Name: Kwantificering van circulaire RNAs met behulp van digitale druppel-PCR (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-16T14:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Leer digitale druppel-PCR voor nauwkeurige kwantificering van circulaire RNA's in C2C12-spiercellen. Deze methode biedt hoge gevoeligheid zonder referentiegenen en versnelt moleculair diagnostisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door intramurale financiering van het Institute of Life Sciences, de DBT-onderzoeksbeurs (BT / PR27622 / MED / 30/1961/2018) en de Wellcome Trust / DBT India Alliance Fellowship [IA / I / 18/2/ 504017] toegekend aan Amaresh C. Panda. We bedanken andere lableden voor het proeflezen van het artikel.

RNA is gevoelig voor RN's; daarom moeten alle reagentia, instrumenten en werkruimten RNase-vrij zijn en met zorg worden behandeld.
1. Divergent primerontwerp voor circRNA (zie figuur 1)
<ol><li>Haal de volwassen sequentie op uit circRNA-annotatiegegevens met BEDTools of uit de UCSC-genoombrowser door de exon/intron-sequentie samen te voegen die aanwezig is tussen de backsplice-junctiecoördinaten18,19.</li>
	<li>Bereid een PCR-sjabloonsequentie voor van 200 nucleotiden in lengte door de laatste 100 nucleotiden van de totale circRNA-sequentielengte samen te voegen met de eerste 100 nucleotiden van de circRNA-sequentie10. OPMERKING: Als de circRNA-lengte minder dan 200 nucleotiden is, verdeel het dan in twee gelijke helften en voeg de nucleotiden van de laatste helft tot het begin van de eerste helft samen.</li>
	<li>Gebruik de bovenstaande sjabloonreeks voor primerontwerp met behulp van de Primer3-webtool en stel een PCR-productlengte in, variërend van 120-180 nucleotiden in lengte20.</li>
	<li>Gebruik de standaardinstellingen van Primer3 voor andere parameters zoals Tm en primerlengte. De primersequenties voor circBnc2 zijn opgenomen in tabel 1.</li>
	<li>Bestel de divergente primersequenties voor synthese bij elk oligosynthesebedrijf.</li>
</ol>2. RNA-isolatie
OPMERKING: Isoleer totaal RNA uit de C2C12-cellen van de muis met behulp van in de handel verkrijgbare kits of interne RNA-isolatiemethode. De interne RNA-isolatiemethode die hier wordt gebruikt, is eerder beschreven21. De magnetische silicakorrels worden in het lab bereid met behulp van het eerder gepubliceerde protocol22. Deze magnetische kralen kunnen ook worden verkregen bij verschillende leveranciers.
<ol><li>Neem een schaal van 10 cm met ongeveer 5 x 106 prolifererende C2C12 myoblastcellen en één 4-daagse gedifferentieerde C2C12 myotube voor RNA-isolatie.</li>
	<li>Was de cellen drie keer met 10 ml 1x PBS en gooi de PBS weg met een pipet.</li>
	<li>Schraap de cellen in 1 ml 1x PBS met behulp van een celschraper, centrifugeer ze bij 4 °C gedurende 5 minuten bij 750 x g en gooi de PBS weg met een pipet.</li>
	<li>Voeg 1 ml RNA-isolatiereagens (RIR) toe en laat de cellen lyseren door krachtig te pipetteren21.</li>
	<li>Voeg 200 μL (1/5 van het volume RIR) chloroform en vortex toe gedurende 15 s. Centrifugeer de buis bij 4 °C gedurende 10 minuten bij 12.000 x g.</li>
	<li>Neem 400 μL van de bovenste waterige laag, laad deze op een silicakolom en centrifugeer gedurende 1 minuut bij 12.000 x g bij kamertemperatuur. Neem de doorstroom naar een nieuwe buis en voeg 600 μL 100% ethanol toe.</li>
	<li>Voeg 20 μL magnetische silicaparels toe en plaats de buis op een thermomixer die gedurende 5 minuten is ingesteld op 25 °C en 1.200 tpm. OPMERKING: Het kraalvolume kan worden verhoogd of verlaagd, afhankelijk van de initiële celnummers die voor lysis worden genomen. Magnetische silica kralen kunnen worden verkregen van commerciële leveranciers.</li>
	<li>Plaats de buis op een magnetische standaard gedurende 30 s of totdat de oplossing helder wordt. Gooi het supernatant voorzichtig weg met een pipet.</li>
	<li>Resuspendeer de magnetische silicakorrels in een wasbuffer van 500 μL met 90% ethanol. Plaats de buis gedurende 30 s op de magnetische standaard. Draai de buis twee keer op de magnetische standaard om de kralen te wassen. Laat de kralen naar de magneet zakken en gooi de buffer weg met een pipet.</li>
	<li>Herhaal stap 2.9 tweemaal. Draai na het wassen de buis kort rond en plaats deze gedurende 30 s terug op de magnetische standaard. Gooi de resterende wasbuffer weg. Droog de buis aan de lucht bij 50 °C gedurende 3 minuten op een thermomixer en houd het deksel open.</li>
