Name: AirID-gebaseerde nabijheidsetikettering voor eiwit-eiwitinteractie in planten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-16T14:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: Leer nabijheidsetikettering met AirID voor eiwit-eiwitinteracties in komkommer (Cucumis sativus). Dit protocol toont vectorconstructie, agro-infiltratie en biotine-labeling voor succesvolle proteïne-tagging in planten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (Grant No. 32000197 to X.H.), de Special Financial Grant van de China Postdoctoral Science Foundation (Grant No. 2019T120467 to X.H.)

1. Bereiding van plantmateriaal
<ol><li>Cucumis sativus (komkommer) wordt gebruikt voor experimentele analyse. Leg de zaden in water, incubeer ze gedurende 20 minuten bij 50 °C en leg de zaden vervolgens 12-16 uur op filtreerpapier op een petrischaal.</li>
	<li>Breng de zaden daarna over naar potten met aarde (commercieel gekocht) en kweek ze in een klimaatkamer bij een temperatuur van 23 °C en 16 uur licht en 8 uur donkere fotoperiode.</li>
	<li>Houd de planten 3-4 weken in de klimaatkamer totdat de planten 3 of 4 bladstadia hebben bereikt voor een succesvolle agro-infiltratie.</li>
</ol>2. AirID construeren
<ol><li>Gebruik APRR2 als doeleiwit en construeer APRR2-AirID onder de Bloemkoolmozaïekvirus 35S-promotor (p35S: APRR2-AirID). Introduceer het in de Gateway-compatibele binaire vector pEarleyGate1006 (geleverd door Dr. Kathrin Schrick, Kansas State University), en synthetiseer het PL-enzym rechtstreeks volgens de volgorde in aanvullend bestand 1.</li>
</ol>3. Bereiding van competente cellen
<ol><li>Bereiding van DH5α-competente cellen<ol><li>Inoculeer de 2 ml LB (10 g/l trypton, 5 g/l gistextract en 10 g/l NaCl; pH = 7,0.) met E.Coli DH5α-cellen (rechtstreeks uit de bevroren bouillon zonder te ontdooien) en laat ze een nacht groeien (O/N) bij 37 °C.</li>
		<li>Inoculeer vers 0,1%-0,5% inoculum van de O/N-cultuur in 100 ml LB Medium en kweek de cellen tot OD600 tussen 0,4-0,6 bereikt en incubeer de cultuur vervolgens bij 4 °C gedurende 30 minuten.</li>
		<li>Neem de cultuur in twee centrifugebuisjes van 50 ml en draai ze gedurende 5 minuten bij 4 °C rond op 2500 x g.</li>
		<li>Gooi het supernatant weg, resuspendeer de cellen in 10 ml 0,1 M ijskoud CaCl2 en zet ze 15 minuten op ijs. Pelleteer de cellen met een centrifuge van 2500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.</li>
		<li>Resuspendeer de cellen in 1 ml ijskoude 0,1 M CaCl2 + 20% glycerol, aliquot 100 μL in elk buisje van 1,5 ml en bewaar ze onmiddellijk bij -80 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiding van GV3101 competente cellen<ol><li>Inoculeer 2 ml LB (met 50 μg/ml gentamycine en 25 μg/ml rifampicine) met een enkele GV3101-kolonie. Incubeer de cultuur O/N bij 28 °C en schud bij 250 omw/min.</li>
		<li>Inoculeer 200 ml LB met 1 ml verzadigde nachtcultuur. Schud de cultuur bij 250 omw/min en incubeer bij 28 °C tot de OD600 gelijk is aan 0,5.</li>
		<li>Breng de cultuur over in vier voorgekoelde steriele centrifugebuisjes van 50 ml en zet deze 30 minuten op ijs.</li>
		<li>Pellet de cellen op 2500 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatans weg en leg de pellets op ijs.</li>
		<li>Resuspendeer de cellen in 10 ml 0,1 M ijskoude CaCl2-oplossing . Bundel de cellen samen in een voorgekoelde Oakridge-buis van 50 ml.</li>
		<li>Pellet de cellen op 1.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatans weg en resuspendeer de cellen in 10 ml ijskoude CaCl2-oplossing . Zet 30 minuten op ijs.</li>
		<li>Pellet de cellen op 1.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatans weg en resuspendeer de cellen in 2 ml 0,1 M ijskoude CaCl2-oplossing .</li>
		<li>doseer de cellen in een aliquot van 50 μl in voorgekoelde steriele polypropyleen buisjes. Bewaar de cellen bij -80 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Agro-infiltratie
<ol><li>Breng eerst het plasmide over naar agrobacterium<ol><li>Breng 2,5 μl van het plasmide dat is gegenereerd uit stap 2.1 over naar de competente cellen van de agrobacterium tumefaciens GV3101-stam en incubeer gedurende 30 minuten op ijs.</li>
		<li>Breng de buis met het plasmide en de competente cellen gedurende 3 minuten over in vloeibare stikstof.</li>
		<li>Hitteschok bij 37 °C gedurende 5 minuten in een incubator en leg de buis vervolgens 2 minuten op ijs.</li>
		<li>Voeg 1.000 μL LB-medium (10 g/l trypton, 5 g/l gistextract en 10 g/l NaCl; pH = 7,0) toe aan de agrobacterie en incubeer gedurende 1 uur bij 30 °C en 118 rpm.</li>
		<li>Centrifugeer op 3.000 x g gedurende 2 minuten bij 4 °C.</li>
		<li>Gooi de bovenste 800 μL van de oplossing weg en meng de resterende oplossing. Plak het vervolgens op LB (zoals vermeld in stap 4.1.4 toegevoegd met agar en 50 μg/ml kanamycine voor plasmide en 50 μg/ml gentamycine en 25 μg/ml rifampicine voor GV3010-competente cellen). Incubeer de platen gedurende 48 uur bij 30 °C. OPMERKING: Het is beter om enkele kolonies te kiezen en PCR uit te voeren om het gen van belang te bevestigen7.</li>
	</ol></li>
	<li>Pak enkele bacteriekolonies van de platen en doe ze in LB-media plus geschikte antibiotica (zie stap 4.1.6). Incubeer bij 30 °C en 218 tpm gedurende 36-48 uur.</li>
	<li>Centrifugeer de cellen bij 3.000 x g gedurende 2 minat 4 °C. Resuspendeer de cellen tot OD600 = 1,0 in agro-infiltratiebuffer (10 mM MgCl2, 10 mM MES, pH = 5,6, 250 μM acetosyringon).</li>
