Name: Multi-foton laserablatie van cytoplasmatische microtubule organiserende centra in muizenoöcyten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-11T14:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Leer cytoplasmatische microtubule organiserende centra ablateren in muizenoöcyten met een femtoseconde laser. Deze methode biedt hoge ruimtelijke nauwkeurigheid met minimale fototoxiciteit voor het bestuderen van eicelmejose.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen alle leden van het Balboula laboratorium bedanken voor hun waardevolle hulp en discussies. De auteurs bedanken Melina Schuh voor het vriendelijk delen van de mCherry-Cep192 constructie. Deze studie werd ondersteund door R35GM142537 (NIGMS, NIH) aan AZB.

Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door de Universiteit van Missouri (Animal Care Quality Assurance Ref. Nummer 9695). Cep192-eGFP reporter vrouwelijke muizen van 6-8 weken oud werden gebruikt in de huidige studie. Om Cep192-eGFP-reportermuizen te genereren, werd CRISPR / Cas9-gemedieerde homologie-gerichte reparatie gebruikt om het EGFP-reporter-gen in het CF-1-muizengenoom te integreren. De EGFP-verslaggever werd gefuseerd op het C-eindpunt van Cep192 (een integraal onderdeel van MTOCs)15. Om de muizenkolonie in stand te houden, werden homozygote Cep192-eGfp reportermuizen gebruikt. Alle dieren werden gehouden in kooien (maximaal vier dieren/kooien) bij 21 °C en 55% luchtvochtigheid, met een licht/donkercyclus van 12 uur en ad libitum toegang tot voedsel en water.
1. Verzameling van muizenocyten
<ol><li>Bereid het kweekmedium (Chatot, Ziomek en Bavister, CZB19, zie de tabel met materialen) en incubeer het bij 37 °C en 5% CO2 's nachts. OPMERKING: Het CZB-medium kan gedurende 1 maand bij 4 °C worden bewaard (zie aanvullend dossier 1 voor de mediasamenstelling).</li>
	<li>Vul het CZB-medium aan met glutamine (1 mM) en milrinon (2,5 mM) (CZB + M) (zie materiaaltabel) en plaats het in de incubator. OPMERKING: Milrinon is een fosfodiësteraseremmer die de eicellen in profase I in stand houdt en meiotische hervatting voorkomt20.</li>
	<li>Bereid het verzamelmedium (bicarbonaatvrij minimaal essentieel medium, MEM) met 3 mg/ml polyvinylpyrolidon (PVP), 25 mM HEPES (pH 7,3) (aanvullend dossier 1) en milrinon (2,5 mM) (MEM/PVP + M, zie de materiaaltabel).</li>
	<li>Bereid de verzamel- en kweekschalen, maak vier microdruppels (100 μL) verzamelmedium (MEM/PVP + M) en twee microdruppels (100 μL) cultuurmedium (CZB + M) in respectievelijk 60 mm en 35 mm petrischalen en bedek ze met minerale olie (zie Materiaaltabel). Houd de opvangschaal op de schuifwarmer en zet de kweekschaal in de broedmachine bij 37 °C en 5% CO2.</li>
	<li>Injecteer intraperitoneaal 5 IE van serumgonadotrofine (PMSG, zie de tabel met materialen) in geslachtsrijpe (6-8 weken oude) Cep192-eGFP-verslaggever vrouwelijke muizen 44-48 uur vóór het verzamelen van eicellen.</li>
	<li>Offer de muizen op door cervicale dislocatie, identificeer en verwijder de eierstokken21 en breng ze over in een horlogeglas met voorbewarmd verzamelmedium (MEM / PVP + M) bij 37 ° C.</li>
	<li>Bevestig de eierstok door een spuit van 1 ml op de bodem van het horlogeglas aan te raken en deze meerdere keren (~ 40 keer per eierstok) te doorboren met behulp van naainaalden die bij elkaar zijn gebundeld om de eicellen in het medium vrij te maken.</li>
	<li>Breng met behulp van een plastic transferpipet al het medium met de cumulus-eicelcomplexen (COC's) uit stap 1.7 over in een lege plastic petrischaal van 100 mm.</li>
	<li>Verzamel onder een stereomicroscoop de COC's met behulp van een Pasteur-glazen pipet en breng ze over naar de verzamelschaal die MEM / PVP + M bevat.</li>
	<li>Gebruik een smalle Pasteur glazen pipet (ongeveer 100 μm in diameter) denud de eicellen mechanisch door voorzichtig repetitief pipetteren, gevolgd door ze over te brengen en te wassen in vier microdruppels van (100 μL) MEM / PVP + M (de verzamelschaal) voordat ze in de CZB + M-kweekschaal worden overgebracht.</li>
	<li>Incubeer de ontblote eicellen gedurende 1 uur bij 37 °C met 5% CO2 in de lucht.</li>
</ol>2. Oöcyten micro-injectie
<ol><li>Plaats een druppel MEM/PVP + M van 250 μL in een 100 mm plastic petrischaaldeksel en bedek het met minerale olie. OPMERKING: Het petrischaaldeksel heeft een onderste rand die meer ruimte biedt voor het aanpassen van de micromanipulator.</li>
	<li>Schakel het micro-injectiesysteem in (zie de tabel met materialen).</li>
	<li>Plaats de micro-injectieschaal op het opwarmingsstadium (37 °C) van de microscoop.</li>
	<li>Laad de injectienaald met 0,5 μL mCh-Cep192cRNA met behulp van pipetpunten van microladers (zie Materiaaltabel) en bevestig de injectienaald aan de micromanipulator.</li>
	<li>Breng de ontblote eicellen (stap 1.11) over naar de microdruppel van 250 μL (stap 2.1).</li>
	<li>Stel onder een lens van 20x of 40x de positie en de focus van de injectie- en houdnaalden aan op basis van de positie van de eicel (figuur 1).</li>
	<li>Stel de micro-injectie-eenheid in en stel de injectiedruk (pi), compensatiedruk (pc) en injectietijd (ti) in om 5-10 pl mCh-Cep192 cRNA te kunnen injecteren (om de MTOCs exogene te labelen).</li>
	<li>Injecteer de eicellen voorzichtig zonder de kern aan te raken.</li>
	<li>Zodra alle eicellen zijn geïnjecteerd, wast u ze in drie microdruppels CZB + M, brengt u ze over naar de kweekschaal (CZB + M) en incubeert u ze gedurende 3 uur bij 37 °C om mCh-Cep192-expressie mogelijk te maken.</li>
