Een oplosbare tetrazolium-gebaseerde reductietest om het effect van antilichamen op Candida tropicalis biofilms te evalueren

Dit in vitro, 96-well-plate-gebaseerde protocol kan worden gebruikt om het remmende effect van antilichamen op nieuwe antischimmelmiddelen op de metabole activiteit van schimmelcellen in Candida-biofilms te testen. In vergelijking met andere methoden is dit een zeer gevoelige, nauwkeurige, high-throughput, reproduceerbare, gebruiksvriendelijke en kosteneffectieve techniek voor het evalueren van het effect van antilichamen of antischimmelmiddelen op de ontwikkeling van Candida-biofilms. Deze test kan worden gebruikt voor het beoordelen van de werkzaamheid van nieuwe op geneesmiddelen gebaseerde of op antilichamen gebaseerde therapieën, evenals vaccinkandidaten tegen Candida-biofilms, die geassocieerd zijn met de ernst van invasieve candidiasis.

Deze methode kan worden toegepast voor het testen van het effect van nieuwe antischimmelmiddelen of antilichamen tijdens biofilmvorming of rijping in verschillende omgevingen met behulp van verschillende schimmelstammen of antilichaambronnen. Deze procedure wordt gedemonstreerd door Mr.Pankaj Chandley, een phd-onderzoeker die in mijn laboratorium werkt. Voeg om te beginnen 100 microliter Candida tropicalis-cultuur toe aan een 96-well microtiterplaat.

Gebruik een meerkanaals pipet om de laatste twee kolommen te vullen met alleen 100 microliter RPMI 1640 MOPS-medium. Bedek de microtiterplaat met een deksel en aluminiumfolie en incubeer de plaat gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius onder stationaire omstandigheden. De volgende dag aspirateer het medium voorzichtig met behulp van een meerkanaals pipet.

Keer de plaat voorzichtig om op vloeiplaten en tik om eventuele resten te verwijderen. Was de plaat met 200 microliter 1X PBS met een meerkanaals pipet. Aspirateer de PBS voorzichtig met een meerkanaals pipet en was tweemaal met PBS.

Om overtollige PBS te verwijderen, droogt u de plaat gedurende 30 minuten aan de lucht bij kamertemperatuur in een biologische veiligheidskast. Bereid seriële verdunningen van warmte-geïnactiveerde serummonsters in steriel RPMI 1640 MOPS-medium. Voeg 100 microliter van de geselecteerde serumverdunning toe aan elk putje van de 96-well microtiterplaat.

Voeg in kolom 10 alleen RPMI 1640 MOPS-medium toe voor de positieve controle van de schimmel. Voeg een één tot 50 verdunning van serum toe aan alle putten in kolom 11 om te dienen als de no-fungus plus serum negatieve controle. Nadat u de plaat hebt bedekt met een deksel en aluminiumfolie, incubeert u de plaat gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius.

De volgende dag, nadat u het serum voorzichtig hebt geaspirateerd met behulp van een meerkanaals pipet, tikt u zachtjes op de omgekeerde plaat om eventuele restserum te verwijderen. Herhaal de PBS-was drie keer en droog de plaat gedurende 30 minuten aan de lucht bij kamertemperatuur in een biologische veiligheidskast om overtollige PBS te drogen. Los vervolgens 25 milligram XTT op in 50 milliliter filter-gesteriliseerd Ringer's lactaat.

Aliquot 10 milliliter in aparte buizen. Bedek het met aluminiumfolie en bewaar het bij min 80 graden Celsius. Los vervolgens 8,6 milligram menadion op in vijf milliliter aceton.

En na het verdelen van 50 microliter in 100 afzonderlijke microbuizen, bewaar de aliquots bij min 80 graden Celsius. Neem 10 milliliter XTT en voeg één microliter menadion toe om een werkoplossing van één micromolair te verkrijgen. Voeg 100 microliter XTT menadione-oplossing toe per putje van de 96-well microtiterplaat.

Vervolgens, na het bedekken van de plaat met een deksel en aluminiumfolie, incubeer de plaat gedurende twee uur bij 37 graden Celsius in het donker. Breng ten slotte 80 microliter van het gekleurde supernatant van elke put over in een verse 96-well plaat en lees de plaat op 490 nanometer. Serum van Sap2-parapsilosis-geïmmuniseerde muizen zou de rijping van voorgevormde Candida tropicalis biofilms met 65% kunnen voorkomen in vergelijking met 45% in serum van Sap2-albicans en 55% in Sap2-tropicalis-geïmmuniseerde muizen.

Over het algemeen was de biofilmremming door Sap2-immuunserum significant hoger dan die door sham-immuunserum, dat 16% en 13% is in pre-immuunserum. Biofilmremming was bijna verwaarloosbaar bij gebruik van PBS en geen serumcontrole. Uiterste zorg moet worden besteed aan het uitvoeren van de wasstappen om verstoring van biofilms te voorkomen.

De XTT-oplossing moet vlak voor gebruik worden bereid en onmiddellijk aan de plaat worden toegevoegd. Na deze procedure kunnen gebruikers het effect van nieuwe antischimmelmiddelen, vaccinkandidaten of antilichamen evalueren tijdens de vorming en rijping van Candida-biofilm in verschillende onderzoeksomgevingen met behulp van verschillende schimmelstammen.