Een flexibele kamer voor time-lapse live-cell imaging met gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie

De flexibele omgevingskamertechniek maakt time-lapse mogelijk als SRS-beeldvorming met verzonden signaaldetectie op een bedieningsmicroscoopframe. SRS-microscopie gebruikte een objectief met een hoog numeriek diafragma en een high-end condensor, waardoor er slechts een paar millimeter opening overbleef waar een conventionele kamer niet in past. Een flexibele kamer lost dit probleem op.

Onderzoekers die SRS-microscopie gebruiken, kunnen deze techniek gemakkelijk toepassen. De flexibele kamer kan ook worden gebruikt op een ontleed- of een steriele microscoop om het monster onder optimale fysiologische omstandigheden te houden. Markeer om te beginnen de locaties van de voeten van het SRS-microscoopframe en het gemotoriseerde podium met behulp van een markeerpen op de optische tafel.

Nadat u het microscoopframe en het podium van de optische tafel hebt verwijderd, legt u het siliconenrubberen vel op de tafel. Snijd het siliconenrubber langs de markeringen met een mes. Verwijder kleine rubberen stukjes en plaats de vierkante mica keramische vellen op dezelfde locaties.

Beweeg vervolgens het microscoopframe en het podium terug naar de optische tafel en lijn de voeten voorzichtig uit op de mica-keramische vellen langs de markeringslijnen. Nadat u het optische pad van SRS opnieuw hebt uitgelijnd, monteert u de omgevingsbehuizing bovenop de thermische isolatiefundering om het hele microscoopframe te bedekken, met behulp van vijf stukken grote polycarbonaatplaten. Sluit de randen en interfaces van de doos af met aluminiumfolietape.

Sluit de flexibele kanaalslang aan op de inlaat en de uitlaatpoorten van de behuizingsdoos om een circulaire, warme luchtstroom mogelijk te maken die door de verwarmingsmodule wordt gepompt en geregeld. Monteer het bewerkte holle cilindrische aluminium stuk 1 met drie stelschroeven op het neusstuk van het objectief. Monteer vervolgens het bewerkte holle cilindrische aluminium stuk 2 met vier schroeven op de monsterhouder.

Monteer de monsterhouder met aluminium stuk 2 op het gemotoriseerde podium en monteer deze met schroeven. Plaats de natuurrubberen filmhuls tussen de twee bewerkte aluminium stukken en monteer deze met behulp van elastiekjes aan elk uiteinde. Sluit de gecomprimeerde CO2-cilinder aan op de gasmengermodule met behulp van de juiste buizen en connectoren.

Stel de CO2-ingangsdruk in op 20 tot 25 psi. Gebruik de ingebouwde CO2-sensor en een controller om ervoor te zorgen dat de luchtmixermodule 5% CO2 in de luchtstroom kan regelen en mengen. Gebruik inline filters om de luchtstroom op te ruimen.

Gebruik de juiste slangen en connectoren om de gemengde lucht naar de voorgesteriliseerde waterfles op de kookplaat te leiden en vervolgens de bevochtigde lucht naar de flexibele kamer te leiden. Zet de kookplaat op 37 graden Celsius. Bel de luchtstroom in het warme water om de luchtvochtigheid van de luchtstroom te verhogen.

Koppel het aluminium stuk 2 van de machine los van de monsterhouder door de schroeven te verwijderen. Veeg alle delen van de flexibele kamer schoon met 70% ethanol, inclusief het neusstuk, de monsterhouder en het waterdompelobject. Ontsmet het hele behuizingssysteem met behulp van een UV-lamp die gedurende 20 tot 30 minuten in de behuizing is geplaatst.

Laad vervolgens de celkweekschaal. Verwijder de deksel van de schaal en immobiliseer deze met behulp van de klemmen. Verlaag het objectief in de celkweekmedia voor grof scherpstellen.

Laat het aluminium stuk 2 zakken om de flexibele kamer te omsluiten en monteer het met schroeven op de monsterhouder. Plaats vervolgens de sensor. Stel de luchttoevoer in met 5% CO2 en 19% O2 voor normale celcultuur met een luchtdebiet van 200 kubieke centimeter per minuut en een temperatuur van 37 graden Celsius.

Stem de lasergolflengte af op 805 nanometer om de 2.854 centimeter inverse Raman-verschuiving te richten, die wordt toegeschreven aan de trilling van CH2 chemische bindingen. Gebruik een laag laservermogen om fotoschade aan de cellen te verminderen. Pas het doel aan en focus het om een goede SRS-beeldvorming van de cellen te bereiken met behulp van de focusknop op het hoofdbedieningspaneel van de software.

Als u snel wilt scherpstellen, stelt u het pixelnummer in op 512 bij 512 pixels met een pixelverblijftijd van 4,8 microseconden op het configuratiepaneel. Na het bereiken van een goede scherpstelling, stelt u de beeldresolutie in op 2048 bij 2048 pixels voor een gezichtsveld van 175 micrometer in het kwadraat voor het verkrijgen van afbeeldingen van hoge kwaliteit. Controleer de opslagfunctie op het hoofdbedieningspaneel en controleer het SRS-kanaal op het kanalenpaneel.

Stel de intervaltijd tussen twee frames in op 180 seconden op het hoofdbesturingskanaal. Stel het acquisitienummer in op 480 voor time-lapse-beeldvorming gedurende 24 uur. Start geautomatiseerde beeldacquisitie met behulp van de lusfunctie op het hoofdbedieningspaneel.

De prestaties van het flexibele kamersysteem voor time-lapse SRS-beeldvorming werden geëvalueerd. De temperatuur in de omgevingsbehuizing van de microscoop bereikte de verwachte 37 graden Celsius en had geen significante invloed op de kamertemperatuur. De temperatuur in de flexibele kamer bereikte 37 graden Celsius in 1,5 uur en werd stabiel gehouden gedurende ten minste 24 uur.

De relatieve luchtvochtigheid in de flexibele kamer bereikte 85% in één uur en kon minstens 24 uur worden gehandhaafd. De time-lapse SRS-beeldvorming van levende SKOV3-cellen toonde de snelle en actieve beweging van intracellulaire lipidedruppeltjes met een temporele resolutie van drie minuten. Tegen het einde van de 24-uurs beeldvormingssessie vertoonden de cellen nog steeds een normale morfologie en dichtheid, wat aangeeft dat de cellen gezond waren.

Vervolgens werden SKOV3-cellen behandeld met oliezuur in beeld gebracht en werd de accumulatie van lipidedruppels gedurende 10 uur gevolgd. De hoeveelheden lipidedruppels werden gekwantificeerd met behulp van de verhouding tussen lipidedruppel en lichaamsoppervlak en de totale SRS-intensiteit van de lipidedruppels. De resultaten geven aan dat de hoeveelheid lipidedruppeltjes gedurende 10 uur bleef toenemen.

Gelijktijdige voorwaartse SRS-beeldvorming van lipidedruppels en achterwaartse twee fotonenfluorescentiebeeldvorming van lysosomen gelabeld met een fluorescentiekleurstof DND-189 werd ook aangetoond. Een zeer lage mate van colocalisatie van lipidedruppels en lysosomen werd waargenomen. Houd er bij het proberen van dit protocol rekening mee dat focale drift een veel voorkomend probleem is bij beeldvorming met levende cellen.

Heroriëntatie kan nodig zijn na ongeveer twee uur time-lapse beeldvorming. Na de ontwikkeling is time-lapse SRS-beeldvorming gebruikt voor verschillende onderzoeken om labelvrije moleculen of gelabelde moleculen met Raman-tekst in levende cellen te volgen.