Name: Een schaalbare, op cellen gebaseerde methode voor de functionele beoordeling van Ube3a-varianten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: Leer een schaalbare celgebaseerde methode voor de functionele beoordeling van Ube3a-varianten met luciferase-assays in HEK293T-cellen. Deze techniek helpt onderzoekers bij het identificeren van gain- en loss-of-function mutaties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door een Simons Foundation Bridge to Independence Award (SFARI Award #387972; J.J.Y.), een NARSAD Young Investigator Award van de Brain and Behavior Research Foundation (J.J.Y.), een Research Fellowship van de Alfred P. Sloan Foundation (J.J.Y.), en onderzoeksbeurzen van de Angelman Syndrome Foundation (J.J.Y.), de Whitehall Foundation (J.J.Y.) en de NIMH (R01MH122786; J.J.Y.).

1. Mutagenese klonen om Ube3a varianten te genereren
<ol><li>Kloon alle Ube3a-varianten in het pCIG2-plasmide (figuur 1A), een bicistronische vector die een kip-β-actinepromotor en een interne ribosoominvoerplaats (IRES) bevat voor EGFP-expressie19. Ube3a-constructies van volledige lengte bevatten een N-terminale Myc-tag-reeks en worden gekloond in pCIG2 met behulp van een 5 'SacI-site en een 3'XmaI-site. Bovendien worden natuurlijk voorkomende EcoRI-, EcoRV- en PstI-sites binnen de Ube3a-coderingssequentie ook gebruikt om subklonefragmenten te maken. OPMERKING: Gedeïdentificeerde varianten voor Ube3a kunnen worden verkregen via de literatuur en in openbaar toegankelijke repositories zoals de ClinVar-database1. Aanvullende niet-gerapporteerde varianten kunnen worden verkregen via persoonlijke communicatie met medische centra.</li>
	<li>Gebruik een aangepaste tweestaps megaprimer mutagenese methode20 om mutaties in het Ube3a-leesframe te introduceren. Ontwerp in de eerste stap het mutagene oligonucleotide dat de gewenste mutatie bevat (het voorbeeld in dit protocol is om een UBE3A Q588E-variant te genereren) geflankeerd door ten minste 30 basenparen (bp) homologie 5′ en 3′ tot de mutatie (figuur 1B en tabel 1).</li>
	<li>Gebruik het mutagene oligonucleotide samen met een complementair oligonucleotide voor de eerste ronde PCR om een megaprimer van 200-400 bp te genereren die de mutatie bevat (figuur 1C; Tabel 2 en tabel 3). Gebruik de volledige 50 μL van het PCR-reactievolume voor agarose gel-elektroforese met behulp van een 1% gel en daaropvolgende gelzuivering (materiaaltabel). Eluteer het PCR-product in 30 μL gedeïoniseerd H2O (diH2O) voor gebruik in de tweede ronde PCR-stap hieronder.</li>
	<li>Stel de tweede ronde PCR in zoals aangegeven (figuur 1C; Tabel 2 en tabel 3). Deze stap genereert grotere DNA-fragmenten (meestal ~ 1-1,5 kb lang) met de mutatie- en terminale beperkingsplaatsen die geschikt zijn voor subklonen (figuur 1C).</li>
	<li>Na voltooiing van de PCR-reactie, zuivert u het resulterende product met behulp van een PCR-zuiveringskit (Materiaaltabel). Eluteer in 30 μL en verteer al het gezuiverde product en de pCIG2 Ube3a WT-constructie met de juiste restrictie-enzymen (het voorbeeld toont de spijsvertering met EcoRI en XmaI).</li>
	<li>Na 2 uur vertering bij 37 °C, los de verteringsproducten op door middel van agarose gel elektroforese (1% gel) en gelzuiver de juiste producten. Stel ligaties in volgens het protocol van de fabrikant (Tabel van Materialen), transformeer de ligatieproducten in een DH10B-bacteriestam (Tabel van Materialen) en plaats vervolgens met ampicilline (100 μg / ml) selectie.</li>
	<li>Kies de volgende dag twee tot vier kolonies om 3 ml culturen met Luria Bouillon (LB) en 100 μg / ml ampicilline te enten. Laat de culturen een nacht groeien bij 37 °C in een orbitale incubator met schudden (225 rpm).</li>
	<li>Gebruik de volgende dag 1-1,5 ml van de bacteriecultuur om het plasmide-DNA te miniprepteren (materiaaltabel). Bewaar de resterende cultuur door ze op 4 °C te plaatsen. Screen de miniprepped plasmiden door Sanger sequencing met behulp van een oligonucleotide dat ~200 bp bindt van de gewenste mutatie.</li>
	<li>Gebruik de bacterieculturen die bij 4 °C zijn opgeslagen om 50 ml culturen opnieuw te enten om het juiste plasmide te midiprepen (Tabel van Materialen). Volledige sequence de Ube3a-coderende sequentie om de juiste sequentie van het DNA te valideren.</li>