</ol>3. Rijping van eicellen
<ol><li>Bereid het rijpingsmedium voor door glutamine (1 mM) toe te voegen aan CZB-medium dat vooraf in evenwicht is gebracht in een incubator met 5% CO2 in lucht bij 37 °C gedurende ten minste 3 uur.</li>
	<li>Maak twee microdruppels (100 μL) van het rijpingsmedium in een petrischaaltje van 35 mm en bedek ze met minerale olie (rijpingsschaal).</li>
	<li>Was profase I-arresteerde eicellen ten minste drie keer in 100 μL milrinonvrije CZB-microdruppels om het milrinon volledig te verwijderen en meiotische hervatting mogelijk te maken.</li>
	<li>Breng de eicellen over naar de rijpingsschaal en incubeer ze gedurende 5 uur (prometafase I-stadium) in een bevochtigde incubator met 5% CO2 in lucht bij 37 °C.</li>
</ol>4. Oöcytenvoorbereiding voor ablatie en beeldvorming
<ol><li>Breng de prometafase I-eicellen (stap 3.4) over naar een kweekschaal met glazen bodem die 100 μL rijpingsmedium (stap 3.1) bedekt met minerale olie bevat.</li>
</ol>5. Microscoopvoorbereiding voor ablatie
<ol><li>Schakel ten minste 30 minuten voor de ablatie de temperatuurregelaar voor de stage-incubator in (zie Materiaaltabel) en stel deze in op 37 °C.</li>
	<li>Schakel de CO2-controller in en stel deze in op 5% CO2.</li>
	<li>Selecteer een 40x olie-onderdompeling apochromatisch doel en breng een kleine druppel van de dompelolie aan.</li>
	<li>Monteer de kweekschaal met glazen bodem met de eicellen op een stage-top incubator en bedek de incubator met een gasdeksel.</li>
	<li>Selecteer in de software voor het verkrijgen van afbeeldingen (zie de tabel met materialen) een optie waarmee meerdere faseposities kunnen worden opgeslagen (bijvoorbeeld "Markering definiëren en experiment zoeken"). Met behulp van doorgelaten licht brightfield-verlichting, centreer je op de individuele eicellen en sla je hun posities op.</li>
	<li>Selecteer in de software voor het verkrijgen van afbeeldingen de XYZ-scanmodus , stel het beeldformaat in op 256 x 256 pixels, stel de zoomfactor in op 2,5x - 3,0x en selecteer een scanfrequentie van 600 Hz. Dit komt overeen met een pixel dwell time van ongeveer 1,6 μs.</li>
	<li>Stel een excitatielaserlijn van 488 nm in op ongeveer 10% van het laservermogen (wat overeenkomt met 4,0 μW op monsterniveau) (zie Tabel met materialen) en gebruik een spectrale bandbreedte van 500-550 nm om het GFP-signaal van de MTOCs te observeren. Voor de gelijktijdige waarneming van fluorescentie van de mCherry-gelabelde Cep192, stelt u een 585 nm excitatielaserlijn in op ongeveer 8% van het laservermogen (wat overeenkomt met 10,7 μW op monsterniveau) en gebruikt u een andere detector die is ingesteld op een spectrale bandbreedte van 595-645 nm. OPMERKING: Het is nuttig om de toegezonden lichtdetector (TLD) van de confocale microscoop te gebruiken voor het gelijktijdig detecteren van eicelgrenzen.</li>
	<li>Met behulp van een live scanmodus en de handmatige bediening van de z-drive, screent u de eicel op MTOCs.</li>
	<li>Zodra een mcMTOC is gedetecteerd, tekent u er een vierkant gebied van belang (ROI) omheen.</li>
</ol>6. Ablatie van mcMC's
<ol><li>Stel een femtosecondelaser in op een golflengte van 740 nm. OPMERKING: De lasergolflengte kan worden gewijzigd volgens de microscoop en de lasercondities.</li>
	<li>Gebruik de elektro-optische modulator van de multi-fotonenmicroscoop (zie Tabel van materialen) om het laservermogen in te stellen op 70% -80%, wat overeenkomt met 60-70 mW vermogen op het monstervlak. OPMERKING: Als de laser is uitgerust met een femtoseconde pulscompensator, gebruik deze dan om te corrigeren voor groepsvertragingsdispersie (GDD). GDD-correctie vermindert de hoeveelheid laservermogen die nodig is voor efficiënte mcMTOC-ablatie en minimaliseert fotoschade aan de eicel. De GDD-besturing is meestal geïntegreerd met de beeldacquisitiesoftware van commerciële multi-fotonenmicroscopen.</li>
	<li>Gebruik dezelfde afbeeldingsindeling, zoomfactor en scanfrequentie als in stap 5.6. Stel de parameters voor lijn- en framegemiddelde in op 1.</li>
	<li>Klik op de knop Scannen in de software om de ablatie van de mcMTOC uit te voeren door een enkele laserscan van de geselecteerde ROI uit te voeren.</li>
	<li>Gebruik de kanaalinstellingen uit stap 5.7 om de resultaten van de ablatie te bekijken door de afbeeldingen van de GFP-gelabelde structuren te vergelijken die vóór en na de laserblootstelling met meerdere fotonen zijn gemaakt. Als de ablatie succesvol is, neemt de intensiteit van de GFP-fluorescentie in het beoogde mcMTOC af tot de niveaus die op de achtergrond worden waargenomen.</li>
	<li>Als er nog fragmenten van een GFP-labelstructuur overblijven, herhaalt u stap 6.4 een of meer keer door te focussen op verschillende z-vlakken van de mcMTOC.</li>
	<li>Gebruik de kanaalinstellingen uit stap 5.7 om de ablatie-efficiëntie te verifiëren door het volledige verlies van mcMTOC-geassocieerde mCherry-signalen (mCh-Cep192).</li>
	<li>Herhaal stap 5.8 tot stap 6.7 totdat alle MTCC's van een eicel (op verschillende focale vlakken) zijn geableerd. OPMERKING: Dit protocol gebruikt mCh-Cep192 micro-injectie als een strategie om mcMTOC-uitputting na blootstelling aan multi-fotonenlaser te bevestigen en de mogelijkheid uit te sluiten dat het verlies van GFP-fluorescentie wordt veroorzaakt door GFP-fotobleaching. De micro-injectie van deze sonde is echter optioneel en niet vereist voor de ablatieprocedure.</li>
</ol>