	<li>Infiltreer het entmateriaal (gegenereerd uit stap 4.3) in de (abaxiale) epidermis met behulp van een naaldloze spuit van 1 ml. OPMERKING: Het is beter om het hele blad te infiltreren en ervoor te kiezen om te repliceren. Gebruik voor 4-5 planten één constructie. Voor elk blad is 1,5 ml geresuspendeerde agrobacteriën voldoende.</li>
	<li>Houd de planten gedurende 36 uur in de klimaatkamer met een 16 uur licht (ongeveer 75 μmol·m-2·s-1) en 8 uur donkere fotoperiode bij 23 °C.</li>
	<li>Infiltreer na 36 uur constructinfiltratie 1 ml 5 μM biotine (in 10 mM MgCl2-oplossing ) in de reeds geïnfiltreerde bladeren van het construct.</li>
	<li>Onderhoud de behandelde planten nog 4-12 uur voordat u het bladweefsel oogst. OPMERKING: Volgens de vorige studie piekt het doeleiwit na 36 uur, dus kies 36 hpi-biotine-infiltraties 4,6. De incubatietijd voor biotine hangt af van het doelonderzoek, maar volgens het huidige experiment is een incubatietijd van 8 uur geschikter voor het labelen van eiwitten.</li>
</ol>5. Monsterneming
NOTITIE: Alle materialen voor monsterafname moeten steriel zijn om keratinebesmetting te voorkomen, en alle protocolstappen moeten worden uitgevoerd in een contaminatievrije omgeving.
<ol><li>Snijd de geïnfiltreerde bladeren en breng ze snel over naar vloeibare stikstof om eiwitafbraak te voorkomen.</li>
	<li>Voer de pre-detectie van eiwit uit door middel van immunoblotanalyses6; dit wordt ten zeerste aanbevolen vóór co-immunoprecipitatie (Co-IP).</li>
</ol>6. Totale eiwitextractie uit blad
<ol><li>Maal de bladeren fijn met een vijzel, voeg snel 2 ml 1x PBS-BSA PH 7.4 toe en maal langzaam.</li>
	<li>Neem een conische buis van 15 ml, plaats een filter voor snelfiltratiemateriaal bovenop de conische buis, breng het monstermengsel over naar de buis via het filter voor snelfiltratiemateriaal en bewaar het op ijs.</li>
	<li>Breng de monsters over in een buisje van 2 ml en voeg een cocktail van 1% eiwitremmers toe.</li>
	<li>Meng de inhoud door 7-8 keer naar boven en naar beneden te draaien en centrifugeer op 1.000 x g gedurende 2 min bij 4 °C.</li>
	<li>Breng het bovenste oplosmiddel van de monsters over in nieuwe buisjes van 2 ml, voeg 10% β-D-maltoside (β-D.M.) toe en plaats ze 5 minuten op ijs. Centrifugeer bij 20.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.</li>
</ol>7. Breng de ontziltingskolom in evenwicht
<ol><li>Centrifugeer de kolom bij 1.000 x g gedurende 1 minuut bij 4 °C. NOTITIE: Markeer één kant van de kolom en zorg ervoor dat de gemarkeerde kant naar buiten wijst tijdens alle centrifugeerprocessen.</li>
	<li>Verwijder de boven- en onderklep van de kolom en centrifugeer gedurende 2 minuten bij 4 °C bij 1.000 x g .</li>
	<li>Gooi de vloeibare oplossing uit de opvangbuis van de kolom en voeg 5 ml 1x PBS-buffer toe om te wassen.</li>
	<li>Centrifugeer de kolom bij 1.000 x g gedurende 2 minuten bij 4 °C.</li>
	<li>Herhaal de stappen 7.3 en 7.4 minstens vijf keer.</li>
</ol>8. Magnetische kralen wassen
<ol><li>Neem een buisje van 1,5 ml en voeg 50 μL streptavidine-C1-geconjugeerde magnetische kralen toe.</li>
	<li>Voeg 1 ml 1x PBS-BSA toe om te wassen, meng grondig en plaats gedurende 3 minuten op de magneetstandaard. Gooi de supernatant weg.</li>
	<li>Herhaal stap 8.2 minstens drie keer.</li>
	<li>Plaats na elke wasbeurt de buis op het magnetische rek om de kralen naar één kant van de buis te adsorberen om de wasbuffer te verwijderen.</li>
</ol>9. Verrijking van gebiotinyleerde eiwitten
<ol><li>Voeg 2 ml van de monsters toe aan de kolom en centrifugeer gedurende 8 minuten bij 4 °C bij 1.000 x g .</li>
	<li>Voeg 1 ml van het ontzoute eiwitextract toe aan 50 μL streptavidine-C1-geconjugeerde magnetische kralen om ze in evenwicht te brengen.</li>
	<li>Plaats de buis op de rotator op normale snelheid zodat de oplossing grondig mengt en gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (RT) incubeert.</li>
	<li>Plaats de kralen 3 minuten op het magnetische rek bij RT, of totdat ze zich aan één kant van de buis verzamelen, om het supernatant voorzichtig te verwijderen.</li>
	<li>Voeg 1 ml wasbuffer I (2% SDS in water) toe, draai 2 minuten op RT op een rotator en herhaal stap 9.4.</li>
	<li>Plaats de buis op de rotator op RT gedurende 2 minuten na het toevoegen van 1 ml wasbuffer II (50 mM HEPES: pH = 7.5, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.1% deoxycholzuur [w/v] en 1% Triton X-100). Herhaal stap 9.4.</li>
	<li>Voeg 1 ml wasbuffer III toe (10 mM Tris-HCl: pH = 7,4, 250 mM LiCl, 1 mM EDTA, 0,1% deoxycholzuur [w/v], 1% NP40 [v/v]) en draai met een shaker gedurende 2 minuten op RT. Herhaal vervolgens stap 9.4.</li>
	<li>Om het wasmiddel te verwijderen, voegt u 1,7 ml 50 mM Tris-HCl (pH = 7,5) toe en herhaalt u stap 9.4. Herhaal deze stap nog een keer.</li>
	<li>Was de parels zes keer gedurende 2 minuten in 1 ml ammoniumbicarbonaatbuffer van 50 mM bij RT en herhaal stap 9.4.</li>
	<li>Voeg 50 μL van het eiwitextract met 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 12% (m/v) sucrose (Suc), 2% (w/v) lithiumlaurylsulfaat en 1,5% (w/v) dithiothreitol toe aan de korrels, hitteschok in de incubator bij 100 °C gedurende 5 minuten en volg stap 9.4. Bewaar het supernatans bij -80 °C voor LC-MS/MS-analyse.</li>
</ol>

