Name: Het vaststellen van 3D-endometriumorganoïden uit de baarmoeder van de muis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-06T13:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 24 s
Description: Leer endometriumorganoïden isoleren uit de baarmoeder van de muis met enzymatische en mechanische dissociatie. Deze methode maakt 3D-kweken voor onderzoek naar baarmoederbiologie en ziektes.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We bedanken Dr. Stephanie Pangas en Dr. Martin M. Matzuk (M.M.M.) voor het kritisch lezen en redigeren van ons manuscript. Studies werden ondersteund door Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development subsidies R00-HD096057 (D.M.), R01-HD105800 (D.M.), R01-HD032067 (M.M.M.) en R01-HD110038 (M.M.), en door NCI- P30 Cancer Center Support Grant (NCI-CA125123). Diana Monsivais, Ph.D. heeft een Next Gen Pregnancy Award van het Burroughs Wellcome Fund.

Muisbehandeling en experimentele studies werden uitgevoerd onder protocollen die zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van Baylor College of Medicine en richtlijnen die zijn vastgesteld door de NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.
1. Isolatie van baarmoederepitheel van muizen met behulp van enzymatische en mechanische methoden
OPMERKING: In dit gedeelte worden de stappen beschreven die nodig zijn om epitheliale endometriumorganoïden van muizen vast te stellen, door te laten, te bevriezen en te ontdooien met behulp van een gelmatrixsteiger. Eerdere studies hebben vastgesteld dat optimale culturen van muizenendometriumorganoïden worden vastgesteld uit muizen tijdens de oestrusfase4, die kan worden bepaald door cytologisch onderzoek van een vaginaal uitstrijkje15. Volwassen vrouwelijke WT-muizen (6-8 weken oud, hybride C57BL/6J en 129S5/SvEvBrd) werden gebruikt voor alle experimenten. De muizen werden humaan geëuthanaseerd volgens door de IACUC goedgekeurde richtlijnen met behulp van isofluraan sedatie gevolgd door cervicale disarticulatie. Zodra de muizen zijn geëuthanaseerd, moeten de volgende stappen worden gevolgd. Zie de tabel met materialen voor meer informatie over materialen en oplossingen die in dit protocol worden gebruikt.
<ol><li>Laat de gelmatrix voor gebruik ongeveer 1-2 uur op ijs ontdooien.</li>
	<li>Om de muis te ontleden, gebruikt u een schaar om een middenlijnincisie op de buik te maken en de huid voorzichtig af te pellen om de onderliggende peritoneale laag bloot te leggen. Gebruik een tang om de peritoneale laag omhoog te houden en laterale incisies te maken met de schaar om de buikinhoud bloot te leggen.<ol><li>Lokaliseer de baarmoederhoorns door de buikvetkussens voorzichtig opzij te bewegen. Ontleed ze door ze eerst op de cervicale kruising te houden en een schaar te gebruiken om langs het mesenteriale vet te snijden. Verwijder na de dissectie van de baarmoeder van de muis grondig vetweefsel uit de baarmoederhoorn met een kleine schaar. OPMERKING: Handhaaf de steriliteit tijdens de celisolatie door alle chirurgische hulpmiddelen voor gebruik te steriliseren, de buik van de muis te besproeien met 70% ethanol en alle stappen na dissectie uit te voeren onder een steriele weefselkweekkap.</li>
	</ol></li>
	<li>Snijd elke baarmoederhoorn in kleine fragmenten van ongeveer 4-5 mm.</li>
	<li>Plaats alle baarmoederfragmenten van één baarmoeder in één putje van een 24-wellsplaat met 0,5 ml 1% Trypsine. Laat de enzymatische oplossing het baarmoederlumen binnendringen, waardoor enzymatische scheiding van het endometriumepitheel van het onderliggende stroma ontstaat.</li>
	<li>Incubeer de 24-wells plaat in een 37 °C bevochtigde weefselkweek incubator gedurende ongeveer 1 uur.</li>
	<li>Breng na de incubatie van 1 uur de baarmoederfragmenten over naar een weefselkweekplaat van 35 mm met 1 ml Dulbecco's fosfaatbufferoplossing (DPBS).</li>
	<li>Gebruik onder een dissectiemicroscoop een fijne tang en een pipet van 1 ml om het baarmoederepitheel mechanisch van de baarmoederbuis te scheiden. Terwijl u het ene uiteinde van een baarmoederfragment met de tang vasthoudt, laat u de pipetpunt voorzichtig in de lengterichting over het fragment lopen en knijpt u het epitheel uit het andere uiteinde van de baarmoederbuis. Observeer de gescheiden epitheliale vellen van het baarmoederfragment onder de dissectiemicroscoop.</li>
	<li>Gebruik de pipet van 1 ml om de epitheliale vellen te verzamelen en voorzichtig over te brengen in een buis van 1,5 ml.</li>
	<li>Herhaal het proces voor de resterende baarmoederfragmenten en breng alle epitheliale vellen over naar dezelfde verzamelbuis.</li>
	<li>Pelleteer de gedissocieerde epitheelplaten door centrifugeren gedurende 5 minuten bij 375 × g.</li>
	<li>Verwijder het supernatant voorzichtig om te voorkomen dat de celpellet wordt verstoord.</li>
	<li>Resuspendeer de celpellet in 0,5 ml collageenase van 2,5 mg/ml collagenase + 2 mg/ml DNase-oplossing. Pipetteer ongeveer 10x op en neer, of totdat een eencellige suspensie is bereikt.</li>
	<li>Voeg 0,5 ml DMEM/F12 + 10% foetaal runderserum (FBS) + antibiotica toe en centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 375 × g. OPMERKING: Voor meer informatie over het breedspectrumantibioticum dat wordt gebruikt voor celkweek, raadpleegt u de tabel met materialen.</li>