<ol><li>Bennabi, I., Terret, M. E., Verlhac, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+spindle+assembly+and+chromosome+segregation+in+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Meiotic spindle assembly and chromosome segregation in oocytes.</a> Journal of Cell Biology. 215 (5), 611-619 (2016).</li>
<li>Hashimoto, N., Kishimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+meiotic+metaphase+by+a+cytoplasmic+maturation-promoting+factor+during+mouse+oocyte+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of meiotic metaphase by a cytoplasmic maturation-promoting factor during mouse oocyte maturation.</a> Development Biology. 126 (2), 242-252 (1988).</li>
<li>Kitajima, T. S., Ohsugi, M., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+kinetochore+tracking+reveals+error-prone+homologous+chromosome+biorientation+in+mammalian+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Complete kinetochore tracking reveals error-prone homologous chromosome biorientation in mammalian oocytes.</a> Cell. 146 (4), 568-581 (2011).</li>
<li>Azoury, J., Verlhac, M. H., Dumont, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+filaments%3A+Key+players+in+the+control+of+asymmetric+divisions+in+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Actin filaments: Key players in the control of asymmetric divisions in mouse oocytes.</a> Biology of the Cell. 101 (2), 69-76 (2009).</li>
<li>Li, H., Guo, F., Rubinstein, B., Li, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin-driven+chromosomal+motility+leads+to+symmetry+breaking+in+mammalian+meiotic+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Actin-driven chromosomal motility leads to symmetry breaking in mammalian meiotic oocytes.</a> Nature Cell Biology. 10 (11), 1301-1308 (2008).</li>
<li>Schuh, M., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+model+for+asymmetric+spindle+positioning+in+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A new model for asymmetric spindle positioning in mouse oocytes.</a> Current Biology. 18 (24), 1986-1992 (2008).</li>
<li>Pimenta-Marques, A., Bettencourt-Dias, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericentriolar+material%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Pericentriolar material.</a> Current Biology. 30 (12), 687-689 (2020).</li>
<li>Hinchcliffe, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+centrosome+and+bipolar+spindle+assembly%3A+Does+one+have+anything+to+do+with+the+other%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">The centrosome and bipolar spindle assembly: Does one have anything to do with the other.</a> Cell Cycle. 10 (22), 3841-3848 (2011).</li>
<li>Szollosi, D., Calarco, P., Donahue, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+centrioles+in+the+first+and+second+meiotic+spindles+of+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Absence of centrioles in the first and second meiotic spindles of mouse oocytes.</a> Journal of Cell Science. 11 (2), 521-541 (1972).</li>
<li>Schuh, M., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+MTOCs+replaces+centrosome+function+during+acentrosomal+spindle+assembly+in+live+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Self-organization of MTOCs replaces centrosome function during acentrosomal spindle assembly in live mouse oocytes.</a> Cell. 130 (3), 484-498 (2007).</li>
<li>Clift, D., Schuh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-step+MTOC+fragmentation+mechanism+facilitates+bipolar+spindle+assembly+in+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A three-step MTOC fragmentation mechanism facilitates bipolar spindle assembly in mouse oocytes.</a> Nature Communications. 6, 7217(2015).</li>
<li>Luksza, M., Queguigner, I., Verlhac, M. H., Brunet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rebuilding+MTOCs+upon+centriole+loss+during+mouse+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Rebuilding MTOCs upon centriole loss during mouse oogenesis.</a> Developmental Biology. 382 (1), 48-56 (2013).</li>
<li>Balboula, A. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haspin+kinase+regulates+microtubule-organizing+center+clustering+and+stability+through+Aurora+kinase+C+in+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Haspin kinase regulates microtubule-organizing center clustering and stability through Aurora kinase C in mouse oocytes.</a> Journal of Cell Science. 129 (19), 3648-3660 (2016).</li>
<li>Breuer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HURP+permits+MTOC+sorting+for+robust+meiotic+spindle+bipolarity%2C+similar+to+extra+centrosome+clustering+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">HURP permits MTOC sorting for robust meiotic spindle bipolarity, similar to extra centrosome clustering in cancer cells.</a> Journal of Cell Biology. 191 (7), 1251-1260 (2010).</li>
<li>Londoño-Vásquez, D., Rodriguez-Lukey, K., Behura, S. K., Balboula, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+organizing+centers+regulate+spindle+positioning+in+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Microtubule organizing centers regulate spindle positioning in mouse oocytes.</a> Developmental Cell. 57 (2), 197-211 (2022).</li>
<li>Konig, K., Riemann, I., Fischer, P., Halbhuber, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+nanosurgery+with+near+infrared+femtosecond+laser+pulses%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Intracellular nanosurgery with near infrared femtosecond laser pulses.</a> Cellular and Molecular Biology. 45 (2), 195-201 (1999).</li>
<li>Galbraith, J. A., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+damage+in+thick+specimens+by+multiphoton+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation.</a> Molecular Biology of the Cell. 14 (5), 1808-1817 (2003).</li>
<li>Maghelli, N., Tolic-Norrelykke, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+ablation+of+the+microtubule+cytoskeleton%3A+Setting+up+and+working+with+an+ablation+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Laser ablation of the microtubule cytoskeleton: Setting up and working with an ablation system.</a> Methods in Molecular Biology. 777, 261-271 (2011).</li>
<li>Chatot, C. L., Ziomek, C. A., Bavister, B. D., Lewis, J. L., Torres, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+culture+medium+supports+development+of+random-bred+1-cell+mouse+embryos+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Reproduction+and+Fertility%22%5BJournal%5D)">An improved culture medium supports development of random-bred 1-cell mouse embryos in vitro.</a> Journal of Reproduction and Fertility. 86 (2), 679-688 (1989).</li>
<li>Tsafriri, A., Chun, S. Y., Zhang, R., Hsueh, A. J., Conti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte+maturation+involves+compartmentalization+and+opposing+changes+of+cAMP+levels+in+follicular+somatic+and+germ+cells%3A+Studies+using+selective+phosphodiesterase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Oocyte maturation involves compartmentalization and opposing changes of cAMP levels in follicular somatic and germ cells: Studies using selective phosphodiesterase inhibitors.</a> Developmental Biology. 178 (2), 393-402 (1996).</li>
<li>Greaney, J., Subramanian, G. N., Ye, Y., Homer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+in+vitro+culture+of+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protocol%22%5BJournal%5D)">Isolation and in vitro culture of mouse oocytes.</a> Bio Protocol. 11 (15), 4104(2021).</li>
<li>Khodjakov, A., Cole, R. W., Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synergy+of+technologies%3A+Combining+laser+microsurgery+with+green+fluorescent+protein+tagging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motility+and+the+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">A synergy of technologies: Combining laser microsurgery with green fluorescent protein tagging.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 38 (4), 311-317 (1997).</li>
<li>Pavin, N., Tolic, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanobiology+of+the+mitotic+spindle%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanobiology of the mitotic spindle.</a> Developmental Cell. 56 (2), 192-201 (2021).</li>
<li>Khodjakov, A., Cole, R. W., Oakley, B. R., Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosome-independent+mitotic+spindle+formation+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Centrosome-independent mitotic spindle formation in vertebrates.</a> Current Biology. 10 (2), 59-67 (2000).</li>
<li>Aist, J. R., Liang, H., Berns, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astral+and+spindle+forces+in+PtK2+cells+during+anaphase+B%3A+a+laser+microbeam+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Astral and spindle forces in PtK2 cells during anaphase B: a laser microbeam study.</a> Journal of Cell Science. 104, 1207-1216 (1993).</li>
<li>Bennabi, I., Manil-Segalen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+Ablation+of+microtubule-chromosome+attachment+in+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Laser Ablation of microtubule-chromosome attachment in mouse oocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 1818, 153-161 (2018).</li>
<li>Milas, A., Jagric, M., Martincic, J., Tolic, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+reversible+knocksideways%2C+laser+ablation%2C+and+photoactivation+on+the+mitotic+spindle+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Optogenetic reversible knocksideways, laser ablation, and photoactivation on the mitotic spindle in human cells.</a> Methods in Cell Biology. 145, 191-215 (2018).</li>
<li>Warzych, E., Lipinska, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+metabolism+of+follicular+environment+during+oocyte+growth+and+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Reproduction+and+Development%22%5BJournal%5D)">Energy metabolism of follicular environment during oocyte growth and maturation.</a> Journal of Reproduction and Development. 66 (1), 1-7 (2020).</li>
<li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.