	<li>Creëer werkvoorraden van Ube3a variant plasmiden, evenals de β-catenine geactiveerde reporter (BAR)21, TK-Renilla luciferase, ligase-dode Ube3a (UBE3A C820A mutatie), en pCIG2 lege vector in een concentratie van 100 ng/μL met behulp van steriele H2O voor de daaropvolgende transfectiestappen.</li>
</ol>2. Bereiding en transfectie van menselijke embryonale nier 293T (HEK293T) cellen
<ol><li>Voer de testen uit in HEK293T-cellen gekweekt in Dulbecco's gemodificeerde Eagle-medium (DMEM) vooraf aangevuld met glutamine, 10% foetaal runderserum (FBS) en antibioticum-antimycotisch middel zoals eerder beschreven17. Kweek de cellen in een steriele, bevochtigde incubator bij 37 °C met 5% CO2.</li>
	<li>Gebruik een bioveiligheidskast om eerst de gesuspendeerde HEK293T-cellen op weefselkweekbehandelde 96-well flat-bottomed platen te plaatsen met een dichtheid van 2,2 × 104 cellen per put in 100 μL kweekmedia en laat ze 's nachts groeien.</li>
	<li>Transfecteer op de tweede dag de cellen in een bioveiligheidskast met Firefly en Renilla luciferase reporter plasmiden (tabel 4) en Ube3a plasmiden in drievoud. Voer de transfecties uit in 10 μL totaal volume per put met behulp van een verhouding van 10:1:8 van plasmiden (respectievelijk 50 ng BAR, 5 ng TK-Renilla en 40 ng Ube3a plasmide per put), zoals eerder beschreven18 en 0,4 μL transfectiereagens (tabel 4). OPMERKING: Voor elk experiment worden een lege vector (alleen GFP) en een plasmide dat codeert voor ligase-dode Ube3a ook getransfecteerd om als negatieve controles te dienen.</li>
	<li>Maak een hoofdmengsel voor de transfecties voor elke variant in een microcentrifugebuis van 1,5 ml (tabel 4) en incubeer bij kamertemperatuur (RT) gedurende 15 minuten. Roer na de incubatie voorzichtig het transfectiemengsel door op de buis te tikken en voeg vervolgens 10 μL van het transfectiemengsel rechtstreeks toe aan de bestaande groeimedia in de putten.</li>
	<li>Breng daarna de cellen terug naar de couveuse en laat de plasmiden gedurende 48 uur tot expressie komen. Vervanging van de groeimedia is niet nodig.</li>
	<li>Bewaak de transfectie-efficiëntie door GFP-fluorescentie met behulp van een fluorescentiemicroscoop. HEK293T-cellen worden efficiënt getransfecteerd door deze methode en >80% van de cellen zou GFP na 48 uur tot expressie moeten brengen.</li>
</ol>3. Meting van luciferase-activiteit
OPMERKING: Luciferase-activiteit wordt beoordeeld met behulp van een in de handel verkrijgbaar systeem dat zowel Firefly als Renilla luciferase (Materiaaltabel) test volgens het protocol van de fabrikant.
<ol><li>Zuig de kweekmedia zorgvuldig op uit getransfecteerde HEK293T-cellen en was de cellen vervolgens met koude fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS). Aspirateer de PBS en lyseer de cellen door 25 μL niet-denaturerende lysisbuffer toe te voegen en incubeer gedurende 15 minuten met zacht schommelen op ijs.</li>
	<li>Voeg daarna 20 μL van het resulterende lysaat (er is geen centrifugatie nodig) toe aan een nieuwe 96-well testplaat met 100 μL van een Firefly luciferase substraatreagens. Meng het bord voorzichtig door te tikken.</li>
	<li>Plaats de plaat op een platenlezer en meet de luminescentie met behulp van een topdetector met een leeshoogte van 1 mm en een integratietijd van 1 s. OPMERKING: De versterking van de detector moet mogelijk worden aangepast op basis van de sterkte van het signaal.</li>
	<li>Voeg onmiddellijk na het uitlezen van de Firefly luciferase luminescentie 100 μL Renilla luciferase substraat toe aan de putten. Deze stap dooft tegelijkertijd de Firefly luciferase-activiteit tijdens het beoordelen van renilla luciferase-activiteit. Meng de monsters door voorzichtige beweging van de plaat en meet de luminescentie opnieuw om de Renilla luciferase-activiteit te beoordelen. OPMERKING: Hoewel andere platen voor deze test kunnen worden gebruikt, zal het gebruik van platen met zwarte frames en witte putten de meest gevoelige resultaten opleveren, omdat dit het luciferasesignaal versterkt en ruis minimaliseert.</li>
	<li>Kwantificeer de reacties van de verslaggever als de Firefly luciferase to Renilla luciferase ratio (Firefly/Renilla) en gemiddelde de waarden van de drievoudige metingen. Normaliseer daarna de Firefly/Renilla-waarde voor elke variant tegen de waarden voor wild-type (WT) Ube3a-expressiecellen om de relatieve activiteit van varianteiwitten te vergelijken.</li>
</ol>