	<li>Verwijder voorzichtig het supernatant en resuspendeer de cellen in 1 ml DMEM / F12 + 10% FBS + antibiotica. Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 375 × g.</li>
</ol>2. Verwerking van het stromale compartiment
OPMERKING: In dit gedeelte worden de protocollen beschreven die nodig zijn voor het isoleren van het stromale compartiment van het muizenslijmvlies. Gezien de toenemende belangstelling voor epitheliale/stromale co-kweekexperimenten is het belangrijk om naast de epitheelcellen die organoïden genereren ook de stromale celpopulaties te kunnen verwerken.
<ol><li>Zodra al het epitheel enzymatisch en mechanisch is gescheiden van de baarmoederfragmenten, zijn de resterende buisachtige structuren de "stromale / myometriale" compartimenten. Verzamel dit weefsel in een collageenase van 2,5 mg/ml + 2 mg/ml DNase in HBSS-oplossing.</li>
	<li>Incubeer het stromale/myometriale monster gedurende 15 minuten op een schudder van 37 °C.</li>
	<li>Voeg na incubatie 500 μL DMEM/F12 + 10% FBS + antibiotica per muis toe en filter de niet-gedissocieerde fragmenten door een celfilter van 40 μm.</li>
	<li>Pelleteer de cellen door centrifugeren gedurende 5 minuten bij 375 × g.</li>
	<li>Verwijder voorzichtig het supernatant en resuspendeer de celpellet in 1 ml DMEM / F12 + 10% FBS + antibiotica. Voeg het mengsel druppelsgewijs toe aan 10 ml DMEM/F12 + 10% FBS + antibiotica in een celkweekplaat van 10 cm. Incubeer de plaat bij 37 °C in een bevochtigde celkweekincubator.</li>
	<li>Om coculturen van endometriumepitheel- en stromale cellen van muizen te genereren, volgt u de methoden die zijn beschreven voor menselijke endometriumorganoïden met behulp van steigervrije of collageenmatrixsystemen 6,8. OPMERKING: Hoewel deze technieken nog niet zijn gepubliceerd voor muizen, kunnen ze worden aangepast op basis van de gepubliceerde protocollen met humaan endometrium.</li>
</ol>3. Inkapseling van baarmoederepitheel in gelmatrix om organoïden vast te stellen
OPMERKING: Bewaar de gelmatrix op ijs totdat deze klaar is voor gebruik.
<ol><li>Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet in een volume gelmatrix dat 20x dat is van dat van de celpellet (d.w.z. als de celpellet 20 μL is, resuspendeer de cellen met 400 μL gelmatrix). Resuspendeer de pellet zorgvuldig om te voorkomen dat er bubbels ontstaan.</li>
	<li>Laat de gelmatrix/celsuspensie gedurende ~10 min bij kamertemperatuur bezinken.</li>
	<li>Zodra de gelmatrix/celsuspensie een halfvaste gel wordt, gebruikt u een P200-micropipette met een brede boring van 200 μL om voorzichtig 25 μL van de gelmatrix/celsuspensie op te zuigen. Doseer drie afzonderlijke 25 μL domes per put van een 12-well plaat en laat de gelmatrix gedurende 15 minuten uitharden in een 37 °C bevochtigde weefselkweekincubator.</li>
	<li>Nadat de gelmatrix is uitgehard, voegt u 750 μL organoïde medium toe aan elke put met gelmatrixkoepels. Incubeer bij 37 °C in een bevochtigde weefselkweekincubator. OPMERKING: Organoïde mediaformulering wordt vermeld in de tabel met materialen. Organoïden vormen zich meestal binnen 4 dagen na de eerste kweek.</li>
</ol>4. Genexpressieanalyse van endometriumorganoïden na behandeling met oestradiol
OPMERKING: In dit gedeelte worden de methoden beschreven die worden gebruikt om de genexpressie van endometriumepitheelorganoïden te profileren met behulp van real-time qPCR na behandeling met oestradiol (E2; zie tabel 1). Omdat het endometrium onder de cyclische controle van het eierstokhormoon E2 staat, is het testen van de responsiviteit van de organoïden op E2 een belangrijke maat voor fysiologische functie. We hebben hoogwaardig RNA verkregen en voldoende mRNA gegenereerd om genexpressie te profileren met behulp van qPCR en/of RNA-sequencing van onze endometriumepitheelorganoïden. In deze sectie wordt beschreven hoe organoïden kunnen worden verzameld en verwerkt voor downstream-analyse van genexpressie. Het geselecteerde behandelingsmedium weerspiegelt het medium dat wordt gebruikt om gekweekte endometriumcellen te behandelen. Er moet echter worden opgemerkt dat dit behandelingsmedium dienovereenkomstig kan worden geoptimaliseerd, zoals gedaan voor de behandeling van menselijke endometrium 3D-culturen met hormonen 8,16,17.
<ol><li>Kweek de endometriumorganoïden zoals hierboven beschreven.</li>
	<li>Verwijder het organoïde medium en vervang het vier dagen na het zaaien door 750 μL uithongeringsmedium. 's Nachts incuberen.</li>
	<li>Verwijder de volgende ochtend het uithongeringsmedium. Voeg 750 μL behandelingsmedium toe dat een medium of 10 nM E2 bevat. Incubeer gedurende 48 uur.</li>
	<li>Ga verder met RNA-isolatie volgens het protocol van de fabrikant van de kit.</li>
</ol>5. Histologische analyse van endometriumorganoïden
OPMERKING: Het in beeld brengen van de morfologische kenmerken van endometriumorganoïden is van cruciaal belang voor het evalueren van het cellulaire effect van groeifactoren, genetische manipulaties of kleine molecuulremmers. Deze sectie beschrijft de technieken die worden gebruikt om endometriumepitheelorganoïden te fixeren, te verwerken en in beeld te brengen met behulp van histologische vlekken en antilichaamimmunofluorescente kleuring.