Er bestaan verschillende methoden om de cytoskelet-gerelateerde structuren in cellen 22,23,24,25 te verstoren. Het vinden van efficiënte technieken om de beoogde structuur selectief te verstoren zonder de levensvatbaarheid van de cel in gevaar te brengen, is echter een uitdaging. De hier gepresenteerde multi-foton laserablatiemethode is een efficiënte strategie om een selectieve mechanische verstoring van mcMTOCs in de eicel te induceren zonder de levensvatbaarheid van de eicel te veranderen.
Laserablatie is op grote schaal gebruikt om de moleculaire mechanismen te begrijpen die chromosoomsegregatie regelen tijdens mitose en meiose 22,23,26,27. Vanwege de relatief grote omvang (>80 mm in diameter) van zoogdieroöcyten in vergelijking met somatische cellen28, vormt de ablatie van hun intracellulaire structuren een uitdaging. Bovendien is het gemiddelde mcMTOC-volume in metafase I-eicellen ~ 20 μm15, wat een extra uitdaging vormt. Een efficiënte methode die diepere weefselpenetratie biedt, moet worden toegepast om deze uitdagingen te overwinnen. Het belangrijkste voordeel van het gebruik van de multi-fotonenlaser voor ablatie is het vermogen om dieper in de cel te reiken terwijl off-target effecten worden geminimaliseerd29.
Om de werkzaamheid en efficiëntie van de laserablatiemethode te verifiëren om de beoogde structuur uit te putten, wordt aanbevolen een fluorescerend gelabeld eiwit te gebruiken om de beoogde structuur in de loop van de tijd (voor en na ablatie) te identificeren 23. Het is belangrijk op te merken dat laserablatie de hele mcMTOC als structuur uitput, en hoewel kleinere mcMTOCs slechts één laserblootstelling vereisen om uitgeput te zijn, kunnen grotere mcMTOCs meer dan één laserblootstelling op verschillende focale vlakken vereisen. Het wordt ook aanbevolen om een subset van controle- en mcMTOC-geableerde eicellen te fixeren en immunolabelen met een MTOC-marker (zoals γ-tubuline, pericentrine of Cep192) om de efficiëntie van de mcMTOC-ablatie verder te bevestigen. In controle-eicellen zullen delen van het cytoplasma net naast maar niet overlappend met mcMTOCs worden blootgesteld aan de laser.
Dit experiment vereist verschillende mcMTOC-ablaties terwijl ze tussen verschillende focale vlakken in de eicellen bewegen. Daarom wordt het ten zeerste aanbevolen om deze techniek meerdere keren te oefenen voordat u het experiment uitvoert om de experimenttijd te minimaliseren, waardoor de levensvatbaarheid van de eicellen toeneemt. Bovendien is het belangrijk om het minimale laservermogen te gebruiken dat voldoende is om de mcMTOCs uit te putten zonder de levensvatbaarheid van de eicellen te beïnvloeden.
Deze techniek heeft enkele beperkingen. Ten eerste zijn multi-foton confocale microscopen relatief duurder dan gewone confocale microscopen. Ten tweede is het verstoren van alle mcMCTOCs op verschillende focale vlakken tijdrovender dan chemische of genetische verstoringen. Ten derde vereist dit protocol technische vaardigheden om alle mcMC's in de kortst mogelijke tijd af te breken. Eenmaal onder de knie biedt het gebruik van de multi-fotonenlaser echter een uitstekende strategie om verschillende intracellulaire structuren in muizenoöcyten, waaronder mcMTOCs, te verstoren, wat bijdraagt aan het begrip van moleculaire mechanismen die de positionering van de spil reguleren en de tijdige migratie ervan in zoogdieroöcyten.

