug naar het water of kraalbad om het gehakte weefsel warm te houden terwijl u de hakprocedure herhaalt met de andere drie helften van de eierstok.Voor het beste snijresultaat gebruikt u de moerdriver om de moer van de hakarm te verwijderen en de ring en messluiting te verwijderen. Verwijder met een tang het mes van de hakarm. Draai het om zodat de ongebruikte rand naar de petrischaal is gericht en plaats deze terug op de hakarm.Nadat u ervoor hebt gezorgd dat de homogenisatoreenheid is aangesloten en de snelheid is ingesteld op de tweede balk, plaatst u de generatorsonde van 10 millimeter in de eenheid volgens de specificaties van de fabrikant. Stel vervolgens een timer in voor 1 minuut en plaats de sonde in de conische buis van 50 milliliter met het gehakte cortexweefsel van één eierstok en voldoende PBS met Pen-Strep om de buis te vullen tot de 25 milliliterlijn. De diepte waarop de sonde wordt ingebracht, moet 1/3 van de hoogte van de vloeistof zijn, gemeten vanaf de bodem van de kamer.Zodra de timer start, schakelt u de homogenisator in, zorgt u ervoor dat de onderkant van de sonde de buis niet raakt en houdt u de buis stil terwijl de homogenisator is ingeschakeld. Verwijder na 1 minuut homogenisatie de sonde uit de buis en verwijder vervolgens het bindweefsel dat de ontluchtingsgaten verstopt in de ruimte tussen het rotormes en de rotorbuis of cortexstukken die met een tang in de sonde zijn geplakt en plaats ze terug in de buis. Giet het gedispergeerde weefsel in de met kaasdoek bedekte trechter, ingebracht in de Erlenmeyer en spoel de inhoud van de buis in de trechter met behulp van warme PBS.Spoel tot slot het kaasdoek af met warme PBS. Forceer de vloeistof in kleine fragmenten om door de gaten van de doek te gaan door de kaasdoek rond de weefselfragmenten naar beneden te draaien en te knijpen totdat alle overtollige vloeistof en weefsel uit de kaasdoek zijn verwijderd. Nadat u het kaasdoek over de trechter hebt geopend, spoelt u het kaasdoek met PBS met Pen-Strep met behulp van een transferpipet en knijpt u opnieuw eventuele resterende weefselfragmenten door de doek.Houd met behulp van een hemostat de celzeef van 300 micrometer boven een bekerglas van 200 milliliter en giet het filtraat in de Erlenmeyer door de celzeef. Als de celzeef verstopt raakt met weefsel, tikt u deze voorzichtig tegen het bekerglas, draait u de zeef ondersteboven en tikt u het grote weefselafval op het bankpapier. Spoel de inhoud van de kolf af met behulp van warme PBS met Pen-Strep totdat er geen weefselfragmenten achterblijven en giet deze in de celzeef.Vervolgens, terwijl u de 40-micrometer celzeef met een hemostaat over een tweede bekerglas van 200 milliliter houdt, giet u al het initiële filtraat dat aanwezig is in het eerste bekerglas van 200 milliliter door de zeef en spoelt u vervolgens de inhoud van het bekerglas met behulp van warme PBS met Pen-Strep totdat er geen weefselfragmenten achterblijven en giet het in de celzeef. Nadat u de naald van 18 gauge op de spuit van 20 milliliter hebt gemonteerd, vult u de spuit met een follikelwasmedium. Houd met een hemostat de celzeef van 40 micrometer ondersteboven boven een vierkante petrischaal en gebruik de spuit om de inhoud van de celzeef in de schaal uit te spoelen.Breng de vierkante petrischaal over op een stereoscoop met een warm podium ingesteld op 38,5 graden Celsius met een vergrotingsset tussen 1,25 en 3,2x. Nadat u de follikels uit de vierkante petrischaal hebt geïdentificeerd, brengt u de follikel over om middelgrote druppels te wassen met behulp van de micropipette. Het totale aantal geïsoleerde pre-antrale follikels per replicatie met behulp van weefselhomogenisatie van 6 minuten toont een gemiddelde van 41 follikels per replicaat, variërend van 11 tot 135 follikels.Beoordeling van het ontwikkelingsstadium van 476 geïsoleerde follikels toonde aan dat de meerderheid zich in het primaire stadium van ontwikkeling bevond, met een afmeting van 40 tot 79 micrometer in het bevatten van één laag kuboïdale granulosacellen. Homogenisatie van de ovariële cortex gedurende 6 minuten leverde een groter aantal pre-antrale follikels op in vergelijking met 5 minuten homogenisatie met dezelfde snelheid. Transcriptexpressie van de granulosacelmarker FSH-receptor en kiemcelmarker DAZL in de follikels werd geëvalueerd met behulp van reverse transcriptie kwantitatieve PCR die aantoonde dat zowel primaire als vroege secundaire follikels FSH-receptor en DAZL-transcripten tot expressie brachten.Immunofluorescente lokalisatie van CX37 in geïsoleerde pre-antrale follikels in zowel de primaire als de vroege secundaire stadia toont aan dat CX37 gelokaliseerd was in de O-plasm, afwezig in de kern van de O-site en in het membraan van de granulosacellen. In onze ervaring zijn een goede dissectie van een dunne laag corticale weefsel, het hakken van het weefsel tot de juiste grootte en een goede homogenisatie kritieke stappen om ervoor te zorgen dat levensvatbare follikels uit het weefsel vrijkomen. Geïsoleerde pre-antrale follikels kunnen worden gebruikt om vragen te beantwoorden zoals regulatie van pre-antrale follikelgroei en de aard van interacties tussen granulosacellen en de eicel, waardoor de ontwikkeling van efficiëntere kweekomstandigheden wordt vergemakkelijkt.

isolation-small-preantral-follicles-from-bovine-ovary-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een nieuwe methode voor ovariële follikel inkapseling in een 3D-fibrine-alginaat interpenetrerend netwerk wordt beschreven. Dit systeem combineert een structurele ondersteuning met proteolytische degradatie van de ontwikkeling van onvolgroeide follikels steun aan rijpe eicellen te produceren. Deze methode kan worden toegepast op de cultuur cel aggregaten tot cel-cel contacten, zonder beperking van de uitbreiding te behouden.