<ol><li>Landrum, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ClinVar%3A+Public+archive+of+relationships+among+sequence+variation+and+human+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">ClinVar: Public archive of relationships among sequence variation and human phenotype.</a> Nucleic Acids Research. 42, 980-985 (2014).</li>
<li>Lek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein-coding+genetic+variation+in+60%2C706+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein-coding genetic variation in 60,706 humans.</a> Nature. 536 (7616), 285-291 (2016).</li>
<li>Starita, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variant+interpretation%3A+Functional+assays+to+the+rescue%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Variant interpretation: Functional assays to the rescue.</a> American Journal of Human Genetics. 101 (3), 315-325 (2017).</li>
<li>Scheffner, M., Huibregtse, J. M., Vierstra, R. D., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HPV-16+E6+and+E6-AP+complex+functions+as+a+ubiquitin-protein+ligase+in+the+ubiquitination+of+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The HPV-16 E6 and E6-AP complex functions as a ubiquitin-protein ligase in the ubiquitination of p53.</a> Cell. 75 (3), 495-505 (1993).</li>
<li>Albrecht, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imprinted+expression+of+the+murine+Angelman+syndrome+gene%2C+Ube3a%2C+in+hippocampal+and+Purkinje+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Imprinted expression of the murine Angelman syndrome gene, Ube3a, in hippocampal and Purkinje neurons.</a> Nature Genetics. 17 (1), 75-78 (1997).</li>
<li>Rougeulle, C., Glatt, H., Lalande, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Angelman+syndrome+candidate+gene%2C+UBE3A%2FE6-AP%2C+is+imprinted+in+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">The Angelman syndrome candidate gene, UBE3A/E6-AP, is imprinted in brain.</a> Nature Genetics. 17 (1), 14-15 (1997).</li>
<li>Vu, T. H., Hoffman, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imprinting+of+the+Angelman+syndrome+gene%2C+UBE3A%2C+is+restricted+to+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Imprinting of the Angelman syndrome gene, UBE3A, is restricted to brain.</a> Nature Genetics. 17 (1), 12-13 (1997).</li>
<li>Kishino, T., Lalande, M., Wagstaff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UBE3A%2FE6-AP+mutations+cause+Angelman+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">UBE3A/E6-AP mutations cause Angelman syndrome.</a> Nature Genetics. 15 (1), 70-73 (1997).</li>
<li>Jiang, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+of+the+Angelman+ubiquitin+ligase+in+mice+causes+increased+cytoplasmic+p53+and+deficits+of+contextual+learning+and+long-term+potentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mutation of the Angelman ubiquitin ligase in mice causes increased cytoplasmic p53 and deficits of contextual learning and long-term potentiation.</a> Neuron. 21 (4), 799-811 (1998).</li>
<li>Mabb, A. M., Judson, M. C., Zylka, M. J., Philpot, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angelman+syndrome%3A+Insights+into+genomic+imprinting+and+neurodevelopmental+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Angelman syndrome: Insights into genomic imprinting and neurodevelopmental phenotypes.</a> Trends in Neuroscience. 34 (6), 293-303 (2011).</li>
<li>Hogart, A., Wu, D., LaSalle, J. M., Schanen, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comorbidity+of+autism+with+the+genomic+disorders+of+chromosome+15q11.2-q13%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">The comorbidity of autism with the genomic disorders of chromosome 15q11.2-q13.</a> Neurobiology of Disease. 38 (2), 181-191 (2010).</li>
<li>Urraca, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interstitial+duplication+15q11.2-q13+syndrome+includes+autism%2C+mild+facial+anomalies+and+a+characteristic+EEG+signature%5BTitle%5D)+AND+%22Autism+Research%22%5BJournal%5D)">The interstitial duplication 15q11.2-q13 syndrome includes autism, mild facial anomalies and a characteristic EEG signature.</a> Autism Research. 6 (4), 268-279 (2013).</li>
<li>de la Torre-Ubieta, L., Won, H., Stein, J. L., Geschwind, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancing+the+understanding+of+autism+disease+mechanisms+through+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Advancing the understanding of autism disease mechanisms through genetics.</a> Nature Medicine. 22 (4), 345-361 (2016).</li>
<li>Scheffner, M., Staub, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HECT+E3s+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">HECT E3s and human disease.</a> BMC Biochemistry. 8, Suppl 1 (2007).</li>
<li>Cooper, E. M., Hudson, A. W., Amos, J., Wagstaff, J., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+analysis+of+Angelman+syndrome-associated+mutations+in+the+E3+ubiquitin+ligase+E6-associated+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Biochemical analysis of Angelman syndrome-associated mutations in the E3 ubiquitin ligase E6-associated protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (39), 41208-41217 (2004).</li>
<li>Yi, J. J., Barnes, A. P., Hand, R., Polleux, F., Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+signaling+specifies+axons+during+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TGF-beta signaling specifies axons during brain development.</a> Cell. 142 (1), 144-157 (2010).</li>
<li>Yi, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+autism-linked+UBE3A+T485A+mutant+E3+ubiquitin+ligase+activates+the+Wnt%2Fbeta-catenin+pathway+by+inhibiting+the+proteasome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The autism-linked UBE3A T485A mutant E3 ubiquitin ligase activates the Wnt/beta-catenin pathway by inhibiting the proteasome.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (30), 12503-12515 (2017).</li>
<li>Weston, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+disease-linked+hyperactivating+mutations+in+UBE3A+through+large-scale+functional+variant+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Identification of disease-linked hyperactivating mutations in UBE3A through large-scale functional variant analysis.</a> Nature Communications. 12 (1), 6809(2021).</li>
<li>Hand, R., Polleux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenin2+regulates+the+initial+axon+guidance+of+cortical+pyramidal+neurons+projecting+medially+to+the+corpus+callosum%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Development%22%5BJournal%5D)">Neurogenin2 regulates the initial axon guidance of cortical pyramidal neurons projecting medially to the corpus callosum.</a> Neural Development. 6, 30(2011).</li>
<li>Karginov, A. V., Ding, F., Kota, P., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+allosteric+activation+of+kinases+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Engineered allosteric activation of kinases in living cells.</a> Nature Biotechnology. 28 (7), 743-747 (2010).</li>
<li>Biechele, T. L., Moon, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+beta-catenin%2FTCF+transcription+with+beta-catenin%2FTCF+transcription-based+reporter+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Assaying beta-catenin/TCF transcription with beta-catenin/TCF transcription-based reporter constructs.</a> Methods in Molecular Biology. , 99-110 (2008).</li>
<li>Yi, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Autism-linked+mutation+disables+phosphorylation+control+of+UBE3A%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An Autism-linked mutation disables phosphorylation control of UBE3A.</a> Cell. 162 (4), 795-807 (2015).</li>
<li>Kuhnle, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angelman+syndrome-associated+point+mutations+in+the+Zn%282%2B%29-binding+N-terminal+%28AZUL%29+domain+of+UBE3A+ubiquitin+ligase+inhibit+binding+to+the+proteasome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Angelman syndrome-associated point mutations in the Zn(2+)-binding N-terminal (AZUL) domain of UBE3A ubiquitin ligase inhibit binding to the proteasome.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (47), 18387-18399 (2018).</li>
<li>Yamamoto, Y., Huibregtse, J. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+E6-AP+gene+%28UBE3A%29+encodes+three+potential+protein+isoforms+generated+by+differential+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">The human E6-AP gene (UBE3A) encodes three potential protein isoforms generated by differential splicing.</a> Genomics. 41 (2), 263-266 (1997).</li>
<li>Avagliano Trezza, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+nuclear+UBE3A+causes+electrophysiological+and+behavioral+deficits+in+mice+and+is+associated+with+Angelman+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Loss of nuclear UBE3A causes electrophysiological and behavioral deficits in mice and is associated with Angelman syndrome.</a> Nature Neuroscience. 22 (8), 1235-1247 (2019).</li>
<li>Bossuyt, S. N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+nuclear+UBE3A+activity+is+the+predominant+cause+of+Angelman+syndrome+in+individuals+carrying+UBE3A+missense+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Loss of nuclear UBE3A activity is the predominant cause of Angelman syndrome in individuals carrying UBE3A missense mutations.</a> Human Molecular Genetics. 30 (6), 430-442 (2021).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het hier beschreven protocol biedt een efficiënte en schaalbare methode om de enzymatische activiteit van Ube3a-varianten te beoordelen. Er zijn verschillende technische details die een zorgvuldige overweging rechtvaardigen bij het gebruik van deze test. Een overweging is de keuze van Wnt reporter plasmiden die in deze test worden gebruikt. Het hier beschreven protocol maakt specifiek gebruik van de β-catenine activated reporter (BAR)21, een reporter die een concatemeer van 12 T-cell fact...