Haploïde gameten (sperma en eicellen) worden geproduceerd door meiose, wat één ronde DNA-replicatie met zich meebrengt, gevolgd door twee opeenvolgende delingen die nodig zijn voor chromosoomaantalvermindering voorafgaand aan de bevruchting. Bij zoogdieren ondergaat de eicel tijdens het vroege foetale leven een langdurige arrestatie (tot de puberteit) in het diploteenstadium van profase I van de eerste meiotische deling, een stadium dat het kiemblaasje (GV) -stadium wordt genoemd. Na meiotische hervatting ondergaat de GV-eicel nucleaire enveloppe-afbraak (NEBD) en wordt de spindel voornamelijk in het eicelcentrum geassembleerd 1,2,3. Later, aangedreven door F-actine, migreert de spindel tijdig van het eicelcentrum naar de cortex om een zeer asymmetrische deling te garanderen, wat resulteert in een ei met een klein polair lichaam (PB)4,5,6.
In mitotische cellen bestaan de centrosomen uit een paar centriolen omgeven door peri-centriolar materiaalcomponenten (PMC), zoals pericentrine, γ-tubuline, Cep152 en Cep1927. Deze centriole-bevattende centrosomen dragen bij aan de betrouwbaarheid van bipolaire spindelvorming8. Centriolen gaan echter verloren tijdens vroege oogenese bij verschillende soorten, waaronder knaagdieren9. Daarom nemen muizenoöcyten een centriole-onafhankelijke spindelassemblageroute aan met behulp van talrijke acentriolar microtubule (MT) organiserende centra (MTOCs)9,10. Bij meiotische hervatting ondergaan de perinucleaire MTOC's drie verschillende stappen van recondensatie, uitrekken en fragmentatie in een groot aantal kleinere MTOC's11,12. De gefragmenteerde MTOC's worden vervolgens geclusterd en gesorteerd om een bipolaire spindel 10,13,14 te organiseren. Een andere pool van MTOCs bevindt zich in het cytoplasma tijdens NEBD. Sommige van deze cytoplasmatische MTOCs migreren en vormen spindelpolen (polaire MTOCs, pMTOCs)10,11. Onlangs werd een andere subset van cytoplasmatische MTOCs ontdekt, genaamd metafasecytoplasmatische MTOCs (mcMTOCs), die niet bijdragen aan de vorming van spindelpolen, maar tijdens metafase I (Met I)15 in het cytoplasma van de eicel blijven. Het uitputten van mcMTOCs door multi-foton laserablatie of het abnormaal verhogen van hun aantal door autofagie remming verstoort de positionering en migratie van de spindel en verhoogt de incidentie van aneuploïdie in metafase II-eicellen15.
Interessant is dat mcMTOCs in veel opzichten verschillen van pMTOCs15. In tegenstelling tot pMTOCs, die voornamelijk afkomstig zijn van perinucleaire MTOCs, zijn mcMTOCs bijvoorbeeld afkomstig van de eicelcortex. Wanneer de spindel zich nog steeds in het eicelcentrum bevindt, zijn de mcMTOCs asymmetrisch tegenovergesteld aan de kant waarnaar de spindel migreert voor PB-extrusie15. Astrale-achtige MT's kunnen de cortex in de relatief grote eicelcel niet bereiken. Daarom nucleeren deze mcMTOCs MT's om de spindel (via astrale-achtige MTOCs) aan de cortex te verankeren. Deze bevindingen suggereren een model waarin de mcMTOC-nucleated MT-kracht de F-actine-gemedieerde kracht tegenwerkt die de spindelmigratie naar de cortex aandrijft. De balans tussen deze twee tegengestelde krachten is essentieel om de centrale spindelpositionering en tijdige spindelmigratie te reguleren15.
Tot op heden lokaliseren alle onderzochte PMC-eiwitten (pericentrine, g-tubuline, Cep192 en Aurora kinase A) zich in beide MTOC-pools: mcMTOCs en pMTOCs15. Daarom is er geen chemische of genetische benadering om mcMTOCs selectief te verstoren zonder pMTOCs te verstoren. Deze beperkingen kunnen worden omzeild door selectief de mcMTOCs te richten met laserablatie. Onder de lasergebaseerde technologieën die zijn ontwikkeld voor microablatie, vertonen gepulseerde multi-foton femtoseconde lasers een groot potentieel vanwege hun precisie-impact beperkt tot het brandpuntsvlak, de hoge penetratiediepte van nabij-infrarood licht en de verminderde fototoxiciteit en thermische schade aan de cel 16,17,18. Dit werk beschrijft een selectieve benadering om mcMTOCs in muizenoöcyten af te breken met behulp van een multi-fotonenlaser gekoppeld aan een omgekeerde microscoop.

```html