<ol><li>Bereid 1,5 ml microcentrifugebuizen met 1 ml 4% paraformaldehyde in 1x PBS. Leg ze op ijs.</li>
	<li>Aspirateer het medium uit de putten van de 12-well plaat die de organoïden bevat.</li>
	<li>Breng met behulp van een pipetpunt van 1 ml met een gesneden punt 500 μL 4% paraformaldehyde over naar elke put en maak de gelmatrixkoepels voorzichtig los van de onderkant van de plaat.</li>
	<li>Zuig de volledige gelmatrixkoepels voorzichtig in de pipetpunt en breng over naar de microcentrifugebuis van 1,5 ml.</li>
	<li>Bevestig de organoïden door ze 's nachts op een rotator bij 4 °C te plaatsen.</li>
	<li>De volgende ochtend centrifugeer je de buis op 600 × g gedurende 5 minuten om de organoïden te pelleteren. Verwijder de 4% paraformaldehyde-oplossing voorzichtig met een pipet en gooi deze weg. Was de organoïden 2x met 70% ethanol.</li>
	<li>Verwijder na de laatste wasbeurt alle behalve 50-100 μL ethanol uit de buis. Zet de buis opzij.</li>
	<li>Plaats een tube monsterverwerkingsgel in een waterbad en magnetron gedurende ~ 30 s om de gel te smelten. Zorg ervoor dat de monsterverwerkingsgel niet overkookt door de consistentie van de gel te controleren. OPMERKING: Zodra de monsterverwerkingsgel is gesmolten, maar niet kokend heet, werkt u snel om de organoïden in te kapselen.</li>
	<li>Breng voldoende monsterverwerkingsgel over om het hele oppervlak van de mal (ongeveer 250 μL) te bedekken.</li>
	<li>Terwijl de monsterverwerkingsgel nog steeds gesmolten is, brengt u snel de 50 μL 70% ethanoloplossing over die de organoïden bevat. Zorg ervoor dat de organoïden zijn verzonken of naar het onderste gedeelte van de mal zijn geduwd.</li>
	<li>Plaats de histologievorm op een emmer ijs en laat de monsterverwerkingsgel afkoelen en stollen.</li>
	<li>Zodra de monsterverwerkingsgel volledig droog is, brengt u het monsterverwerkingsgel vierkant zorgvuldig over naar een monsterzak en houdt u het vlak bij waar de organoïden zich bevinden.</li>
	<li>Plaats de zak in een histologiecassette en verwerk met behulp van standaardmethoden die worden gebruikt voor formalinefixatie en paraffine-inbedding van weefsels18.</li>
	<li>Na fixatie en inbedding in paraffine, sectie in secties van 5 μm met behulp van een microtoom19. Ga verder met standaard hematoxyline en eosine (H &E) kleuring of immunostaining procedures, zoals hieronder beschreven.</li>
</ol>6. Hematoxyline &eosine kleuring
<ol><li>Deparaffiniseer de secties als volgt: xyleen, 2 x 10 min; 100% ethanol, 2 x 3 min; 80% ethanol, 3 min; 60% ethanol, 3 min; dH2O, 2 x 3 min; 1 min in hematoxyline; kraanwater (3 x 5 s); 1 min in eosine.</li>
	<li>Droog de secties als volgt uit: 60% ethanol, 3 min; 80% ethanol, 3 min; 95% ethanol, 3 min; 100% ethanol, 2 x 3 min; xyleen, 2 x 15 min.</li>
	<li>Monteer met behulp van montagemedium.</li>
</ol>7. Immunofluorescentiekleuring
<ol><li>Deparaffiniseer de secties zoals beschreven in stap 6.1.</li>
	<li>Voer het ophalen van antigeen uit<ol><li>Dompel de dia's onder in een antigeen ophaaloplossing in een magnetronveilige container.</li>
		<li>Magnetron op hoog vuur gedurende 20 minuten, met intervallen van 5 minuten om ervoor te zorgen dat de oplossing niet overkookt.</li>
	</ol></li>
	<li>Nadat de antigeen ophaalstap van 20 minuten is voltooid, laat u de dia's gedurende 40 minuten op ijs afkoelen terwijl u nog steeds ondergedompeld bent in de buffer voor het ophalen van antigeen.</li>
	<li>Was de dia's met 1x TBST gedurende 3 min</li>
	<li>Blokkeer de dia's door 3% BSA in TBST gedurende 1 uur bij kamertemperatuur te incuberen.</li>
	<li>Primaire antilichaam incubatie<ol><li>Verdun het antilichaam in 3% BSA in TBST (1:50-1:1.000, afhankelijk van Ab).</li>
		<li>Incubeer een nacht bij 4 °C in een bevochtigde kamer.</li>
		<li>Wassen 3 x 5 min met TBST.</li>
	</ol></li>
	<li>Secundaire antilichaam incubatie<ol><li>Verdun het antilichaam in 3% BSA (in TBST) (1:250), of in 5% normaal ezelserum.</li>
		<li>Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur (RT) in het donker, omdat het antilichaam is geconjugeerd aan een fluorofoor.</li>
	</ol></li>
	<li>Nucleaire kleuring<ol><li>Verdun 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) 1:1.000 in TBST.</li>
		<li>Incubeer gedurende 5 minuten bij RT.</li>
		<li>Was 2 x 5 min met TBST.</li>
	</ol></li>
	<li>Montage<ol><li>Gebruik één druppel montagemedium om de coverslip te monteren.</li>
		<li>Sluit de coverslip de volgende dag af met nagellak.</li>
	</ol></li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Hier beschrijven we methoden om endometriumepitheelorganoïden te genereren uit muizenslijmvlies en de protocollen die routinematig worden gebruikt voor hun downstream-analyse. Endometriumorganoïden zijn een krachtig hulpmiddel om de mechanismen te bestuderen die endometriumgerelateerde ziekten beheersen, zoals endometriose, endometriumkanker en implantatiefalen. Baanbrekende studies gepubliceerd in 2017 rapporteerden de omstandigheden om langdurige en hernieuwbare culturen van endometriumorganoïden uit muis en humaan epi...