Recente technologische ontwikkelingen hebben de sequencing van exomen en genomen routine gemaakt in klinische omgevingen 1,2. Dit heeft geleid tot de ontdekking van een groot aantal genetische varianten, waaronder miljoenen missense-varianten die meestal één aminozuur in een eiwit veranderen. Het begrijpen van de functionele betekenis van deze varianten blijft een uitdaging, en slechts een klein deel (~2%) van de bekende missense varianten heeft een klinische interpretatie 1,3.
Een prominent voorbeeld van dit probleem is Ube3a, een gen dat codeert voor een E3-ubiquitineligase dat zich richt op substraateiwitten voor afbraak4. Ube3a bevindt zich binnen chromosoom 15q11-13 en wordt uitsluitend uitgedrukt uit het maternale erfelijke allel 5,6,7. Observaties uit de ziektegenetica suggereren sterk dat onvoldoende of overmatige activiteit van het UBE3A-enzym verschillende neurologische ontwikkelingsstoornissen veroorzaakt. Deletie van maternale chromosoom 15q11-13 veroorzaakt Angelman-syndroom (AS)8, een aandoening die wordt gekenmerkt door ernstige intellectuele achterstand, motorische stoornissen, epileptische aanvallen, een gelukkige houding met frequent glimlachen en dysmorfe gelaatstrekken 8,9,10. Daarentegen veroorzaakt duplicatie of tripplicatie van maternale chromosoom 15q11-13 het Dup15q-syndroom, een heterogene aandoening die wordt erkend als een van de meest voorkomende syndromale vormen van autisme 11,12,13. Bovendien zijn er honderden missense-varianten geïdentificeerd in Ube3a, waarvan de meerderheid wordt beschouwd als varianten van onzekere betekenis (VUS) omdat hun functionele en klinische betekenis onbekend zijn. Er is dus veel interesse in het ontwikkelen van methoden die Ube3a-varianten empirisch kunnen beoordelen om te bepalen of ze bijdragen aan neurologische ontwikkelingsziekten.
Het UBE3A-enzym behoort tot de HECT-domeinfamilie (homoloog aan E6-AP C-terminus) van E3-ubiquitine-ligases die allemaal het gelijknamige HECT-domein bezitten, dat de biochemische machinerie bevat die nodig is om geactiveerd ubiquitine uit E2-enzymen te accepteren en over te brengen naar substraateiwitten14. Historisch gezien is de karakterisering van E3-enzymen gebaseerd op gereconstitueerde in vitro systemen die een ensemble van gezuiverde eiwitten vereisen 4,15,16. Dergelijke methoden zijn traag en arbeidsintensief en niet vatbaar voor het beoordelen van de activiteit van een groot aantal varianten. In eerder werk werd UBE3A geïdentificeerd om de Wnt-route in HEK293T-cellen te activeren door de functie van het proteasoom te moduleren om de afbraak van β-catenine17 te vertragen. Dit inzicht maakt het gebruik van Wnt-pathway-verslaggevers mogelijk als een efficiënte en snelle methode om zowel verlies- als gain-of-function-varianten van Ube3a18 te identificeren. Het onderstaande protocol beschrijft in detail een methode om Ube3a-varianten te genereren, evenals een op luciferase gebaseerde verslaggever om veranderingen in de activiteit van Ube3a-varianten te beoordelen.