<table><tbody><tr><td>4 IN thinwall GL 1.0 OD/.75 ID</td><td>World precision instrument&nbsp;</td><td>TW100F-4</td><td>Injectienaalden&nbsp;</td></tr><tr><td>Borosilicate glas&nbsp;</td><td>Fisherbrand&nbsp;</td><td>Cat# 13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate glas capillariteiten&nbsp;</td><td>World Precision Instrument&nbsp;</td><td>Cat# TW100-6</td><td>Bevestigingsnaalden&nbsp;</td></tr><tr><td>Bovine serum albumine&nbsp;</td><td>MilliporeSigma&nbsp;</td><td>Cat# A4503</td><td></td></tr><tr><td>Cage incubator voor Leica DMI6000 B microscoop</td><td>Life Imaging Services GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calcium chlrode dihydrate</td><td>MilliporeSigma&nbsp;</td><td>Cat# C7902</td><td></td></tr><tr><td>CO2 controller&nbsp;</td><td>Pecon</td><td># 0506.000</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Cover HP</td><td>Pecon</td><td># 0506.020</td><td></td></tr><tr><td>DL-Lactic acid&nbsp;</td><td>MilliporeSigma&nbsp;</td><td>Cat# L7900</td><td></td></tr><tr><td>DMi8</td><td>Leica&nbsp;</td><td>N/A</td><td>Microscoop&nbsp;</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>MilliporeSigma&nbsp;</td><td>Cat# E5134</td><td></td></tr><tr><td>Femtojet 4i</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>N/A</td><td>Microinjector&nbsp;</td></tr><tr><td>Femtotips Microloader</td><td>Fisher scientific&nbsp;</td><td>E5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin&nbsp;</td><td>MilliporeSigma&nbsp;</td><td>Cat# G1272</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin&nbsp;</td><td>MilliporeSigma&nbsp;</td><td>Cat# 1272</td><td></td></tr><tr><td>Glas bodem schaal&nbsp;</td><td>Mat Tek Corporation</td><td>Cat# P35G-1.0-20-C&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Hepes&nbsp;</td><td>MilliporeSigma&nbsp;</td><td>Cat# H3784</td><td></td></tr><tr><td>Hepes Sodium Salt</td><td>MilliporeSigma</td><td>Cat # H3784</td><td></td></tr><tr><td>Hera Cell vios 160i</td><td>Thermo&nbsp;</td><td>N/A</td><td>CO2 incubator&nbsp;</td></tr><tr><td>Leica TCP SP8 spectral laser scanning confocal microscoop met omgekeerde stand DMI6000 B</td><td>Leica Microsystems, Inc</td><td>N/A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine&nbsp;</td><td>MilliporeSigma</td><td>Cat#G8540</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate dihydrate</td><td>MilliporeSigma&nbsp;</td><td>Cat# M7774</td><td></td></tr><tr><td>MaiTai DeepSee Ti-Sapphire femtosecond laser</td><td>Spectra-Physics</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>mCH-Cep192 cRNA</td><td></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Medium Essential Medium Eagle - MEM</td><td>MilliporeSigma</td><td>Cat #M0258</td><td></td></tr><tr><td>Milrinone</td><td>MilliporeSigma</td><td>Cat# M4659</td><td></td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>MilliporeSigma</td><td>Cat# M5310</td><td></td></tr><tr><td>Minimum essential medium eagle (MEM)</td><td>MilliporeSigma&nbsp;</td><td>Cat# M0268 - 1L</td><td></td></tr><tr><td>Muis: Cep192-eGFP reporter CF-1</td><td></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Petrischaal (100 mm)</td><td>Fisherbrand&nbsp;</td><td>Cat# FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Petrischaal (35 mm)</td><td>Corning&nbsp;</td><td>Cat# 430165</td><td></td></tr><tr><td>Petrischaal (60 mm)</td><td>Falcon&nbsp;</td><td>Cat# 351007</td><td></td></tr><tr><td>Phenol Red&nbsp;</td><td>MilliporeSigma&nbsp;</td><td>Cat# P5530</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylpyrolidone</td><td>MilliporeSigma</td><td>Cat# P2307</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylpyrolidone (PVP)</td><td>MilliporeSigma&nbsp;</td><td>Cat# P2307</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride&nbsp;</td><td>MilliporeSigma&nbsp;</td><td>Cat# P5405</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic&nbsp;</td><td>MilliporeSigma&nbsp;</td><td>Cat# P5655</td><td></td></tr><tr><td>Pregnant mare&acute;s serum gonadotropin&nbsp;</td><td>Lee BioSolutions</td><td>Cat# 493-10-10&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvic acid&nbsp;</td><td>MilliporeSigma&nbsp;</td><td>Cat# P4562</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvic acid&nbsp;</td><td>MilliporeSigma&nbsp;</td><td>Cat# P4562</td><td></td></tr><tr><td>Naalden&nbsp;</td><td>D.M.C</td><td>N/A</td><td>N&deg; 5 * 16 Naalden&nbsp;</td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate&nbsp;</td><td>MilliporeSigma&nbsp;</td><td>Cat# S5761</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride&nbsp;</td><td>MilliporeSigma&nbsp;</td><td>Cat# S5886</td><td></td></tr><tr><td>Stage-top verwarming insert P</td><td>Pecon</td><td># 0426.300</td><td></td></tr><tr><td>Sterezoom S9i</td><td>Leica&nbsp;</td><td>N/A</td><td>Stereomicroscoop&nbsp;</td></tr><tr><td>Spuit 1 mL</td><td>BD company&nbsp;</td><td>Cat# 309597</td><td></td></tr><tr><td>Taurine&nbsp;</td><td>MilliporeSigma&nbsp;</td><td>Cat# T0625</td><td></td></tr><tr><td>Temperatuurregelaar Tempcontrol 37-2 digitaal</td><td>Pecon</td><td># 0503.000</td><td></td></tr><tr><td>The Cube temperatuurregelaar voor de cage incubator</td><td>Life Imaging Services GmbH</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>
```