<ol><li>Han, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+identification+of+novel+protein-protein+interactions+in+liver+that+affect+glucagon+receptor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">The identification of novel protein-protein interactions in liver that affect glucagon receptor activity.</a> PloS One. 10 (6), 0129226(2015).</li>
<li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+and+identification+of+host+proteins+interacting+with+Theileria+annulata+cysteine+proteinase+%28TaCP%29+by+yeast-two-hybrid+system%5BTitle%5D)+AND+%22Parasites+%26+Vectors%22%5BJournal%5D)">Screening and identification of host proteins interacting with Theileria annulata cysteine proteinase (TaCP) by yeast-two-hybrid system.</a> Parasites & Vectors. 10 (1), 536(2017).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+efficient+agrobacterium-mediated+method+for+transient+gene+expression+and+functional+studies+in+multiple+plant+species%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Communications%22%5BJournal%5D)">A highly efficient agrobacterium-mediated method for transient gene expression and functional studies in multiple plant species.</a> Plant Communications. 1 (5), 100028(2020).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TurboID-based+proximity+labeling+for+in+planta+identification+of+protein-protein+interaction+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">TurboID-based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks.</a> Journal of Visualized Experiments. (159), e60728(2020).</li>
<li>Kido, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AirID%2C+a+novel+proximity+biotinylation+enzyme%2C+for+analysis+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">AirID, a novel proximity biotinylation enzyme, for analysis of protein-protein interactions.</a> eLife. 9, 54983(2020).</li>
<li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpressing+7-hydroxymethyl+chlorophyll+a+reductase+alleviates+non-programmed+cell+death+during+dark-induced+senescence+in+intact+Arabidopsis+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Overexpressing 7-hydroxymethyl chlorophyll a reductase alleviates non-programmed cell death during dark-induced senescence in intact Arabidopsis plants.</a> Biomolecules. 11 (8), 1143(2021).</li>
<li>Ammiraju, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Oryza+bacterial+artificial+chromosome+library+resource%3A+construction+and+analysis+of+12+deep-coverage+large-insert+BAC+libraries+that+represent+the+10+genome+types+of+the+genus+Oryza%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">The Oryza bacterial artificial chromosome library resource: construction and analysis of 12 deep-coverage large-insert BAC libraries that represent the 10 genome types of the genus Oryza.</a> Genome Research. 16 (1), 140-147 (2006).</li>
<li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Albino+Leaf+2+is+involved+in+the+splicing+of+chloroplast+group+I+and+II+introns+in+rice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Albino Leaf 2 is involved in the splicing of chloroplast group I and II introns in rice.</a> Journal of Experimental Botany. 67 (18), 5339-5347 (2016).</li>
<li>Branon, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+proximity+labeling+in+living+cells+and+organisms+with+TurboID%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID.</a> Nature Biotechnology. 36 (9), 880-887 (2018).</li>
<li>Nakano, S., Niwa, M., Asano, Y., Ito, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Following+the+evolutionary+track+of+a+highly+specific+l-Arginine+oxidase+by+reconstruction+and+biochemical+analysis+of+ancestral+and+native+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Following the evolutionary track of a highly specific l-Arginine oxidase by reconstruction and biochemical analysis of ancestral and native enzymes.</a> Applied and Environmental Microbiology. 85 (12), 00459(2019).</li>
<li>Gingras, A. -C., Abe, K. T., Raught, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+to+know+the+neighborhood%3A+using+proximity-dependent+biotinylation+to+characterize+protein+complexes+and+map+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 48, 44-54 (2019).</li>
<li>Odeh, H. M., Coyaud, E., Raught, B., Matunis, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SUMO-specific+isopeptidase+SENP2+is+targeted+to+intracellular+membranes+via+a+predicted+N-terminal+amphipathic+%CE%B1-helix%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">The SUMO-specific isopeptidase SENP2 is targeted to intracellular membranes via a predicted N-terminal amphipathic α-helix.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (15), 1878-1890 (2018).</li>
<li>Motani, K., Kosako, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+stimulator+of+interferon+genes+%28STING%29+induces+ADAM17-mediated+shedding+of+the+immune+semaphorin+SEMA4D%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Activation of stimulator of interferon genes (STING) induces ADAM17-mediated shedding of the immune semaphorin SEMA4D.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7717-7726 (2018).</li>
</ol>

