AirID-gebaseerde nabijheidsetikettering voor eiwit-eiwitinteractie in planten

AirID is een waardevol enzym voor eiwit-eiwitinteractie, en het creëert minder toxiciteit en minder fouten in tijdgebonden processen dan andere nabijheidslabelende enzymen. Er wordt een stapsgewijs protocol gepresenteerd voor het uitvoeren van het nabijheidslabeling-experiment in komkommer of Cucumis sativus met AT4G18020 APRR2-AirID-eiwit als model. Ahmad Zada, Imran Khan, Yuting Cheng en Min Zhang uit mijn laboratorium zullen de procedure demonstreren.

Begin met het overbrengen van de Cucumis sativus- of komkommerzaden in water, broed ze 20 minuten uit bij 50 graden Celsius en plaats de zaden vervolgens 12 tot 16 uur op het filtreerpapier op een petriplaat. Breng de zaden later over naar potten met aarde en kweek ze in een klimaatkamer bij 23 graden Celsius in een fotoperiode van 16 uur licht en 18 uur donker gedurende drie tot vier weken. Breng 2,5 microliter van het plasmide EarleyGate 100 over naar de competente cellen van de agrobacterium tumefaciens GV3101-stam.

Incubeer de buis 30 minuten op ijs voordat u deze gedurende drie minuten overbrengt naar vloeibare stikstof. Om de hitteschok te geven, brengt u de buis gedurende vijf minuten over naar de incubator bij 37 graden Celsius. Plaats de buis vervolgens twee minuten op ijs.

Voeg 1.000 microliter Luria Bertani of LB-medium toe aan de door hitte geschokte agrobacteriumcellen. Nadat u de cellen een uur lang bij 30 graden Celsius en 118 RPM hebt geïncubeerd, centrifugeert u ze gedurende twee minuten bij 3000 G bij vier graden Celsius. Gooi vervolgens het supernatans van 800 microliter weg en meng de resterende oplossing.

Plaat het op het LB-medium aangevuld met 50 microgram per milliliter kanamycine en gentamycine elk en 25 microgram per milliliter rifampicine. Incubeer de platen 48 uur bij 30 graden Celsius. Pak wat bacteriekolonies van de borden.

Leg ze in LB vloeibare media, aangevuld met geschikte antibiotica en incubeer vloeibare LB bij 30 graden Celsius en 218 RPM gedurende 36 tot 48 uur. Na twee minuten centrifugeren bij 3.000 G bij vier graden Celsius, resuspendeert u de pellet in een agro-infiltratiebuffer om de optische dichtheid aan te passen aan een dichtheid op een golflengte van 600 nanometer. Infiltreer met een naaldloze spuit van één milliliter de gehele epidermis van het abaxiale oppervlak met 1,5 milliliter van het geresuspendeerde agrobacteriële inoculum.

Houd de planten in de klimaatkamer op 23 graden Celsius met 75 micromol per vierkante meter per seconde licht gedurende 16 uur in donkere omstandigheden gedurende acht uur Infiltreer na 36 uur een milliliter van vijf microgram biotine in de reeds gefilterde bladeren. Snijd na vier tot 12 uur biotine-infiltratie de bladeren af en breng ze snel over naar vloeibare stikstof om eiwitafbraak te voorkomen. Maal de bladeren met een vijzel en voeg snel twee milliliter PBS BSA van pH 7,4 toe, gevolgd door langzaam malen.

Breng het monstermengsel over naar een conische buis van 15 milliliter door een filter voor snel filtratiemateriaal dat erop is geplaatst en houd de buis op ijs. Breng de monsters over in een buis van twee milliliter. Voeg een cocktail van 1%-eiwitremmers toe en meng de inhoud door de buis zeven tot acht keer op en neer te draaien voordat u deze centrifugeert.

Als je klaar bent, breng je het supernatans over in een nieuwe buis van twee milliliter en voeg je 10% bèta-D-maltoside toe. Leg de tube vijf minuten op ijs en centrifugeer vervolgens gedurende 10 minuten bij 20.000 G bij vier graden Celsius. Om de ontziltingskolom in evenwicht te brengen, markeert u een kant van de kolom en centrifugeert u deze met de gemarkeerde kant naar buiten gericht.