multi-foton laserablatie van cytoplasmatische microtubule organiserende centra in muizenoöcyten

Multi-Photon Laser Ablation of Cytoplasmic Microtubule Organizing Centers in Mouse Oocytes

De betrouwbaarheid van eicel meiose is van cruciaal belang voor het genereren van ontwikkelings competente euploïde eieren. Bij zoogdieren ondergaat de eicel een langdurige arrestatie in profase I van de eerste meiotische divisie. Na de puberteit en bij meiotische hervatting wordt het kernmembraan gedemonteerd (afbraak van de nucleaire envelop) en wordt de spil voornamelijk in het eicelcentrum geassembleerd. Initiële centrale spindelpositionering is essentieel om te beschermen tegen abnormale kinetochore-microtubule (MT) aanhechtingen en aneuploïdie. De centraal geplaatste spil migreert op een tijdgevoelige manier naar de cortex, en dit is een noodzakelijk proces om een klein polair lichaam te extruderen. In mitotische cellen is spindelpositionering afhankelijk van de interactie tussen centrosoom-gemedieerde astrale MT's en de celschors. Integendeel, muizenoöcyten missen klassieke centrosomen en bevatten in plaats daarvan talrijke acentriolar MT-organisatiecentra (MTOCs). In het metafase I-stadium hebben muizenoöcyten twee verschillende sets MTOCs: (1) MTOC's die worden geclusterd en gesorteerd om spindelpolen (polaire MTOCs) samen te stellen, en (2) metafasecytoplasmatische MTOCs (mcMTOCs) die in het cytoplasma achterblijven en niet direct bijdragen aan de vorming van de spil, maar een cruciale rol spelen bij het reguleren van de spindelpositionering en tijdige spindelmigratie. Hier wordt een multi-foton laserablatiemethode beschreven om selectief endogene gelabelde mcMTOCs uit te putten in eicellen verzameld van Cep192-eGfp-reportermuizen . Deze methode draagt bij aan het begrip van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan spindelpositionering en migratie in zoogdieroöcyten.

Multi-foton laserablatie biedt een efficiënte methode om selectief intracellulaire structuren af te breken. De huidige studie gebruikte multi-foton laserablatie om mcMTOCs in muizenoöcyten selectief uit te putten. Laserablatie putte de mcMTOCs efficiënt uit, zoals blijkt uit de reductie van de endogene GFP-fluorescentie in de beoogde mcMTOCs tot een niveau dat vergelijkbaar is met de achtergrond. Exogene mCh-Cep192 in de beoogde mcMTOCs werd ook afgeschaft na laserablatie. De laserablatie van mcMTOCs moet worden uitgevoerd op verschillende focale vlakken in de eicel (waar mcMTOCs zich bevinden, figuur 2) om ervoor te zorgen dat alle mcMTOCs in de eicel uitgeput zijn (figuur 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64439/64439fig01.jpg"> Figuur 1: Oöcytenmicro-injectie. Micro-injectie van een profase I-arrested muisoöcyt met mCh-Cep192 cRNA. Schaalbalk: 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64439/64439fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64439/64439fig02.jpg"> Figuur 2: Uitputting van mcMTOCs in muizenoöcyten. Representatieve beelden van enkele brandpuntsvlakken. De witte vierkanten duiden op een mcMTOC voor en na multi-foton laserablatie. Schaalbalk: 40 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64439/64439fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64439/64439fig03.jpg"> Figuur 3: Uitputting van mcMTOCs op verschillende focale vlakken in een muizenoöcyt. Representatieve maximale projectiebeelden van een mcMTOC-geableerde muisoöcyt. Schaalbalk: 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64439/64439fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Aanvullend bestand 1: Samenstellingen van Chatot, Ziomek en Bavister (CZB) en bicarbonaatvrij minimaal essentieel medium (MEM/PVP). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64439/64439_Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Er wordt een geoptimaliseerd protocol gepresenteerd dat de uitputting van cytoplasmatische microtubuli organiserende centra in muizenoöcyten tijdens metafase I mogelijk maakt met behulp van een nabij-infrarode femtosecondelaser.

Multi-foton laserablatie van cytoplasmatische microtubule organiserende centra in muizenoöcyten

The fidelity of oocyte meiosis is critical for generating developmentally competent euploid eggs. In mammals, the oocyte undergoes a lengthy arrest at ...

