Micro-engineering 3D collageen hydrogels met lange-afstand vezeluitlijning

Deze methode stelt ons in staat om 3D-collageenhydrogels te ontwikkelen met gecontroleerde niveaus van vezeluitlijning om omgevingen te modelleren die worden aangetroffen in gezond en ziek weefsel in het lichaam. Deze techniek biedt een eenvoudige microfluïdische benadering om uitgelijnde collageenhydrogels te engineeren, cellen te introduceren en te kwantificeren hoe cellen zich gedragen in topografisch gedefinieerde 3D-omgevingen. Neil Joshi, Mehran Mansouri, Ann Byerly en Justin Vidas demonstreren de procedure voor mijn laboratorium.

Monteer om te beginnen een 250 micrometer dik PDMS-vel op een plastic drager en snijd het microfluïdische ontwerp met behulp van een ambachtelijke snijder op een mesdiepte van 0,5 millimeter, een snelheid van één centimeter per seconde en een hoge kracht. Reinig met behulp van een ultrasoon bad de microfluïdische kanaaluitsparingen gedurende vijf minuten. Spoel de gesonificeerde kanalen in gedeïoniseerd water en droog ze gedurende vijf minuten op een hete plaat bij 100 graden Celsius.

Bewaar de kanalen in een schone, afgedekte petrischaal tot gebruik. Om de PDMS-deklaag te fabriceren en het oppervlak te functionaliseren voor toekomstige modificatie, bereidt u een 2% aminopropyltriethoxysilaanoplossing in een glazen bekerglas door één milliliter aminopropyltriethoxysilaan toe te voegen aan 49 milliliter aceton. Verdun vervolgens een 25% glutaaraldehyde-oplossing tot 5% in gedeïoniseerd water.

Maak twee milliliter oplossing voor elke afdeklaag van 24 millimeter bij 50 millimeter. Reinig de afdekslip in een badsonicator gedurende vijf minuten met behulp van IPA. Spoel de IPA van de afdekslips af met gedeïoniseerd water.

Een gladde laag water op de afdeklaag geeft aan dat de IPA grondig is gespoeld. Droog het deksel vijf minuten op een hete plaat bij 100 graden Celsius. Plaats de gedroogde hoesjes in schone petrischaaltjes en zorg ervoor dat ze elkaar niet overlappen.

Stel met behulp van een corona-ontladingsstokje de afdekking elk één minuut bloot aan een corona-ontlading. Verwijder de afdekslip binnen vijf minuten na blootstelling aan corona en dompel elke afdekslip gedurende 10 seconden onder in de aminopropyltriethoxysilaanoplossing, zodat de afdekslip wordt ondergedompeld Verwijder vervolgens de afdekstroken uit de aminopropyltriethoxysilaanoplossing, dompel ze gedurende 10 seconden onder in aceton en droog ze met perslucht. Plaats de droge deksel terug in de petrischaal, de behandelde kant naar boven gericht.

Pipetteer een milliliter glutaaraldehyde-oplossing op het oppervlak van elke afdekslip. Bedek zoveel mogelijk oppervlak zonder dat de oplossing over de rand van de afdekslip loopt. Laat de deksel 30 minuten in contact komen met de oplossing en spoel vervolgens gedurende 20 seconden af met gedeïoniseerd water.

Droog de afdekslips met perslucht en plaats ze terug in de petrischaaltjes, de met plasma behandelde kant naar boven Voor het lasersnijden van de modulaire magnetische basis, knipt u de ontwerpen uit de PMMA-laag met behulp van de juiste laserinstellingen, zoals het aantal passages en het vermogen. De laserinstellingen moeten worden aangepast, zodat de magneten in de PMMA-laag kunnen worden gedrukt. Was het lasergesneden deel met water en zeep om vuil uit het lasersnijproces te verwijderen.

Gebruik geen oplosmiddelen, omdat deze microscheurtjes in de lasergesneden randen kunnen verspreiden. Om het platform te monteren, duwt u magneten met de hand in de lasergesneden basis. De dikte van de magneten moet kleiner zijn dan de dikte van de PMMA-basis om ervoor te zorgen dat de magneten gelijk zijn met het oppervlak van de basis.

Verwijder de achterkant van de drukgevoelige lijm of PSA-plaat en bevestig de basis aan een met glutaaraldehyde behandelde afdeklaag met de gefunctionaliseerde kant naar boven gericht. Plaats de PDMS-kanaaluitsparing voorzichtig in de holte die door het frame wordt gedefinieerd. Druk met een pincet met brede punt om luchtbellen te verwijderen en te zorgen voor conformaal contact.

Plaats de runderserumalbumine of de met BSA behandelde kanaalafdekking bovenop de kanaaluitsparing met de BSA-zijde naar beneden gericht. Zorg ervoor dat de vloeistofinlaat- en uitlaatpoorten zijn uitgelijnd met het kanaal. Het apparaat is klaar voor de collageen I-injectie.

Plaats een spuitpomp, een gekoelde steriele spuit, gekoelde geneutraliseerde collageen I-oplossing en een steriele 20-gauge 90 graden luer lock naald in een bioveiligheidskast. Laad de collageen I-oplossing in de spuit en vermijd bubbels. Bevestig de punt van de naald aan de spuit, plaats de spuit in de spuitpomp, de naald naar beneden gericht en bereid de naald voor met collageen I-oplossing.

Stel de spuitpomp in op het vereiste debiet tussen 50 en 2.000 microliter per minuut. Plaats voorbereide PDMS-kanalen op een laboratoriumaansluiting en waterpas met de naald. Steek de naald in de inlaatpoort van het PDMS-kanaal.

Injecteer het kanaal totdat een druppel collageen van 30 microliter ik aan de uitlaatzijde verzamel. Laat de lab-aansluiting zakken en scheid de naald voorzichtig van het nieuw gevulde kanaal. Herhaal dit totdat alle kanalen zijn gevuld met collageen I-oplossing.

Laad de gevulde kanalen in de petrischalen naast een schoon, pluisvrij doekje verzadigd met gedeïoniseerd water om uitdroging van de nieuw gevormde collageen I-gel te voorkomen. Dek de petrischaal af en plaats de geladen kanalen twee uur in de incubator voor de afpelstap. Voor peel-off en media-equilibratie, begin met het optillen van de PDMS-cover met een pincet om de gepolymeriseerde collageen I-gel bloot te leggen.

Voeg 650 microliter endotheelgroeimedia toe aan de put. U kunt ook een andere module bevestigen om een extra collageenlaag te introduceren of mediaperfusiemogelijkheden te bieden. Laat de apparaten minimaal vier uur in de couveuse staan om de gel en media in evenwicht te brengen.

Vervang de media voor het zaaien door cellen. Het functionaliseren van de glazen afdekslip maakte kanaallancering mogelijk en het functionaliseren van de PDMS-afdekking met BSA voorkwam collageen I-bevestiging. De collageen I-vezeluitlijning bleef onaangetast na het optillen van de hoes.

Afbeeldingen van de HUVECs gekweekt op het uitgelijnde segment van de matrix toonden een verhoogde actinevezeluitlijning in vergelijking met de HUVECs op het segment met willekeurige vezels. Onze aanpak stelt ons in staat om de micro-omgeving van de tumor te modelleren en te kwantificeren hoe verschillende celtypen reageren. We kunnen ook stroomkanalen introduceren om langetermijnexperimenten te ondersteunen.