Het endometrium - het binnenste bekledingsslijmvliesweefsel van de baarmoederholte - is een uniek en zeer dynamisch weefsel dat een cruciale rol speelt in de reproductieve gezondheid van een vrouw. Tijdens de reproductieve levensduur heeft het endometrium het potentieel om honderden cycli van proliferatie, differentiatie en afbraak te ondergaan, gecoördineerd door de gecoördineerde werking van de eierstokhormonen - oestrogeen en progesteron. Studies van genetisch gemanipuleerde muizen hebben fundamentele biologische mechanismen blootgelegd die de endometriumrespons op hormonen en de controle van embryo-implantatie, stromale celdecidualisatie en zwangerschap ondersteunen1. In vitro studies zijn echter beperkt geweest vanwege problemen bij het handhaven van niet-getransformeerde primaire endometriumweefsels van muizen in traditionele 2D-celculturen 2,3. Recente ontwikkelingen in de cultuur van endometriumweefsels als 3D-orgaansystemen, of organoïden, bieden een nieuwe kans om biologische routes te onderzoeken die de regeneratie en differentiatie van endometriumcellen regelen. Muis- en humaan endometriumorganoïde systemen zijn ontwikkeld uit zuiver endometriumepitheel ingekapseld in verschillende matrices 4,5, terwijl menselijk endometrium is gekweekt als steigervrije epitheliale / stromale co-culturen 6,7, en meer recent als collageen-ingekapselde epitheliale / stromale assembloïden8 . De groei en het regeneratieve potentieel van epitheliale organoïde culturen wordt ondersteund door een gedefinieerde cocktail van groeifactoren en kleine molecuulremmers die empirisch zijn vastgesteld om de groei en regeneratie van de organoïden te maximaliseren 4,5,9. Bovendien maakt het vermogen om endometriumorganoïden te bevriezen en te ontdooien het langdurig bankieren van endometriumorganoïden van muizen en mensen mogelijk voor toekomstige studies.
Genetisch gemanipuleerde muizen hebben de complexe signaalroutes onthuld die de vroege zwangerschap en decidualisatie regelen, en zijn gebruikt als modellen van zwangerschapsverlies, endometriumkanker en endometriose. Deze genetische studies zijn grotendeels bereikt met celspecifieke deletie van loxP geflankeerde allelen ("floxed") met behulp van cre-recombinasen die specifiek actief zijn in vrouwelijke voortplantingsweefsels. Deze muismodellen omvatten de veelgebruikte progesteronreceptor-cre10, die een sterke recombinase-activiteit heeft in de endometriumepitheel- en stromale weefsels, lactoferrine i-cre, dat endometriumepitheelrecombinatie induceert bij volwassen muizen11, of Wnt7a-cre, dat epitheliale-specifieke deletie veroorzaakt in van Müller afgeleide weefsels12 . Het kweken van endometriumweefsels uit genetisch gemanipuleerde muismodellen als 3D-organoïden heeft een uitstekende gelegenheid geboden om endometriumbiologie te onderzoeken en de identificatie van groeifactoren en signaalroutes te vergemakkelijken die de vernieuwing en differentiatie van endometriumcellen regelen13,14. Methoden voor de isolatie en kweek van muizenslijmbeenweefsel worden beschreven in de literatuur en rapporteren het gebruik van verschillende enzymatische strategieën voor de isolatie van baarmoederepitheel voor het daaropvolgende kweken van endometriumepitheelorganoïden4. Terwijl eerdere literatuur een kritisch kader biedt voor endometriumepitheel organoïde cultuurprotocollen 4,5,6, biedt dit artikel een duidelijke, uitgebreide methode voor het genereren, onderhouden, verwerken en analyseren van deze organoïden. Standaardisatie van deze technieken is belangrijk voor het versnellen van de vooruitgang op het gebied van reproductieve biologie van vrouwen. Hier rapporteren we een gedetailleerde methodologie voor de enzymatische en mechanische zuivering van endometriumepitheelweefsel van muizen voor de daaropvolgende kweek van endometriumorganoïden in een gelmatrixsteiger. We beschrijven ook de methodologieën voor downstream histologische en moleculaire analyses van de gelmatrix-ingekapselde muis endometriumepitheel organoïden.