<table><tbody><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>1 Kb DNA ladder</td><td>Lambda Biotech</td><td>M108-S</td><td></td></tr><tr><td>100 bp DNA Ladder</td><td>Lambda Biotech</td><td>M107</td><td></td></tr><tr><td>10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10 mM ATP</td><td>New England BioLabs</td><td>B0202A</td><td></td></tr><tr><td>5x Phusion HF Reaction Buffer</td><td>New England BioLabs</td><td>B0518S</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic Solution</td><td>Corning</td><td>30004CI</td><td></td></tr><tr><td>Black/White Isoplate-96 Black Frame White Well plate</td><td>PerkinElmer</td><td>6005030</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillin Disodium Salt</td><td>Midwest Scientific</td><td>KCC46000-5</td><td></td></tr><tr><td>Countess cell counting chamber&nbsp; slides</td><td>Invitrogen by Thermo Fisher Scientific</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>Countess II Automated Cell Counter&nbsp;</td><td>life technologies</td><td></td><td>Celteller</td></tr><tr><td>Custom DNA oligos</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix</td><td>New England BioLabs</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate</td><td>Gibco</td><td>10569044</td><td>Basismedium voor het ondersteunen van de groei van de HEK293T-cellijn</td></tr><tr><td>DPBS (1x)</td><td>Gibco</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>Dual-Luciferase Reporter Assay System</td><td>Promega</td><td>E1910</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>R3101S</td><td>Beperkingsenzym</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated</td><td>Gibco</td><td>16140071</td><td>Fetaal bovien serum</td></tr><tr><td>Fisherbrand Surface Treated Tissue Culture Dishes</td><td>Fisherbrand</td><td>FB012924</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE 6 Transfection Reagent</td><td>Promega</td><td>E2691</td><td></td></tr><tr><td>Gel Loading Dye Purple (6x)</td><td>New England BioLabs</td><td>B7024A</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>High Efficiency ig 10B Chemically Competent Cells</td><td>Intact Genomics</td><td>1011-12</td><td>E. coli DH10B-cellen</td></tr><tr><td>HiSpeed Plasmid Midi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12643</td><td>Midi prep</td></tr><tr><td>pCIG2 plasmid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pGL3 BAR plasmid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phusion HF DNA Polymerase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0530L</td><td>DNA-polymerase</td></tr><tr><td>ProFlex 3 x 32 well PCR System</td><td>Applied biosystems by life technologies</td><td></td><td>Thermocycler</td></tr><tr><td>pTK Renilla plasmid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>Mini prep</td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit (250)</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td>Gel zuivering</td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit (250)</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td>PCR-zuivering</td></tr><tr><td>rCutSmart Buffer</td><td>New England BioLabs</td><td>B6004S</td><td></td></tr><tr><td>SacI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3156S</td><td>Beperkingsenzym</td></tr><tr><td>Synergy HTX Multi-Mode Reader</td><td>BioTek</td><td></td><td>&nbsp;Plate reader draait op Gen5 software v3.08 (BioTek)</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202L</td><td>Ligase</td></tr><tr><td>TAE Buffer, Tris-Acetate-EDTA, 50x Solution, Electrophoresis</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP13324</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Culture Plate 96 wells, Flat Bottom</td><td>Fisherbrand</td><td>FB012931</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Ethidium Bromide Solution</td><td>Invitrogen by Thermo Fisher Scientific</td><td>15585011</td><td></td></tr><tr><td>XmaI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0180S</td><td>Beperkingsenzym</td></tr></tbody></table>