	<li>Voeg 20 μL nucleasevrij water toe en resuspendeer de kralen. OPMERKING: Het RNA-elutievolume kan worden verlaagd tot 10 μL om de RNA-concentratie op te schalen.</li>
	<li>Plaats de buizen gedurende 2-3 minuten op kamertemperatuur. Plaats de buis terug op de magnetische standaard en laat hem 30 s zitten. Verzamel het opgeloste RNA in een nieuwe buis voor kwantiteits- en kwaliteitsbeoordeling met behulp van een spectrofotometer. OPMERKING: RNA kan worden bewaard bij −20 °C of −80 °C voor langdurige opslag. Om een optimaal resultaat te krijgen, wordt aanbevolen om de volgende dag door te gaan met de cDNA-synthesestap.</li>
</ol>3. cDNA-synthese
<ol><li>Meet de RNA-concentratie met behulp van een spectrofotometer en neem 1 μg RNA voor cDNA-synthese.</li>
	<li>Meng 1 μg totaal RNA met 1 μL dNTP-mix (10 mM elk van dATP, dTTP, dGTP en dCTP), 4 μL 5x reverse transcriptase (RT) buffer, 2 μL 10x RT willekeurige primer, 0,25 μL reverse transcriptase-enzym (200 U/μL) en 0,5 μL RNase-remmer (40 U/μL) en vul het volume aan tot 20 μL met nucleasevrij water. OPMERKING: Het reverse transcriptase-enzymvolume kan worden gewijzigd afhankelijk van de initiële RNA-concentratie die wordt genomen voor cDNA-synthese.</li>
	<li>Tik op de buis om de reactie te mengen en draai kort. Plaats de buis gedurende 10 minuten op 25 °C, gevolgd door 1 uur op 50 °C.</li>
	<li>Om het enzym te inactiveren, plaatst u de buis gedurende 5 minuten op 85 °C.</li>
	<li>Koel de buis gedurende 2 minuten af en voeg 480 μL nucleasevrij water toe aan de buis om de cDNA-concentratie op 2 ng / μL te brengen. OPMERKING: cDNA kan worden bewaard bij -20 °C of onmiddellijk worden gebruikt voor dd-PCR-analyse.</li>
</ol>4. Digitale druppel PCR (dd-PCR) workflow
OPMERKING: De workflow van dd-PCR omvat meerdere stappen, te beginnen met de monstervoorbereiding, gevolgd door druppelgeneratie, PCR-versterking, druppeltellingen en gegevensanalyse. Elke stap is cruciaal voor nauwkeurige gegevensgeneratie, omdat dd-PCR de absolute kwantificering van producten omvat en geen standaardcurve nodig heeft. Daarom is elk van de verschillende stappen van dd-PCR hieronder beschreven.
<ol><li>Voorbereiding van de dd-PCR-reactie.<ol><li>Stel de PCR-reactie van 22 μL in 0,2 ml PCR-buizen of -strips in, samen met een negatieve controlebuis en NTC-buizen (niet-sjabloonbesturing). OPMERKING: Elk verschillend divergent primerpaar voor de detectie van verschillende cirkel-RNA's moet een NTC-reactie hebben samen met testmonsters.</li>
		<li>Voeg 11 μL dd-PCR master-mix (bijv. EvaGreen Supermix) en 11 μL nucleasevrij water toe om de negatieve controlebuis in te stellen. OPMERKING: Ontdooi de dd-PCR master-mix bij kamertemperatuur gevolgd door een korte vortex om een homogeen mengsel te maken. Gebruik hetzelfde nucleasevrije water om de negatieve controlereactiebuis en NTC-buizen in te stellen die werden gebruikt voor het verdunnen van het cDNA.</li>
		<li>Voeg 11 μL dd-PCR master-mix, 5,5 μL circRNA-specifieke voor- en achterwaartse primermix van 1 μM-concentratie en 5,5 μL nucleasevrij water toe om de NTC-reactiebuizen op te zetten. OPMERKING: Verdun de voorwaartse en omgekeerde cirkelvormige RNA-specifieke divergente primers van 100 μM-voorraad en meng om een werkconcentratie van 1 μM van voorwaartse en omgekeerde circRNA-primermix te bereiden; de uiteindelijke primerconcentratie is dus 250 nM in de reactie van 22 μL.</li>
		<li>Voeg 11 μL dd-PCR master-mix, 5,5 μL circRNA-specifieke voorwaartse en omgekeerde primermix van 1 μM-concentratie en 5,5 μL cDNA (2 ng/μL) toe om de reageerbuizen in te stellen.</li>
		<li>Vortex grondig gevolgd door het kort centrifugeren van alle reactiebuizen om een homogeen reactiemengsel aan de onderkant van de buizen te krijgen.</li>
	</ol></li>
	<li>Druppelgeneratie.<ol><li>Breng de 20 μL PCR-mengsel van 0,2 ml PCR-buizen over naar de monsterputten van de druppelgeneratorcartridge.</li>
		<li>Voeg voorzichtig 70 μL druppelgeneratieolie toe aan de oliebronnen van de druppelgeneratorcartridge met behulp van een meerkanaals pipet. OPMERKING: Incubeer de druppelgeneratieolie bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten voor gebruik.</li>
		<li>Bedek de druppelgeneratorcartridge met de rubberen pakking en plaats deze in de druppelgeneratormachine om het monster-oliedruppelmengsel te krijgen, gegenereerd in de druppelputten van de cartridge.</li>
	</ol></li>