<table><tbody><tr><td>Organoid Media Formulation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Eindconcentratie</td></tr><tr><td>Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-free</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>100%</td></tr><tr><td>Trypsine uit runderpancreas</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1426-1G</td><td>1%</td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>12634010</td><td>1X</td></tr><tr><td>N2 supplement</td><td>Life Technologies</td><td>17502048</td><td>1X</td></tr><tr><td>B-27&trade; Supplement (50X), minus vitamin A</td><td>Life Technologies</td><td>12587010</td><td>1X</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>Invivogen</td><td>ant-pm-1</td><td>100 &micro;g/mL</td></tr><tr><td>N-Acetyl-L-cysteïne</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9165-5G</td><td>1.25 mM</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>25030024</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N0636-100G</td><td>10 nM</td></tr><tr><td>ALK-4, -5, -7-remmer, A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td>500 nM</td></tr><tr><td>Recombinant menselijk EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>50 ng/mL</td></tr><tr><td>Recombinant menselijk Noggin</td><td>Peprotech</td><td>120-10C</td><td>100 ng/mL</td></tr><tr><td>Recombinant menselijk Rspondin-1</td><td>Peprotech</td><td>120-38</td><td>500 ng/mL</td></tr><tr><td>Recombinant menselijk FGF-10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td>100 ng/mL</td></tr><tr><td>Recombinant menselijk HGF</td><td>Peprotech</td><td>100-39</td><td>50 ng/mL</td></tr><tr><td>WNT3a</td><td>R&amp;D systems</td><td>5036-WN</td><td>200 ng/mL</td></tr><tr><td>Overige benodigdheden en reagentia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Eindconcentratie</td></tr><tr><td>Collagenase uit Clostridium histolyticum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0130-1G</td><td>5 mg/mL</td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I uit runderpancreas</td><td>Sigma Aldrich</td><td>DN25-100MG</td><td>2 mg/mL</td></tr><tr><td>DPBS, zonder calcium, zonder magnesium</td><td>ThermoFisher</td><td>14190-250</td><td>1X</td></tr><tr><td>HBSS, zonder calcium, zonder magnesium</td><td>ThermoFisher</td><td>14170112</td><td>1X</td></tr><tr><td>Falcon&nbsp;Polystyreen Microplates (24-Well)</td><td>Fisher Scientific</td><td>#08-772-51</td><td></td></tr><tr><td>Falcon&nbsp;Polystyreen Microplates (12-Well)</td><td>Fisher Scientific</td><td>#0877229</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Cell Strainers, 40 &micro;m</td><td>Fisher Scientific</td><td>#08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>Direct-zol RNA MiniPrep (50 &micro;g)</td><td>Genesee Scientific</td><td>11-331</td><td></td></tr><tr><td>Trizol reagent</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES, geen fenolrood</td><td>ThermoFisher</td><td>11039021</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovien serum, met houtskool gestript</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6765-500ML</td><td>2%</td></tr><tr><td>Estratiol (E2)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E1024-1G</td><td>10 nM</td></tr><tr><td>Formaldehyde 16% in waterige oplossing, EM Grade</td><td>VWR</td><td>15710</td><td>4%</td></tr><tr><td>Epredia Cassette 1 Slotted Tissue Cassettes</td><td>Fisher Scientific</td><td>1000961</td><td></td></tr><tr><td>Epredia Roestvrijstalen Inbeddingsbasis Mallen</td><td>Fisher Scientific</td><td>64-010-15&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, 200 proof (100%)</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-032-601&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Histoclear</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-899-90147</td><td></td></tr><tr><td>Permount Montage Medium</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-277-97</td><td></td></tr><tr><td>Epredia Nylon Biopsie Zakken</td><td>Fisher Scientific</td><td>6774010</td><td></td></tr><tr><td>HistoGel Monster Verwerkingsgel</td><td>VWR</td><td>83009-992</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylinen oplossing Premium</td><td>VWR</td><td>95057-844</td><td></td></tr><tr><td>Eosine Y (geelachtig) oplossing Premium</td><td>VWR</td><td>95057-848</td><td></td></tr><tr><td>TBS Buffer, 20X, pH 7.4</td><td>GenDEPORT</td><td>T8054</td><td>1X</td></tr><tr><td>TBST (10X), pH 7.4</td><td>GenDEPORT</td><td>T8056</td><td>1X</td></tr><tr><td>Citroenzuur&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0759-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcitraat tribasisch dihydraat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S4641-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Runder Serum Albumine (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153-100G</td><td>3%</td></tr><tr><td>DAPI Oplossing (1 mg/mL)</td><td>ThermoFisher</td><td>62248</td><td>1:1000 verdunning</td></tr><tr><td>VECTASHIELD Antifade Montage Medium</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000-10</td><td></td></tr><tr><td>Klaar nagellak</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1849418</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscoopglaasjes</td><td>Fisher Scientific</td><td>22037246</td><td></td></tr><tr><td>VWR Micro Dekglasjes</td><td>VWR</td><td>48393-106</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript VILO Master Mix</td><td>ThermoFisher</td><td>11755050</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green PCR Master Mix</td><td>ThermoFisher</td><td>4364346</td><td></td></tr><tr><td>Krt8 Antilichaam (TROMA-I)&nbsp;</td><td>DSHB</td><td>TROMA-I&nbsp;</td><td>1:50 verdunning</td></tr><tr><td>Vimentin Antilichaam</td><td>Cell Signaling</td><td>5741S</td><td>1:200 verdunning</td></tr><tr><td>Donkey anti-Rat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antilichaam, Alexa Fluor 594</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21209</td><td>1:250 verdunning</td></tr><tr><td>Donkey anti-Rabbin IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antilichaam, Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21206</td><td>1:2