De auteurs verklaarden dat er geen sprake was van belangenverstrengeling.

In het huidige experiment werd AirID gebruikt voor nabijheidslabeling, die Kido et al. ontwikkelden door middel van een algoritme van voorouderlijke enzymreconstructie met behulp van een grote genoomdataset en vijf conventionele BirA-enzymen5. Willekeurige mutaties werden gebruikt in traditionele evolutionaire eiwitengineering om de activiteit te verbeteren 9,10 omdat willekeurige mutaties geen dynamische sequentieveranderingen kunnen vero...

Verschillende cellulaire eiwitten werken onder het biologisch regulerende systeem, en eiwit-eiwitinteracties (PPI's) maken deel uit van dit systeem en vormen de basis van veel cellulaire processen. Naast PPI's wordt de functie van natuurlijke eiwitten posttranslationeel bevorderd via verschillende modificaties, zoals de vorming van complex, ubiquitinatie en fosforylering. Daarom is het bestuderen van PPI's belangrijk voor het begrijpen van de mogelijke functie van doeleiwitten. PPI's zijn uitgevoerd met behulp van verschillende technologieën, zoals massaspectrometrie-analyse na immunoprecipitatie (IP-MS-analyse)1, gist-twee-hybride systeem (Y2H)2, ook celvrije arrays3. Deze methoden onderzochten verschillende essentiële bevindingen op het gebied van onderzoek. Deze methoden hebben echter enkele nadelen; Y2H is bijvoorbeeld een tijdrovende, dure strategie die het noodzakelijk maakt om de Y2H-bibliotheek van de doelsoort op te bouwen.
Bovendien maakt de Y2H-techniek gebruik van gist, een heteroloog eencellig eukaryoot organisme, dat de cellulaire toestand van hogere eukaryote cellen niet nauwkeurig kan weergeven. De IP-MS is ongeschikt voor eiwitten met een hoge hydrofobiciteit en vertoont een lage efficiëntie bij het opvangen van zwakke PPI's. Verschillende essentiële eiwitten in planten, zoals nucleotide-bindende domein en leucine-rijke repeat-bevattende (NLR) eiwitten en receptorachtige kinasen (RLK's) worden op een laag niveau tot expressie gebracht en interageren meestal tijdelijk met andere eiwitten; Daarom is het gebruik van deze methoden onvoldoende om de mechanismen te begrijpen die ten grondslag liggen aan de regulatie van deze eiwitten3.
Een nieuwe techniek genaamd proximity-biotinylatie (PB) helpt onderzoekers bij het identificeren van PPI's. PB is afhankelijk van PL-enzymen, die zich hechten aan het eiwit van belang (POI), en wanneer partnereiwit in de buurt van POI komt, hecht de PL een chemisch biotinelabel aan het partnereiwit. Verder kan het gelabelde eiwit worden geïdentificeerd en kan het snel weten welk partnereiwit zich hecht aan het doeleiwit5. Eerdere studies hebben aangetoond dat BioID en TurboID succesvolle hulpmiddelen zijn voor PPI's, vooral in planten, maar ze hebben bepaalde beperkingen4. BioID heeft een hoog gehalte aan biotine nodig voor het labelen van partnereiwitten, wat meer dan 16 uur duurt. In vergelijking met BioID is de TurboID voordeliger omdat het eiwit in 10 minuten labelt en het partnereiwit bij kamertemperatuur (RT) kan labelen. Het is onder bepaalde omstandigheden ook giftig voor cellen en labelt die eiwitten die geen interactie vertonen met het eiwit van belang.
Om deze problemen op te lossen, is AirID, ontwikkeld door Kido et al., efficiënter dan de rest van de etiketteringsenzymen, hoewel de sequentieovereenkomst 82% is tussen BioID en AirID5. Om de efficiëntie van AirID te controleren, voerden we een experiment uit door gebruik te maken van een POI met bekende medewerkers. Dit experiment bevestigde dat AirID ongetwijfeld geassocieerde eiwitten in plantencellen kon labelen. AirID is een waardevol enzym voor het analyseren van PPI's in vitro en in cellen. Het creëert minder toxiciteit en is minder foutief in tijdrovende processen dan TurboID om niet-partners te taggen, wat leidt tot het doden van de cel. Het toont aan dat AirID concurrerender is dan andere etiketteringsenzymen voor nabijheidsbiotinylering. Het is nauwkeuriger, heeft meer potentieel in tijdrovende processen en is minder toxisch in vitro en in levende cellen. Het huidige protocol beschrijft de identificatie van interagerende eiwitten van APRR2 met behulp van AirID als PL-enzym; bovendien kan de methode worden toegepast op andere eiwitten om PPI's in plantensoorten te onderzoeken.