	<li>PCR-versterking.<ol><li>Breng 40 μL van het monster-olieduppletmengsel over van de druppelputten van de druppelgeneratorcartridge naar een 96-well PCR-plaat met behulp van een meerkanaals pipet. OPMERKING: Breng het monster-oliedruppelmengsel voorzichtig over terwijl u een hoek maakt met de putten door de uiteinden van de meerkanaals pipet om te voorkomen dat de druppels breken terwijl u ze overbrengt naar de dd-PCR 96-putplaat.</li>
		<li>Sluit de 96-well PCR-plaat af met de aluminiumfoliesealer, plaats deze in het machineblok voorverwarmd op 80 °C en klik op seal voor het afdichten van de PCR-plaat.</li>
		<li>Plaats nu de plaat in de dd-PCR thermische cycler en stel het programma in zoals vermeld in tabel 2 met de dekseltemperatuur ingesteld op 105 °C en een hellingsnelheid van 2 °C/s.</li>
	</ol></li>
	<li>Druppels tellen.<ol><li>Zodra PCR voorbij is, plaatst u de plaat op de dd-PCR druppeltellermachine met de plaathouder in de juiste positie voor het tellen van de druppels.</li>
		<li>Open de druppelanalysesoftware en stel de run in door invoer te geven voor de voorbeeldinformatie.</li>
		<li>Klik op de installatieoptie. Klik vervolgens op de sjabloonoptie om een nieuwe sjabloon te openen.</li>
		<li>Definieer elke put door de details van het experiment, zoals monsternaam (cDNA gebruikt of negatieve controle of NTC), doelnaam (circRNA-primernaam) en type (onbekend) en experimenttype als ABS (absolute kwantificering) en Supermix (dd-PCR EvaGreen Supermix) te gebruiken, enz.</li>
		<li>Sla ten slotte de sjabloon op en start de run door op de run-optie te klikken en telling per rij of kolom te selecteren. Laat de machine de druppeltelling voltooien, wat ongeveer 1 minuut / put duurt.</li>
		<li>Klik op de knop Analyseren om de gegevens te analyseren na het voltooien van de druppellezing.</li>
		<li>Klik op de knop 1D Amplitude om de positieve en negatieve druppels te zien</li>
		<li>Om de positieve druppels van de negatieve druppels te scheiden, plaatst u een gemeenschappelijke drempellijn voor alle monsters met hetzelfde doel. OPMERKING: De totale druppels in elk monster moeten hoger zijn dan 10.000 om in aanmerking te komen voor absolute kwantificering. De NTC mag geen positieve druppeltellingen vertonen. De aanwezigheid van positieve druppels in de NTC duidt op besmetting van de reagentia of versterking van de primerdimeer. Het is moeilijk om erachter te komen of de positieve druppels primer dimeren of niet-specifieke producten in NTC hebben. Het wordt aanbevolen om de primers te controleren en verontreiniging van de reagentia te vermijden als algemene praktijk voor elke PCR, inclusief dd-PCR.</li>
		<li>Klik op de knop Exporteren om de gegevens van het circRNA-telt te exporteren als een .csv bestand. De geëxporteerde gegevens tonen het aantal cirkel-RNA's dat in elk monster aanwezig is.</li>
		<li>Bereken handmatig het aantal circRNA's in elk monster per nanogram RNA door rekening te houden met de totale hoeveelheid cDNA die in elke reactie wordt gebruikt.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+RNAs+are+the+predominant+transcript+isoform+from+hundreds+of+human+genes+in+diverse+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types.</a> PLoS One. 7 (2), 30733(2012).</li>
<li>Chen, L. L., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+circRNA+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of circRNA biogenesis.</a> RNA Biology. 12 (4), 381-388 (2015).</li>
<li>Kristensen, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biogenesis%2C+biology+and+characterization+of+circular+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">The biogenesis, biology and characterization of circular RNAs.</a> Nature Reviews Genetics. 20 (11), 675-691 (2019).</li>
<li>Chen, X., Zhou, M., Yant, L., Huang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+RNA+in+disease%3A+Basic+properties+and+biomedical+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews.+RNA%22%5BJournal%5D)">Circular RNA in disease: Basic properties and biomedical relevance.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. , (2022).</li>
<li>Sinha, T., Panigrahi, C., Das, D., Chandra Panda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+RNA+translation%2C+a+path+to+hidden+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews.+RNA%22%5BJournal%5D)">Circular RNA translation, a path to hidden proteome.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 13 (1), 1685(2022).</li>