het vaststellen van 3d-endometriumorganoïden uit de baarmoeder van de muis

Establishing 3D Endometrial Organoids from the Mouse Uterus

Endometriumweefsel bekleedt de binnenholte van de baarmoeder en staat onder de cyclische controle van oestrogeen en progesteron. Het is een weefsel dat is samengesteld uit luminaal en klierepitheel, een stromaal compartiment, een vasculair netwerk en een complexe immuuncelpopulatie. Muismodellen zijn een krachtig hulpmiddel geweest om het baarmoederslijmvlies te bestuderen en onthullen kritieke mechanismen die implantatie, placentatie en kanker beheersen. De recente ontwikkeling van 3D-endometriumorganoïde culturen presenteert een state-of-the-art model om de signaalroutes te ontleden die ten grondslag liggen aan endometriumbiologie. Het vaststellen van endometriumorganoïden uit genetisch gemanipuleerde muismodellen, het analyseren van hun transcriptomen en het visualiseren van hun morfologie met een resolutie van één cel zijn cruciale hulpmiddelen voor de studie van endometriumziekten. Dit artikel schetst methoden om 3D-culturen van endometriumepitheel van muizen vast te stellen en beschrijft technieken om genexpressie te kwantificeren en de histologie van de organoïden te analyseren. Het doel is om een bron te bieden die kan worden gebruikt om de genexpressie en morfologische kenmerken van endometriumepitheelorganoïden vast te stellen, te kweken en te bestuderen.

Fasecontrastbeelden van endometriumorganoïden van muizen We hebben organoïden vastgesteld uit WT-muizenendometriumepitheel, zoals beschreven in het bijgevoegde protocol (zie diagram in figuur 1). Na enzymatische dissociatie van het endometriumepitheel van de muis werden epitheliale vellen mechanisch gescheiden van de stromale cellen van de baarmoeder en verder gedissocieerd met collagenase om een eencellige suspensie te genereren. Indien correct uitgevoerd, zou deze metho...

Dit protocol beschrijft methodologieën om endometriumepitheelorganoïden van muizen vast te stellen voor genexpressie en histologische analyses.

Het vaststellen van 3D-endometriumorganoïden uit de baarmoeder van de muis

Endometrial tissue lines the inner cavity of the uterus and is under the cyclical control of estrogen and progesterone. It is a tissue that is composed of ...