Verwijder de boven- en onderkant van de kolom en centrifugeer opnieuw bij 1.000 G gedurende twee minuten bij vier graden Celsius. Gooi de vloeibare oplossing uit de opvangbuis van de kolom en was de buis met vijf milliliter PBS-buffer met centrifugeren zoals eerder gedemonstreerd, ten minste vijf keer. Voeg een milliliter PBS BSA toe aan 50 microliter Streptavidin-C1-geconjugeerde magnetische kralen in een tube van 1,5 milliliter en meng dit grondig.

Plaats de buis gedurende drie minuten op een magnetische standaard om de kralen aan één kant van de buis te absorberen. Gooi het supernatans van de andere kant weg en herhaal deze PBS BSA-wasbeurt driemaal. Om het gebiotinyleerde eiwit te verrijken, voegt u twee milliliter van de monsters toe aan de kolom.

Voeg na het centrifugeren van de kolom bij 1000 G gedurende acht minuten bij vier graden Celsius een milliliter ontzouten eiwitextract toe aan 50 microliter Streptavidin-C1-geconjugeerde magnetische parels. Meng de oplossing grondig door de buis met magnetische kralen gedurende 30 minuten op normale snelheid en kamertemperatuur op de rotator te plaatsen. Plaats vervolgens de kralen drie minuten op het magnetische rek bij kamertemperatuur of totdat ze zich aan één kant van de buis verzamelen.

Verwijder voorzichtig het supernatans en voeg een milliliter wasbuffer één toe. Draai de buis twee minuten op een rotator en herhaal de stap die op het magnetische rek wordt uitgevoerd om het supernatant te verwijderen. Voer op dezelfde manier de wasbeurten uit met één milliliter wasbuffers twee en drie, zoals eerder gedemonstreerd.

Verwijder vervolgens het wasmiddel in de wasbuffers door 1,7 milliliter 50 millimolair trishydrochloride toe te voegen en de stap op het magnetische rek te herhalen. Geef zes wasbeurten van elk twee minuten met één milliliter 50 millimolair ammoniumbicarbonaatbuffer. Als je klaar bent, voeg je 50 microliter van het eiwitextract met 50 millimolair trishydrochloride, 12% sucrose, 2% lithiumlaurylsulfaat en 1,5% dithiothreitol toe aan de kralen en plaats je de buis vijf minuten in de incubator bij 100 graden Celsius om een hitteschok te geven.

Na het herhalen van de stap op een magnetisch rek, bewaart u het supernatans bij min 80 graden Celsius voor LCMS/MS-analyse. De western blot-analyse van de geëxtraheerde eiwitten toonde succesvolle eiwitexpressie en biotinylering in de geïnfiltreerde komkommerbladeren. Het hogere expressieniveau van gelabelde eiwitten en extra banden in vergelijking met de controle bevestigden de succesvolle tagging van de doeleiwitten van het gen van belang door AirID.

De resultaten werden bevestigd met behulp van anti-vlag- en antimassa-antilichamen die de doelband met een anti-vlag-antilichaam in alle getransformeerde monsters lieten zien. Na het verrijken van gebiotinyleerde eiwitten met Streptavidin-C1-geconjugeerde magnetische kralen, werden meerdere eiwitten van verschillende grootte waargenomen. Uit alle resultaten werd geconcludeerd dat AirID een nieuw en ideaal enzym is voor het analyseren van eiwit-eiwitinteracties in planten.

Tijdens het nabijheidslabeling-experiment is het belangrijk om te onthouden dat vijf micromolaire biotine en HR-duur ideaal zijn. Het protocol schetst de stapsgewijze installatie van op AirID gebaseerde nabijheidsetikettering in de fabriek, inclusief de voorbereiding van het bladmonster, het verwijderen van pre-biotine, het kwantificeren van extracteiwit en het verrijken van gebiotinyleerde eiwitten. AirID zal naar verwachting de nauwkeurigheid van PPI-onafhankelijke biotinylering in combinatie verbeteren.

Er wordt geconcludeerd dat AirID ideaal is voor PPI-analyse in planten.