<table><tbody><tr><td>Acetosyringone</td><td>Beijing solaribo science and technology Co.Ltd</td><td>S1519</td><td></td></tr><tr><td>Acryyl/Bis 30% oplossing</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd</td><td>1510KA4528</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>BioFroxx GmbH</td><td>D64683</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>tsingke (Shanghai) Co.Ltd</td><td>TSJ001</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumbicarbonaat</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd</td><td>G313BA0018</td><td></td></tr><tr><td>Biotine</td><td>BBI life Sciences</td><td>G908BA0012</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>BBI life Sciences</td><td>E209BA0008</td><td></td></tr><tr><td>Competent cellen GV3101</td><td>Gemaakt in het huidige experiment</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ontzoutingskolom</td><td>Thermo scientific</td><td>WC321753</td><td></td></tr><tr><td>Desoxycholzuur</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd</td><td>G818BA0029</td><td></td></tr><tr><td>DH5&alpha; competente cellen</td><td>Gemaakt in het huidige experiment</td><td></td><td>E.coli DH5&alpha;</td></tr><tr><td>&beta;-D-maltoside</td><td>Beijing Scolario Science and Tech Co.Ltd</td><td>S818</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd</td><td>E104BA0029</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd</td><td>161BA0031</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Beijing solaribo science and technology Co.Ltd</td><td>H8090</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd</td><td>H209BA0003</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Beijing solaribo science and technology Co.Ltd</td><td>M8019</td><td></td></tr><tr><td>MiraCloth</td><td>EMD Milipore Corp/MERCK kgAa Darmstadt, Germenay</td><td>3429963</td><td>Snel filter materiaal filter</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Beijing solaribo science and technology Co.Ltd</td><td>20200819</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd</td><td>H324BA0003</td><td></td></tr><tr><td>NP40</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd</td><td>N8030</td><td></td></tr><tr><td>Eiwitinhibitor cocktail</td><td>Beijing Scolario Science and Tech Co.Ltd</td><td>S3450</td><td></td></tr><tr><td>PVDF</td><td>BIO-RAD</td><td>5820172</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Beijing Scolario Science and Tech Co.Ltd</td><td>S1015</td><td></td></tr><tr><td>Silwet</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd</td><td>S9430</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidine-C1-geconjugeerde magnetische kralen</td><td>Enriching Biotechnology</td><td>7E511E1</td><td>Magnetische kralen</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Servicebio</td><td>G2056</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd</td><td>GB03BA007</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd</td><td>F828BA0020</td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Thermo scientific</td><td>LP0042</td><td></td></tr></tbody></table>

airid-gebaseerde nabijheidsetikettering voor eiwit-eiwitinteractie in planten

AirID-Based Proximity Labeling for Protein-Protein Interaction in Plants

In zoogdiercellen en -planten zijn benaderingen van nabijheidsetikettering (PL) met behulp van gemodificeerd ascorbaatperoxidase (APEX) of de Escherichia coli-biotineligase BirA (bekend als BioID) succesvol gebleken bij het identificeren van eiwit-eiwitinteracties (PPI's). APEX, BioID en TurboID, een herziene versie van BioID, hebben naast waardevolle technologieën ook enkele beperkingen. De recent ontwikkelde AirID, een nieuwe versie van BioID voor nabijheidsidentificatie in eiwit-eiwitinteracties, heeft deze beperkingen overwonnen. Eerder werd AirID gebruikt in diermodellen, terwijl de huidige studie het gebruik van AirID in planten aantoont, en de resultaten bevestigden dat AirID beter presteert in plantsystemen in vergelijking met andere PL-enzymen zoals BioID en TurboID voor eiwitetikettering die proximaal zijn van de doeleiwitten. Hier is een stapsgewijs protocol voor het identificeren van eiwitinteractiepartners met behulp van AT4G18020 (APRR2) eiwit als model. De methoden beschrijven de constructie van vector, de transformatie van construct door agro-infiltratie, biotinetransformatie, extractie van eiwitten en verrijking van biotine-gelabelde eiwitten door middel van affiniteitszuiveringstechniek. De resultaten concluderen dat AirID een nieuw en ideaal enzym is voor het analyseren van PPI's in planten. De methode kan worden toegepast om andere eiwitten in planten te bestuderen.