Dit protocol is belangrijk omdat het een stapsgewijze methodologie laat zien voor het isoleren van zeer zuiver baarmoederepitheel uit de baarmoeder van de muis voor de kweek van endometriumorganoïden. Deze methode maakt efficiënt gebruik van enzymatische en mechanische dissociatie om baarmoederepitheel te isoleren. De technieken werden gestroomlijnd om endometriumepitheelorganoïden afgeleid van het geïsoleerde epitheel vast te stellen, te behandelen en te analyseren.Begin met het ontdooien van de gelmatrix op ijs gedurende ongeveer één tot twee uur voor gebruik. Ontleed vervolgens de geëuthanaseerde muis door een middellijnincisie op de buik te maken met een schaar en de huid voorzichtig af te pellen om de onderliggende peritoneale laag bloot te leggen. Lokaliseer de baarmoederhoorns door de buikvetkussens voorzichtig opzij te bewegen en houd de baarmoederhoorns op de cervicale overgang voordat u ze langs het mesenteriale vet snijdt.Verwijder na de dissectie van de baarmoeder van de muis grondig vetweefsel uit de baarmoederhoorn met een kleine schaar. Als u klaar bent, snijdt u elke baarmoederhoorn in kleine fragmenten, elk met een afmeting van ongeveer vier tot vijf millimeter. Plaats alle baarmoederfragmenten van één baarmoeder in één putje van een 24 putjesplaat met 0,5 milliliter 1% trypsine.Incubeer vervolgens de 24 putplaat in een 37 graden Celsius bevochtigde weefselkweekincubator gedurende ongeveer een uur voor enzymatische scheiding van het endometriumepitheel van het onderliggende stroma. Breng na de incubatie de baarmoederfragmenten over naar een weefselkweekplaat van 35 millimeter met één milliliter dulbecco's fosfaatbufferoplossing of DPBS. Scheid vervolgens het baarmoederepitheel van de baarmoederbuis onder een dissectiemicroscoop door het ene uiteinde van een baarmoederfragment met de tang vast te houden en de pipetpunt voorzichtig in de lengterichting over het fragment te laten lopen, waarbij het epitheel uit het andere uiteinde van de baarmoederbuis wordt gedrukt.Observeer vervolgens de gescheiden epitheliale vellen van het baarmoederfragment onder de dissectiemicroscoop. Breng vervolgens voorzichtig alle epitheliale vellen over in dezelfde buis van 1,5 milliliter met behulp van de ene milliliterpipet. En pelleteer de gedissocieerde epitheliale vellen door centrifugeren bij 375 x g gedurende vijf minuten.Verwijder het supernatant voorzichtig zonder de celpellet te verstoren en resuspendeer de celpellet in 0,5 milliliter van 2,5 milligram per milliliter collagenase plus twee milligram per milliliter DNA-oplossing. Pipetteer ongeveer 10 keer op en neer of totdat een eencellige suspensie is bereikt. Voeg vervolgens 0,5 milliliter DMEM F / 12 plus 10% foetaal runderserum of FBS plus antibiotica toe en centrifugeer de cellen gedurende vijf minuten bij 375 x g.Verwijder het supernatant, resuspensieer de cellen in één milliliter DMEM/F12 plus 10%FBS plus antibiotica en centrifugeer de cellen. Leg de gelmatrix op ijs tot hij klaar is. Verwijder vervolgens het supernatant uit de centrifugecellen en resuspendeer de celpellet met 20 keer het volume van de gelmatrix zonder de bubbels te introduceren.Laat de gelmatrixcelsuspensie ongeveer 10 minuten op kamertemperatuur bezinken. Zodra de gelmatrixcelsuspensie een halfvaste gel wordt, gebruikt u een P200-micropipette met een brede boring van 200 microliterpunt en zuigt u voorzichtig 25 microliter van de gelmatrixcelsuspensie aan. Doseer drie afzonderlijke koepels van 25 microliter per put van een 12 putplaat en laat de gelmatrix 15 minuten uitharden en een 37 graden Celsius bevochtigde weefselkweekincubator.Nadat de gelmatrix is uitgehard, voegt u 750 microliter organoïde medium toe aan elke put met gelmatrixkoepel en incubator bij 37 graden Celsius in een bevochtigde weefselkweekincubator. Fasecontrastbeelden van endometriumorganoïden van muizen toonden aan dat de epitheliale en stromale celscheiding monsters opleverde met niet meer dan 10% tot 15% verontreiniging van het tegenovergestelde celtype. De endometriumepitheelcellen werden binnen drie tot vier dagen samengevoegd tot organoïden.De gesegmenteerde formaline vaste paraffine ingebedde endometrium organoïden werden gevisualiseerd door hematoxyline- en eosinevlekken, die de enkele laag epitheel en holle centra, de lumens van de organoïden, vertoonden. De fluorescentiemicroscoopbeeldvorming toonde aan dat alle cellen in de organoïden Cytokeratine 8-positief waren en DAPI bevatten, wat aangeeft dat fixatie, inbedding en verwerking van de endometriumorganoïden compatibel is met op antilichamen gebaseerde immunostaining. De realtime kwantitatieve PCR toonde aan dat de stimulatie met 10 nanomolaire oestradiol de expressie van lipocaline 2, lactoferrine en progesteronreceptor in de epitheliale organoïden verhoogde, wat aangeeft dat endometriumepitheelorganoïden met succes kunnen worden gebruikt om de genexpressieveranderingen te meten als reactie op oestradiol.Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat een duidelijke scheiding van het endometriumepitheel wordt verkregen tijdens de mechanische dissociatiestap. Men moet epitheel kunnen waarnemen dat uit de baarmoederbuis komt. Andere methoden omvatten het vaststellen van de epitheliale organoïden door inkapseling in een gelmatrix.Indien gewenst kan het stromale compartiment verder worden verteerd om 3D-epitheliale stromale co-culturen te creëren. De methode kan helpen bij het beantwoorden van vragen over de signalen die de vernieuwing van het baarmoederslijmvlies regelen. Het kan helpen bij de behandeling van ziekten bij vrouwen, zoals endometriose, zwangerschapsverlies en kanker.