een schaalbare, op cellen gebaseerde methode voor de functionele beoordeling van ube3a-varianten

A Scalable, Cell-Based Method for the Functional Assessment of Ube3a Variants

Het toegenomen gebruik van sequencing in de geneeskunde heeft miljoenen coderende varianten in het menselijk genoom geïdentificeerd. Veel van deze varianten komen voor in genen die geassocieerd zijn met neurologische ontwikkelingsstoornissen, maar de functionele betekenis van de overgrote meerderheid van de varianten blijft onbekend. Het huidige protocol beschrijft de studie van varianten voor Ube3a, een gen dat codeert voor een E3 ubiquitine ligase gekoppeld aan zowel autisme als angelmansyndroom. Duplicatie of drievoud van Ube3a is sterk gekoppeld aan autisme, terwijl de deletie ervan het Angelman-syndroom veroorzaakt. Het begrijpen van de valentie van veranderingen in UBE3A-eiwitactiviteit is dus belangrijk voor klinische resultaten. Hier wordt een snelle, op cellen gebaseerde methode beschreven die Ube3a-varianten koppelt aan een Wnt-padverslaggever. Deze eenvoudige test is schaalbaar en kan worden gebruikt om de valentie en omvang van activiteitsveranderingen in elke Ube3a-variant te bepalen. Bovendien maakt de faciliteit van deze methode het mogelijk om een schat aan structuurfunctie-informatie te genereren, die kan worden gebruikt om diepgaande inzichten te krijgen in de enzymatische mechanismen van UBE3A.

Grootschalige functionele screening van Ube3a missense-varianten identificeert een breed landschap van verlies- en gain-of-function-mutaties Eerder werk met Ube3a-mutanten suggereerde dat de Wnt-respons kan dienen als een verslaggever van cellulaire UBE3A-eiwitactiviteit. Deze waarnemingen werden uitgebreid en aanvullende validatie-experimenten werden uitgevoerd om te onderzoeken of de BAR-test geschikt is om een reeks UBE3A-activiteiten in de cel te rapporteren. Ten eerste werden HE...

Een eenvoudige en schaalbare methode werd ontwikkeld om de functionele betekenis van missense-varianten in Ube3a te beoordelen, een gen waarvan het verlies en de winst van functie verband houden met zowel het Angelman-syndroom als de autismespectrumstoornis.

Een schaalbare, op cellen gebaseerde methode voor de functionele beoordeling van Ube3a-varianten

The increased use of sequencing in medicine has identified millions of coding variants in the human genome. Many of these variants occur in genes ...