Volgens eerder onderzoek is het komkommergen APRR2 het kandidaat-gen dat de kleur van witte onrijpe vruchten regelt8. Hier werd een protocol ontwikkeld met behulp van AirID als een nabijheidslabelenzym om het interagerende partnereiwit van APRR2 in komkommer te vinden. Het construct werd overgebracht naar de komkommerbladeren en na 36 uur na infiltratie werd biotine overgebracht. Na 48 uur werden de monsters genomen voor western blot-analyse om de succesvolle transformatie te bev...

Hier presenteren we een stapsgewijs protocol voor het uitvoeren van het proximity-labeling (PL)-experiment in komkommer (Cucumis sativus L.) met behulp van AT4G18020 (APRR2)-AirID-eiwit als model. De methode beschrijft de constructie van een vector, de transformatie van een construct door agro-infiltratie, biotine-infiltratie, eiwitextractie en zuivering van biotine-gelabelde eiwitten door middel van affiniteitszuiveringstechniek.

AirID-gebaseerde nabijheidsetikettering voor eiwit-eiwitinteractie in planten

In mammalian cells and plants, proximity labeling (PL) approaches using modified ascorbate peroxidase (APEX) or the Escherichia coli biotin ligase BirA ...

AirID is een waardevol enzym voor eiwit-eiwitinteractie, en het creëert minder toxiciteit en minder fouten in tijdgebonden processen dan andere nabijheidslabelende enzymen. Er wordt een stapsgewijs protocol gepresenteerd voor het uitvoeren van het nabijheidslabeling-experiment in komkommer of Cucumis sativus met AT4G18020 APRR2-AirID-eiwit als model. Ahmad Zada, Imran Khan, Yuting Cheng en Min Zhang uit mijn laboratorium zullen de procedure demonstreren.Begin met het overbrengen van de Cucumis sativus- of komkommerzaden in water, broed ze 20 minuten uit bij 50 graden Celsius en plaats de zaden vervolgens 12 tot 16 uur op het filtreerpapier op een petriplaat. Breng de zaden later over naar potten met aarde en kweek ze in een klimaatkamer bij 23 graden Celsius in een fotoperiode van 16 uur licht en 18 uur donker gedurende drie tot vier weken. Breng 2,5 microliter van het plasmide EarleyGate 100 over naar de competente cellen van de agrobacterium tumefaciens GV3101-stam.Incubeer de buis 30 minuten op ijs voordat u deze gedurende drie minuten overbrengt naar vloeibare stikstof. Om de hitteschok te geven, brengt u de buis gedurende vijf minuten over naar de incubator bij 37 graden Celsius. Plaats de buis vervolgens twee minuten op ijs.Voeg 1.000 microliter Luria Bertani of LB-medium toe aan de door hitte geschokte agrobacteriumcellen. Nadat u de cellen een uur lang bij 30 graden Celsius en 118 RPM hebt geïncubeerd, centrifugeert u ze gedurende twee minuten bij 3000 G bij vier graden Celsius. Gooi vervolgens het supernatans van 800 microliter weg en meng de resterende oplossing.Plaat het op het LB-medium aangevuld met 50 microgram per milliliter kanamycine en gentamycine elk en 25 microgram per milliliter rifampicine. Incubeer de platen 48 uur bij 30 graden Celsius. Pak wat bacteriekolonies van de borden.Leg ze in LB vloeibare media, aangevuld met geschikte antibiotica en incubeer vloeibare LB bij 30 graden Celsius en 218 RPM gedurende 36 tot 48 uur. Na twee minuten centrifugeren bij 3.000 G bij vier graden Celsius, resuspendeert u de pellet in een agro-infiltratiebuffer om de optische dichtheid aan te passen aan een dichtheid op een golflengte van 600 nanometer. Infiltreer met een naaldloze spuit van één milliliter de gehele epidermis van het abaxiale oppervlak met 1,5 milliliter van het geresuspendeerde agrobacteriële inoculum.Houd de planten in de klimaatkamer op 23 graden Celsius met 75 micromol per vierkante meter per seconde licht gedurende 16 uur in donkere omstandigheden gedurende acht uur Infiltreer na 36 uur een milliliter van vijf microgram biotine in de reeds gefilterde bladeren. Snijd na vier tot 12 uur biotine-infiltratie de bladeren af en breng ze snel over naar vloeibare stikstof om eiwitafbraak te voorkomen. Maal de bladeren met een vijzel en voeg snel twee milliliter PBS BSA van pH 7,4 toe, gevolgd door langzaam malen.Breng het monstermengsel over naar een conische buis van 15 milliliter door een filter voor snel filtratiemateriaal dat erop is geplaatst en houd de buis op ijs. Breng de monsters over in een buis van twee milliliter. Voeg een cocktail van 1%-eiwitremmers toe en meng de inhoud door de buis zeven tot acht keer op en neer te draaien voordat u deze centrifugeert.Als je klaar bent, breng je het supernatans over in een nieuwe buis van twee