establishing-3d-endometrial-organoids-from-the-mouse-uterus

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een beschrijving van de chirurgische inductie van endometriose bij muizen en ratten door auto-transplantatie van baarmoeder weefsel om de arteriële cascade van de intestinale mesenterium.

Muismodel van chirurgisch geïnduceerde Endometriose door Auto-transplantatie van baarmoeder weefsel

Een protocol voor het genereren van menselijke primaire endometriale organoïden die bestaan uit epitheliale en stromale cellen en behouden kenmerken van het inheemse endometrium weefsel wordt gepresenteerd. Dit protocol beschrijft methoden van uteriene weefsel verwerving tot de histologische verwerking van endometriale organoïden.

Generatie van multicellulaire humane primaire Endometriale Organoïden

Veel knaagdiermodellen van endometriose worden beperkt door technische complexiteit, reproduceerbaarheid en/of behoefte aan immuungecompromitteerde dieren of speciale reportermuizen. We presenteren een vereenvoudigd systeem van laesie-inductie met behulp van elke experimentele muis met een onafhankelijk verifieerbaar, objectief scoresysteem en zonder vereiste voor ovariëctomie of overlevingsoperaties.

Een syngeneïsch murinemodel van endometriose met natuurlijk fietsende muizen

Deze studie introduceert een nieuw muismodel dat speciaal is ontworpen om endometrioom te simuleren, een klinisch significant subtype van endometriose. Door gebruik te maken van C57BL/6J-muizen wil het model de pathofysiologische mechanismen die ten grondslag liggen aan endometrioomgerelateerde onvruchtbaarheid ophelderen en een verfijnd hulpmiddel bieden om de huidige kenniskloof in de reproductieve geneeskunde te overbruggen.

Oprichting van een experimenteel muismodel van endometrioom om de gerelateerde onvruchtbaarheid te bestuderen

Hier presenteren we een protocol om endometriumepitheliale stamcellen (reESC's) van ratten te isoleren en te kweken, waardoor endometriumorganoïden van ratten worden gegenereerd. Deze methode vergemakkelijkt in vitro studies van endometriumaandoeningen, waardoor genbewerking en andere cellulaire manipulaties mogelijk worden.

Generatie en karakterisering van baarmoederorganoïden van ratten uit endometrium-epitheliale stamcellen van ratten

Dit artikel beschrijft een gedetailleerd protocol voor het produceren van een betrouwbaar en reproduceerbaar dun baarmoederslijmvlies met een zeer laag sterftecijfer en minimale intra-uteriene verklevingen door binnen 1-3 minuten 95% ethanol in de baarmoeder van de muis te injecteren.

Een muismodel van dun endometrium opstellen

Dit protocol beschrijft de ontwikkeling van hooggradig sereus ovariumcarcinoom (HGSOC) muismodellen in vitro en in vivo. Van de afleiding van muizen eileiderorganoïden, hun genetische modificatie om menselijke HGSOC-genetica samen te vatten, en hun introductie in de eierstokslijmbeurs van syngene muizen voor in vivo ontwikkeling van tumoren.

Ontwikkeling van van muizen afgeleide organoïdelijnen van eileiderepitheelcellen voor modellering van hooggradig sereus ovariumcarcinoom

Dit protocol beschrijft een gedefinieerde hydrogel-gebaseerde methode om menselijke borstorganoïden te genereren die belangrijke kenmerken van mammariummorfogenese recapituleren in een gecontroleerd driedimensionaal kweeksysteem.

Een gedefinieerde hydrogel-gebaseerde methode voor het genereren van driedimensionale menselijke borstorganoïden die mammaire morfogenese recapituleren

Intravitreale injectie is een veel gebruikte techniek in de visuele wetenschappen voor oculaire ziekten of als directe toepassing van lokale behandeling. Deze video toonde een protocol voor intravitreale injectie met een 1 ml injectiespuit met glazen pipet. Handige tips over het vermijden van grote bloeden en de lens beschadigd worden gegeven.

Intravitreale Injectie voor de oprichting van oogziekten Model

Dit artikel beschrijft een protocol voor de isolatie en het onderhoud van de primaire fibroblast culturen van de huid en longweefsel van wilde knaagdieren.

Tot vaststelling van primaire Adult Fibroblast Culturen van knaagdieren

Leer endometriumorganoïden isoleren uit de baarmoeder van de muis met enzymatische en mechanische dissociatie. Deze methode maakt 3D-kweken voor onderzoek naar baarmoederbiologie en ziektes.

Het vaststellen van 3D-endometriumorganoïden uit de baarmoeder van de muis

Meer video's verkennen