Onze methode biedt een snelle manier om de functionele impact van varianten in Ube3a te begrijpen, een ubiquitineligase dat het Angelman-syndroom veroorzaakt en sterk gekoppeld is aan een genetische vorm van autisme die bekend staat als het Dup15q-syndroom. De karakterisering van ubiquitine ligase activiteit is traditioneel arbeidsintensief en langzaam, en dergelijke methoden zijn moeilijk en niet echt vatbaar voor karakterisering van de honderden varianten geïdentificeerd voor Ube3a. Angelman-syndroom wordt veroorzaakt door de deletie van het maternale Ube3a-gen, terwijl het Dup15q-syndroom wordt veroorzaakt door de duplicatie van de maternale Ube3a, dus het is belangrijk om af te leiden hoe missense-varianten de activiteit van het Ube3a-enzym veranderden, en dit is iets dat moeilijk te doen is zonder elke variant empirisch te testen.De procedure wordt gedemonstreerd door Jalin Stelzer, een onderzoekstechnicus in mijn laboratorium. Begin met het uitvoeren van de testen in HEK293T-cellen, gekweekt in Dulbecco's Modified Eagle Medium bij 37 graden Celsius, met 5% koolstofdioxide in een bevochtigde container, zoals beschreven in het manuscript. Plaats in een bioveiligheidskast de zwevende HEK293T-cellen op een met weefselkweek behandelde 96 goed platbodemplaat en incubeer de cellen 's nachts op 37 graden.Op de tweede dag transfecteer je de cellen in een bioveiligheidskast met Firefly en Renilla luciferase reporter plasmiden en Ube3a plasmiden in drievoud. Voer de transfecties uit in een totaal volume van 10 microliter per put. Maak een hoofdmix voor de transfecties voor elke variant in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.Roer na de incubatie voorzichtig het transfectiemengsel door op de buis te tikken en voeg vervolgens 10 microliter van het transfectiemengsel rechtstreeks toe aan de bestaande groeimedia in de putten. Breng daarna de cellen terug naar de couveuse en laat de plasmiden gedurende 48 uur tot expressie komen. Controleer met behulp van een fluorescentiemicroscoop de transfectie-efficiëntie door GFP-fluorescentie.Meer dan 80% van de cellen zou GFP na 48 uur tot expressie moeten brengen. Zuig de kweekmedia zorgvuldig op uit getransfecteerde HEK293T-cellen en was de cellen vervolgens met koude PBS. Aspirateer de PBS.Voeg 25 microliter niet-denaturerende lysisbuffer toe voor cellyse en incubeer gedurende 15 minuten op ijs met zacht schommelen. Voeg vervolgens 20 microliter van het resulterende lysaat toe aan een nieuwe testplaat met 96-wells met 100 microliter van een Firefly luciferase-substraatreagens en meng de plaat voorzichtig door te tikken. Laad de plaat op een platenlezer en meet de luminescentie met behulp van een topdetector met een leeshoogte van één millimeter en een integratietijd van één seconde.Voeg onmiddellijk na het lezen van de Firefly luciferase luminescentie 100 microliter Renilla luciferase substraat toe aan de putten, die de Firefly luciferase activiteit dooft tijdens het beoordelen van Renilla luciferase activiteit. Meng de monsters door voorzichtige plaatbeweging en meet de luminescentie opnieuw om de Renilla luciferase-activiteit te beoordelen. Vergelijk de relatieve activiteit van varianteiwitten door de reacties van de verslaggever te kwantificeren en de Firefly- en Renilla-waarde voor elke variant te normaliseren met het wilde type Ube3a.HEK293T-cellen getransfecteerd met toenemende hoeveelheden plasmide die coderen voor wild-type Ube3a vertonen een lineaire toename van de BAR-respons. De BAR-test identificeert ziektegerelateerde varianten van de plasmiden en toont de nauwkeurigheid en algemeenheid van deze methode aan. BAR-testscreening voor 152 Ube3a-varianten toont goedaardig functieverlies en winst van functiemutaties ten opzichte van wild-type Ube3a.De winst van functie glutamaatsubstitutie, verlies van functie proline substitutie en een ander verlies van functie arginine substitutie op positie 588 van Ube3a produceerde drastisch verschillende effecten, waardoor het belang van empirische variantbeoordeling werd onderstreept. De heat plot toont genormaliseerde BAR-resultaten voor uitgebreide mutatieanalyse op positie 588 in Ube3a. De witte arcering vertegenwoordigt wild-type Ube3a-activiteitsniveaus, de blauwe arcering duidt op functieverlies en de rode arcering duidt op winst van functiemutaties.Naast de klinische implicaties van ons werk, is Ube3a een lid van de HECT-domeinfamilie van ubiquitine-ligases, die allemaal het geconserveerde HECT-katalytische domein bezitten. En ik denk dat een van de fascinerende aspecten van ons werk is dat het rijke structuurfunctiegegevens over Ube3a biedt, en dit kan worden gebruikt om een dieper mechanistisch begrip te krijgen voor deze klasse van enzymen.

a-scalable-cell-based-method-for-functional-assessment-ube3a

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Hier presenteren we een systematische aanpak voor het ontwikkelen van fysiologisch relevante, gevoelige en...

In vivo modellering van de Morbid Human Genome behulp Danio rerio

Het huidige protocol Gegevens een werkwijze voor het meten van de activiteit van functioneel homoloog ubiquitinerings enzymen. Gespecialiseerde probes covalent enzym passen en zorgen voor detectie. Deze methode heeft de potentie om nieuwe therapeutische targets te identificeren.