milliliter en voeg je 10% bèta-D-maltoside toe. Leg de tube vijf minuten op ijs en centrifugeer vervolgens gedurende 10 minuten bij 20.000 G bij vier graden Celsius. Om de ontziltingskolom in evenwicht te brengen, markeert u een kant van de kolom en centrifugeert u deze met de gemarkeerde kant naar buiten gericht.Verwijder de boven- en onderkant van de kolom en centrifugeer opnieuw bij 1.000 G gedurende twee minuten bij vier graden Celsius. Gooi de vloeibare oplossing uit de opvangbuis van de kolom en was de buis met vijf milliliter PBS-buffer met centrifugeren zoals eerder gedemonstreerd, ten minste vijf keer. Voeg een milliliter PBS BSA toe aan 50 microliter Streptavidin-C1-geconjugeerde magnetische kralen in een tube van 1,5 milliliter en meng dit grondig.Plaats de buis gedurende drie minuten op een magnetische standaard om de kralen aan één kant van de buis te absorberen. Gooi het supernatans van de andere kant weg en herhaal deze PBS BSA-wasbeurt driemaal. Om het gebiotinyleerde eiwit te verrijken, voegt u twee milliliter van de monsters toe aan de kolom.Voeg na het centrifugeren van de kolom bij 1000 G gedurende acht minuten bij vier graden Celsius een milliliter ontzouten eiwitextract toe aan 50 microliter Streptavidin-C1-geconjugeerde magnetische parels. Meng de oplossing grondig door de buis met magnetische kralen gedurende 30 minuten op normale snelheid en kamertemperatuur op de rotator te plaatsen. Plaats vervolgens de kralen drie minuten op het magnetische rek bij kamertemperatuur of totdat ze zich aan één kant van de buis verzamelen.Verwijder voorzichtig het supernatans en voeg een milliliter wasbuffer één toe. Draai de buis twee minuten op een rotator en herhaal de stap die op het magnetische rek wordt uitgevoerd om het supernatant te verwijderen. Voer op dezelfde manier de wasbeurten uit met één milliliter wasbuffers twee en drie, zoals eerder gedemonstreerd.Verwijder vervolgens het wasmiddel in de wasbuffers door 1,7 milliliter 50 millimolair trishydrochloride toe te voegen en de stap op het magnetische rek te herhalen. Geef zes wasbeurten van elk twee minuten met één milliliter 50 millimolair ammoniumbicarbonaatbuffer. Als je klaar bent, voeg je 50 microliter van het eiwitextract met 50 millimolair trishydrochloride, 12% sucrose, 2% lithiumlaurylsulfaat en 1,5% dithiothreitol toe aan de kralen en plaats je de buis vijf minuten in de incubator bij 100 graden Celsius om een hitteschok te geven.Na het herhalen van de stap op een magnetisch rek, bewaart u het supernatans bij min 80 graden Celsius voor LCMS/MS-analyse. De western blot-analyse van de geëxtraheerde eiwitten toonde succesvolle eiwitexpressie en biotinylering in de geïnfiltreerde komkommerbladeren. Het hogere expressieniveau van gelabelde eiwitten en extra banden in vergelijking met de controle bevestigden de succesvolle tagging van de doeleiwitten van het gen van belang door AirID.De resultaten werden bevestigd met behulp van anti-vlag- en antimassa-antilichamen die de doelband met een anti-vlag-antilichaam in alle getransformeerde monsters lieten zien. Na het verrijken van gebiotinyleerde eiwitten met Streptavidin-C1-geconjugeerde magnetische kralen, werden meerdere eiwitten van verschillende grootte waargenomen. Uit alle resultaten werd geconcludeerd dat AirID een nieuw en ideaal enzym is voor het analyseren van eiwit-eiwitinteracties in planten.Tijdens het nabijheidslabeling-experiment is het belangrijk om te onthouden dat vijf micromolaire biotine en HR-duur ideaal zijn. Het protocol schetst de stapsgewijze installatie van op AirID gebaseerde nabijheidsetikettering in de fabriek, inclusief de voorbereiding van het bladmonster, het verwijderen van pre-biotine, het kwantificeren van extracteiwit en het verrijken van gebiotinyleerde eiwitten. AirID zal naar verwachting de nauwkeurigheid van PPI-onafhankelijke biotinylering in combinatie verbeteren.Er wordt geconcludeerd dat AirID ideaal is voor PPI-analyse in planten.

airid-based-proximity-labeling-for-protein-protein-interaction

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We hebben een techniek ontwikkeld om eiwit-eiwit interacties in planten te testen. Een geel fluorescerend eiwit (YFP) wordt opgesplitst in twee niet-overlappende fragmenten. Elk fragment is gekloond in-frame aan een gen van belang via de Gateway-systeem, waardoor de expressie van fusie-eiwitten. Reconstitutie van YFP-signaal treedt alleen op wanneer de lijkschouwing eiwitten met elkaar omgaan.