Een methode voor ovariële follikel Encapsulation en cultuur in een proteolytisch Afbreekbare 3 dimensionale systeem

This video describes the isolation of antral oocytes from freshly harvested mouse ovaries. These antral oocytes can be used for further characterization and developmental studies.

Mouse Antral Oocyte Isolation: A Method to Isolate Antral Oocytes from Freshly Harvested Mouse Ovaries

This video describes the technique to isolate the cumulus-oocyte complex or COC from porcine ovaries. The isolated intact COC can be used to carry out the in vitro fertilization - the assisted reproductive technique for developing fertility treatments.

Porcine Cumulus Oocyte Complex Isolation: A Technique to Isolate Cumulus Oocyte Complex from Porcine Ovarian Follicle for In Vitro Fertilization

Hier worden twee protocollen gepresenteerd voor de inkapseling van varkensocyten in 3D-kweekomstandigheden. In de eerste worden cumulus-eicellencomplexen (COC's) ingekapseld in fibrin-alginaatkralen. In de tweede zijn ze ingesloten met gefluoreerde ethyleenpropyleenpoederdeeltjes (microbioreactoren). Beide systemen zorgen voor optimale omstandigheden om hun 3D-organisatie te onderhouden.

Proteolytisch afgebroken alginaat hydrogels en hydrofobe microbioreactoren voor porcine Oocyte Inkapseling

We beschrijven de procedures voor isolatie van groeiende eicellen uit eierstokzakjes in een vroeg stadium van ontwikkeling, evenals de opzet van een in vitro cultuursysteem dat de groei en differentiatie tot aan de volgroeide fase kan ondersteunen.

In Vitro Cultuur Strategie voor Eicellen uit early antral follikel bij runderen

Hier presenteren we een eenvoudige methode voor het scheiden van folliculaire cellen en oöcyten in eierstokfollikels van zebravissen, wat het onderzoek naar de ontwikkeling van eierstokvissen bij zebravissen zal vergemakkelijken.

Scheiding van folliculaire cellen en oöcyten in ovariële follikels van zebravissen

Hier presenteren we protocollen voor de identificatie en zuivering van eierstokcellen uit antrale follikels. We werken uit over methoden voor het verwerken van hele eierstokken voor de cryopreservatie van corticale strips, terwijl we ook intacte antrale follikels oogsten die enzymatisch worden behandeld om meerdere follikel-residente celtypen vrij te maken, waaronder granulosa, theca, endotheel, hematopoietische en stromale cellen.

Extractie, etikettering en zuivering van afstammingsspecifieke cellen uit menselijke antrale follikels

Hier beschrijven we een protocol dat beschrijft hoe menselijke ovariële follikels kunnen worden geïsoleerd uit bevroren ontdooid corticale weefsel om genexpressieanalyses uit te voeren.

Genexpressieanalyses in menselijke follikels

Hier beschrijven we een protocol voor het scheiden van dooier-, granulosacellen en thecacellen in preovulatoire follikels van vogels. Deze precisiebehandeling maakt kritisch onderzoek mogelijk naar de rol van deze lagen in de voortplantingsfunctie, wat helpt bij het begrijpen van folliculaire ontwikkeling, hormonale regulatie en ziekteonderzoek voor verbeterde landbouwopbrengst en biomedische inzichten.

Scheiding van pre-ovulatoire follikelgranulosa- en thecacellagen voor stroomafwaartse toepassingen

Dit protocol beschrijft een nieuw driedimensionaal (3D) kweekmodel waarbij gebruik wordt gemaakt van een tyramine-gekoppelde hyaluronzuurhydrogel om preantrale follikels uit de eierstok van de muis in te kapselen en te kweken. We beschrijven ook twee benaderingen van cryopreservatie van de ovariële follikel door vitrificatie.

Toepassing van een nieuwe hyaluronzuurhydrogel voor driedimensionale follikelcultuur en methodologie voor cryopreservatie van de ovariële follikel bij muizen

Dit artikel presenteert een co-cultuurmodel van boviene theca- en granulosacellen. Deze methode heeft het potentieel om te dienen als een betrouwbare basis voor analyses die gericht zijn op de studie van paracriene communicatie en substraattransport tussen de somatische cellen in de follikel.

Een gemodificeerd co-cultuursysteem voor het begrijpen van granulosa-theca-celinteracties in de rundereierstok

Leer een efficiënte methode voor de isolatie van kleine preantrale follikels uit runder eierstokken met behulp van fragmentatie, homogenisatie en seriële filtratie. Deze techniek ondersteunt onderzoek naar follikelontwikkeling en vruchtbaarheidsbehoud.

Isolatie van kleine preantrale follikels uit de runder eierstok met behulp van een combinatie van fragmentatie, homogenisatie en seriële filtratie (Video) | JoVE Journal

Isolatie van kleine preantrale follikels uit de runder eierstok met behulp van een combinatie van fragmentatie, homogenisatie en seriële filtratie

Meer video's verkennen