Een schaalbare, op cellen gebaseerde methode voor de functionele beoordeling van Ube3a-varianten

Onze methode biedt een snelle manier om de functionele impact van varianten in Ube3a te begrijpen, een ubiquitineligase dat het Angelman-syndroom veroorzaakt en sterk gekoppeld is aan een genetische vorm van autisme die bekend staat als het Dup15q-syndroom. De karakterisering van ubiquitine ligase activiteit is traditioneel arbeidsintensief en langzaam, en dergelijke methoden zijn moeilijk en niet echt vatbaar voor karakterisering van de honderden varianten geïdentificeerd voor Ube3a. Angelman-syndroom wordt veroorzaakt door de deletie van het maternale Ube3a-gen, terwijl het Dup15q-syndroom wordt veroorzaakt door de duplicatie van de maternale Ube3a, dus het is belangrijk om af te leiden hoe missense-varianten de activiteit van het Ube3a-enzym veranderden, en dit is iets dat moeilijk te doen is zonder elke variant empirisch te testen.

De procedure wordt gedemonstreerd door Jalin Stelzer, een onderzoekstechnicus in mijn laboratorium. Begin met het uitvoeren van de testen in HEK293T-cellen, gekweekt in Dulbecco's Modified Eagle Medium bij 37 graden Celsius, met 5% koolstofdioxide in een bevochtigde container, zoals beschreven in het manuscript. Plaats in een bioveiligheidskast de zwevende HEK293T-cellen op een met weefselkweek behandelde 96 goed platbodemplaat en incubeer de cellen 's nachts op 37 graden.

Op de tweede dag transfecteer je de cellen in een bioveiligheidskast met Firefly en Renilla luciferase reporter plasmiden en Ube3a plasmiden in drievoud. Voer de transfecties uit in een totaal volume van 10 microliter per put. Maak een hoofdmix voor de transfecties voor elke variant in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.

Roer na de incubatie voorzichtig het transfectiemengsel door op de buis te tikken en voeg vervolgens 10 microliter van het transfectiemengsel rechtstreeks toe aan de bestaande groeimedia in de putten. Breng daarna de cellen terug naar de couveuse en laat de plasmiden gedurende 48 uur tot expressie komen. Controleer met behulp van een fluorescentiemicroscoop de transfectie-efficiëntie door GFP-fluorescentie.

Meer dan 80% van de cellen zou GFP na 48 uur tot expressie moeten brengen. Zuig de kweekmedia zorgvuldig op uit getransfecteerde HEK293T-cellen en was de cellen vervolgens met koude PBS. Aspirateer de PBS.

Voeg 25 microliter niet-denaturerende lysisbuffer toe voor cellyse en incubeer gedurende 15 minuten op ijs met zacht schommelen. Voeg vervolgens 20 microliter van het resulterende lysaat toe aan een nieuwe testplaat met 96-wells met 100 microliter van een Firefly luciferase-substraatreagens en meng de plaat voorzichtig door te tikken. Laad de plaat op een platenlezer en meet de luminescentie met behulp van een topdetector met een leeshoogte van één millimeter en een integratietijd van één seconde.

Voeg onmiddellijk na het lezen van de Firefly luciferase luminescentie 100 microliter Renilla luciferase substraat toe aan de putten, die de Firefly luciferase activiteit dooft tijdens het beoordelen van Renilla luciferase activiteit. Meng de monsters door voorzichtige plaatbeweging en meet de luminescentie opnieuw om de Renilla luciferase-activiteit te beoordelen. Vergelijk de relatieve activiteit van varianteiwitten door de reacties van de verslaggever te kwantificeren en de Firefly- en Renilla-waarde voor elke variant te normaliseren met het wilde type Ube3a.

HEK293T-cellen getransfecteerd met toenemende hoeveelheden plasmide die coderen voor wild-type Ube3a vertonen een lineaire toename van de BAR-respons. De BAR-test identificeert ziektegerelateerde varianten van de plasmiden en toont de nauwkeurigheid en algemeenheid van deze methode aan. BAR-testscreening voor 152 Ube3a-varianten toont goedaardig functieverlies en winst van functiemutaties ten opzichte van wild-type Ube3a.

De winst van functie glutamaatsubstitutie, verlies van functie proline substitutie en een ander verlies van functie arginine substitutie op positie 588 van Ube3a produceerde drastisch verschillende effecten, waardoor het belang van empirische variantbeoordeling werd onderstreept. De heat plot toont genormaliseerde BAR-resultaten voor uitgebreide mutatieanalyse op positie 588 in Ube3a. De witte arcering vertegenwoordigt wild-type Ube3a-activiteitsniveaus, de blauwe arcering duidt op functieverlies en de rode arcering duidt op winst van functiemutaties.

Naast de klinische implicaties van ons werk, is Ube3a een lid van de HECT-domeinfamilie van ubiquitine-ligases, die allemaal het geconserveerde HECT-katalytische domein bezitten. En ik denk dat een van de fascinerende aspecten van ons werk is dat het rijke structuurfunctiegegevens over Ube3a biedt, en dit kan worden gebruikt om een dieper mechanistisch begrip te krijgen voor deze klasse van enzymen.