Methode voor het meten van de activiteit van ubiquitinerings Enzymen in cellijnen en weefselmonsters

Nodulair heterotopia van de Periventricular (PNH) is de meest voorkomende vorm van misvorming van corticale ontwikkeling (MCD) in volwassenheid maar haar genetische basis blijft onbekend in meest sporadische gevallen. Onlangs hebben we een strategie nieuwe kandidaat om genen te identificeren voor MCDs en direct bevestigen hun oorzakelijke rol in vivo.

Een nieuwe strategie combinatie matrix-CGH, geheel-exome Sequencing en In Utero Electroporation bij knaagdieren ter identificatie van de oorzakelijke genen voor hersenen misvormingen

We presenteren een strategisch plan en protocol voor het identificeren van niet-coderende genetische varianten die de binding van transcriptiefactoren (TF) aan DNA beïnvloeden. Er wordt een gedetailleerd experimenteel protocol gegeven voor elektroforetische mobiliteitsverschuivingsassay (EMSA) en DNA-affiniteitsprecipitatie-assay (DAPA) analyse van genotype-afhankelijke TF DNA-binding.

Screening voor Functionele niet-coderende genetische varianten Met behulp van Electroforetische Mobility Shift Assay (EMSA) en DNA-affiniteit Neerslag Assay (DAPA)

Het doel van dit protocol is om het ontwerp en de prestaties van in vivo experimenten in Drosophila melanogaster te schetsen om de functionele gevolgen van zeldzame genvarianten in verband met menselijke ziekten te beoordelen.

In vivo functionele studie van ziekten-geassocieerde zeldzame menselijke varianten met behulp van Drosophila

De elektrochemiluminescentie immunoassay (ECLIA) is een nieuwe benadering voor kwantitatieve detectie van endogene en exogenously toegepaste MeCP2 eiwitvarianten, die zeer kwantitatieve, nauwkeurige en reproduceerbare metingen produceert met een lage intra- en inter-assay-fout over een breed werkbereik. Hier wordt het protocol voor de MeCP2-ECLIA in een 96-well formaat beschreven.

Een op elektrochemiluminescentie gebaseerde test voor MeCP2-eiwitvarianten

Dit protocol beschrijft benaderingen voor detectie en kwantificering van grote geaggregeerde en/of organelle extrusies (~4 μm) geproduceerd door C. elegans cellen in de vorm van membraangebonden exofofen. We beschrijven stammen, groeiomstandigheden, scorecriteria, timing en microscopie overwegingen die nodig zijn om dissectie van dit puin uitzetting mechanisme te vergemakkelijken.

Kwantitatieve benaderingen voor scoren in vivo Neuronal Aggregaat en Organelle Extrusie in Large Exopher Vesicles in C. elegans

Hier tonen de auteurs het nut van MULTI-seq voor fenotypering en daaropvolgende gepaarde scRNA-seq en scATAC-seq bij het karakteriseren van de transcriptomische en chromatinetoegankelijkheidsprofielen in retina.

Multiplexed analyse van retinale genexpressie en chromatinetoegankelijkheid met behulp van scRNA-Seq en scATAC-Seq

Dit protocol legt uit hoe het effect van genetische variatie geassocieerd met neurologische ontwikkelingsstoornissen op de deubiquitylerende enzymactiviteit kan worden gemeten door recombinante eiwitzuivering te combineren met ubiquitineketensplitsingstesten.

Het meten van enzymatische activiteit van met neurologische ontwikkelingsstoornissen geassocieerde deubiquitylerende enzymen via een in vitro ubiquitineketensplitsingstest

RASopathieën zijn multisysteem-genetische syndromen die worden veroorzaakt door hyperactivering van de RAS-MAPK-route. Potentieel pathogene varianten die wachten op validatie duiken continu op, terwijl slecht preklinisch bewijs de therapie beperkt. Hier beschrijven we ons in vivo protocol voor het testen en kruisvalideren van RASopathie-geassocieerde ERK-activeringsniveaus en de farmacologische modulatie ervan tijdens de embryogenese door middel van live FRET-beeldvorming in Teen-reporter...

Een efficiënt protocol om ERK-activiteitsmodulatie te beoordelen in vroege zebravismodellen van het Noonan-syndroom via live FRET-microscopie en immunofluorescentie

Leer een schaalbare celgebaseerde methode voor de functionele beoordeling van Ube3a-varianten met luciferase-assays in HEK293T-cellen. Deze techniek helpt onderzoekers bij het identificeren van gain- en loss-of-function mutaties.

Een schaalbare, op cellen gebaseerde methode voor de functionele beoordeling van Ube3a-varianten

Meer video's verkennen