Detectie van eiwit interacties in Plant met behulp van een Gateway-compatibele Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie (BiFC) Systeem

Wij presenteren een variatie van de QUICK (kwantitatieve Immunoprecipitatie combinatie met Knockdown) benadering die eerder werd onderscheid te maken tussen echte en valse eiwit-eiwit interacties. Onze aanpak is gebaseerd...

Een protocol voor de identificatie van eiwit-eiwit interacties op basis van<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabole Labeling, Immunoprecipitatie, kwantitatieve Massaspectrometrie en Affiniteit Modulatie

This video describes the proximity ligation assay to study in situ protein-protein interactions in nematode cells. The close proximity of the proteins of interest generates the circular DNA template with the help of a PLA probe attached to a secondary antibody. The probe is further amplified using the amplification solution, which produces a long single-stranded DNA followed by the hybridization of the detector probe, enabling the localization of protein-protein interactions in cells.

Proximity Ligation Assay to Study In Situ Protein-Protein Interactions

Vorming van eiwitcomplexen in vivo kan worden gevisualiseerd door bimoleculaire fluorescentie complementatie. Interactie partners gefuseerd aan complementaire delen van fluorescente labels en tijdelijk tot expressie gebracht in tabaksbladeren, waardoor een opnieuw fluorescentiesignaal op nabijheid van de twee eiwitten.

Eiwit-eiwit interacties gevisualiseerd door Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie in Protoplasten en Bladeren Tabak

Chromatine immunoprecipitatie is een krachtige techniek voor de identificatie van DNA-bindingsplaatsen van Arabidopsis eiwitten in vivo. Deze procedure omvat chromatine verknoping en fragmentatie, selectieve immunoprecipitatie met antilichamen tegen het eiwit van belang en qPCR analyse van gebonden DNA. We beschrijven een eenvoudige ChIP assay geoptimaliseerd voor Arabidopsis planten.

Chromatine immunoprecipitatie assay voor de identificatie van Arabidopsis eiwit-DNA interacties<em&gt; In Vivo</em

Hier presenteren wij een interactief capture protocol toegepast op Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasten. Deze methode berust op in vivo UV-verknoping en staat voor isolatie en identificatie van plantaardige mRNA-bindende eiwitten uit een fysiologische omgeving.

MRNA Interactome Capture van Plant Protoplasts

Dit manuscript beschrijft een gemakkelijke en snelle experimentele procedure voor het bepalen van de eiwit-eiwitinteractie gebaseerd op de meting van luciferase activiteit.

Luciferase complementatie Imaging Assay in Nicotiana benthamiana bladeren voor Transient bepalen eiwit-eiwit interactie Dynamics

Wij bieden een stapsgewijze protocol voor split-BioID, een eiwit fragmenten-complementatie test gebaseerd op de nabijheid-labeling techniek BioID. Geactiveerd op de interactie tussen twee bepaalde eiwitten, hierdoor de proteomics analyse van context-afhankelijke eiwitcomplexen in hun inheemse cellulaire omgeving. De methode is eenvoudig, kosteneffectief en vereist alleen gebruikelijke laboratoriumbenodigdheden.

Split-BioID — Proteoom analyse van Context-specifieke eiwitcomplexen in hun inheemse cellulaire omgeving

Eiwit-eiwit en eiwit-metaboliet interacties zijn cruciaal voor alle cellulaire functies. Hierin beschrijven we een protocol waarmee parallelle analyse van deze interacties met een eiwit van keuze. Ons protocol is geoptimaliseerd voor de plant celculturen en affiniteit zuivering combineert met massa spectrometrie gebaseerde eiwitten en metaboliet detectie.

2 in 1: stap zuivering van de affiniteit voor de parallelle analyse van eiwit-eiwit en eiwit-metaboliet complexen

Hier beschreven is een nabijheid etikettering methode voor de identificatie van interactie partners van de TIR domein van de NLR immuunreceptor in Nicotiana benthamiana bladweefsel. Ook is een gedetailleerd protocol voor de identificatie van interacties tussen andere eiwitten van belang met behulp van deze techniek in Nicotiana en andere plantensoorten.

TurboID-Based Proximity Labeling voor in Planta Identificatie van Protein-Protein Interaction Networks

In deze studie stellen we een gedetailleerd protocol op voor op TurboID gebaseerde nabijheidslabeling (PL) in de eierstok van D. melanogaster , dat stappen omvat van biotinesuppletie en eierstokdissectie tot validatie van transgenexpressie en verrijking van gebiotinyleerde peptiden voor massaspectrometrie.

In vivo Toepassing van op TurboID gebaseerde nabijheidsetikettering in Drosophila melanogaster

Leer nabijheidsetikettering met AirID voor eiwit-eiwitinteracties in komkommer (Cucumis sativus). Dit protocol toont vectorconstructie, agro-infiltratie en biotine-labeling voor succesvolle proteïne-tagging in planten.

AirID-gebaseerde nabijheidsetikettering voor eiwit-eiwitinteractie in planten

Meer video's verkennen