Dit protocol biedt een uitstekende strategie om selectief cytoplasmatische MTOC's af te dragen, die cruciale regulatoren zijn voor de positie van het spindel in muis-eicellen.Daarmee draagt het bij aan ons begrip van moleculaire mechanismen die meiose in eicellen reguleren.Deze techniek maakt het mogelijk om gerichte afdraag uit te voeren binnen levende eicellen met hoge ruimtelijke nauwkeurigheid en met minimale fototoxische effecten op de cel.Dit protocol kan worden gebruikt om een selectieve mechanische verstoring van verschillende instructeurs te induceren zonder de levensvatbaarheid van de cel te veranderen.Dit protocol vereist de technische vaardigheden om alle cytoplasmatische MTOC's in de kortst mogelijke tijd af te dragen om te voorkomen dat de levensvatbaarheid van de eicellen wordt aangetast.Dus is het essentieel om deze techniek meerdere keren te oefenen voordat het eigenlijke experiment wordt uitgevoerd.Om te beginnen, vult u het CZB-medium aan met glutamine en milrinone en plaatst u het in de incubator.Bereid de opvang- en kweekschalen voor.Maak vier microdruppels opvangmedium en twee microdruppels kweekmedium in respectievelijk 60 en 35 mm Petri-schalen.En bedek ze met minerale olie.Houd de opvangschaal op de schuifverwarmer en incubeer bij 37

multi-photon-laser-ablation-cytoplasmic-microtubule-organizing

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Eicellen zijn gevoelig voor te wijten aan fouten in chromosoom segregatie aneuploïdie tijdens de meiotische rijping. Aneuploïde eieren kan leiden tot onvruchtbaarheid, miskramen of ontwikkelingsstoornissen, zoals het syndroom van Down. Hier beschrijven we methoden om materialen van keuze te introduceren in eicellen en methoden om meiotische rijping onderzoeken en te beoordelen ploïdie.

Eicel muis micro-injectie, rijping en ploïdie Assessment

Hier presenteren we een protocol specifieke siRNA-gemedieerde mRNA afbraak gevolgd door immunofluorescentie analyse meiotische spileenheid en organisatie evalueren muizen oöcyten. Dit protocol is geschikt voor in vitro depletie van transcripties en functionele beoordeling van verschillende spil en / of MTOC geassocieerde factoren in oöcyten.

Meiotische Spil Assessment in Muis Eicellen door siRNA-gemedieerde silencing

We presenteren protocollen voor het verzamelen, voorbereiden en beeldvorming van volwassen Drosophila eicellen. Deze methoden maken de visualisatie van chromosoomgedrag en spindelassemblage en -functie tijdens meiose mogelijk.

Technieken voor Imaging prometaphase metafase van de meiose I in Fixed<em&gt; Drosophila</em&gt; Eicellen

Als de genetische varianten die zijn gekoppeld aan ziekten bij de mens begint te worden blootgelegd, wordt het steeds belangrijker systemen waarmee snel evalueren de biologische betekenis van deze geïdentificeerde varianten te ontwikkelen. Dit protocol wordt beschreven methoden voor de evaluatie van menselijke genfunctie tijdens vrouwelijke meiose ik met behulp van de muis eicellen.

Met behulp van de muis eicellen te beoordelen van menselijke genfunctie tijdens de meiose I

Dit protocol beschrijft een reportertest om de regulatie van mRNA-vertaling in enkelvoudige oöcyten tijdens in vitro rijping te bestuderen.

Het programma van maternale mRNA-vertaling definiëren tijdens in vitro rijping met behulp van een enkele oöcytreportertest

Typische microtubuleremmers, die veel worden gebruikt in fundamenteel en toegepast onderzoek, hebben verstrekkende effecten op cellen. Onlangs ontstonden fototatinen als een klasse van fotoschakelbare microtubuleremmers, in staat tot onmiddellijke, omkeerbare, spatiotemporaal nauwkeurige manipulatie van microtubuli. Dit stapsgewijze protocol beschrijft de toepassing van fototatinen in een 3D live pre-implantatiemuismyo.

Spatiotemporale subcellulaire manipulatie van het microtubulecytoskelet in het levende pre-implantatiemuismyo met behulp van photostatinen

Fout in chromosoomsegregatie is een veel voorkomend kenmerk in eicellen. Daarom geeft het bestuderen van het controlepunt voor de spindelassemblage belangrijke aanwijzingen over de mechanismen die nodig zijn om gezonde eieren te produceren. Het huidige protocol beschrijft drie complementaire testen om de integriteit van het controlepunt van de spindelassemblage in muizenoöcyten te evalueren.

Evaluatie van de integriteit van het spindelassemblagecontrolepunt in muizenoöcyten

Het handhaven van de integriteit van het oöcytengenoom is noodzakelijk om de genetische getrouwheid in het resulterende embryo te waarborgen. Hier presenteren we een nauwkeurig protocol voor het detecteren van DNA-dubbelstrengsbreuken in vrouwelijke geslachtscellen van zoogdieren.

Detectie van DNA-dubbelstrengsbreuken in eicellen van muizen

Dit protocol biedt een experimenteel kader om de fysieke impact van het cytoskelet op de nucleaire vorm en de interne membraanloze organellen in het eicelsysteem van muizen te documenteren. Het raamwerk kan worden aangepast voor gebruik in andere celtypen en contexten.

Het vastleggen van op cytoskelet gebaseerde agitatie van de eicelkern van muizen op ruimtelijke schalen

Hier presenteren we een protocol voor de karakterisering van muis antral eicellen gebaseerd op nucleolair organisatie.

Isolatie en karakterisering van de Muis Antral Eicellen Gebaseerd op Hergroepering van nucleoli chromatine Organization

Leer cytoplasmatische microtubule organiserende centra ablateren in muizenoöcyten met een femtoseconde laser. Deze methode biedt hoge ruimtelijke nauwkeurigheid met minimale fototoxiciteit voor het bestuderen van eicelmejose.

Multi-foton laserablatie van cytoplasmatische microtubule organiserende centra in muizenoöcyten

Meer video's verkennen