<li>Panda, A. C. Circular RNAs Act as miRNA Sponges. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPanda%2C+AC+%22Circular+RNAs%3A+Biogenesis+and+Functions%22">Circular RNAs: Biogenesis and Functions</a>. Xiao, J. , Springer. Singapore. 67-79 (2018).</li>
<li>Das, A., Sinha, T., Shyamal, S., Panda, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+role+of+circular+RNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Non-Coding+RNA%22%5BJournal%5D)">Emerging role of circular RNA-protein interactions.</a> Non-Coding RNA. 7 (3), 48(2021).</li>
<li>Verduci, L., Tarcitano, E., Strano, S., Yarden, Y., Blandino, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CircRNAs%3A+Role+in+human+diseases+and+potential+use+as+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">CircRNAs: Role in human diseases and potential use as biomarkers.</a> Cell Death & Disease. 12 (5), 468(2021).</li>
<li>Pandey, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+analysis+of+circular+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+RNA%22%5BJournal%5D)">Methods for analysis of circular RNAs.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 11 (1), 1566(2020).</li>
<li>Das, A., Das, D., Panda, A. C. Validation of circular RNAs by PCR. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDas%2C+A+%22PCR+Primer+Design.+Methods+in+Molecular+Biology%22">PCR Primer Design. Methods in Molecular Biology</a>. 2392, Humana. New York, NY. 103-114 (2022).</li>
<li>Jeck, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+RNAs+are+abundant%2C+conserved%2C+and+associated+with+ALU+repeats%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats.</a> RNA. 19 (2), 141-157 (2013).</li>
<li>Pinheiro, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+droplet+digital+polymerase+chain+reaction+format+for+DNA+copy+number+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification.</a> Analytical Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).</li>
<li>Hayden, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+droplet+digital+PCR+to+real-time+PCR+for+quantitative+detection+of+cytomegalovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Comparison of droplet digital PCR to real-time PCR for quantitative detection of cytomegalovirus.</a> Journal of Clinical Microbiology. 51 (2), 540-546 (2013).</li>
<li>Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+digital+PCR+versus+qPCR+for+gene+expression+analysis+with+low+abundant+targets%3A+From+variable+nonsense+to+publication+quality+data%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: From variable nonsense to publication quality data.</a> Scientific Reports. 7, 2409(2017).</li>
<li>Hindson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+droplet+digital+PCR+system+for+absolute+quantitation+of+DNA+copy+number%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number.</a> Analytical Chemistry. 83 (22), 8604-8610 (2011).</li>
<li>Ishak, A., AlRawashdeh, M. M., Esagian, S. M., Nikas, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic%2C+prognostic%2C+and+therapeutic+value+of+droplet+digital+PCR+%28ddPCR%29+in+COVID-19+patients%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Diagnostic, prognostic, and therapeutic value of droplet digital PCR (ddPCR) in COVID-19 patients: A systematic review.</a> Journal of Clinical Medicine. 10 (23), 5712(2021).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+droplet+digital+PCR+to+detect+the+pathogens+of+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience+Reports%22%5BJournal%5D)">Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases.</a> Bioscience Reports. 38 (6), (2018).</li>
<li>Lee, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+UCSC+genome+browser+database%3A+2022+update%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The UCSC genome browser database: 2022 update.</a> Nucleic Acids Research. 50, 1115-1122 (2022).</li>
<li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BEDTools%3A+A+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BEDTools: A flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li>
<li>Untergasser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer3--new+capabilities+and+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Primer3--new capabilities and interfaces.</a> Nucleic Acids Research. 40 (15), 115(2012).</li>
<li>Das, A., Das, D., Das, A., Panda, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quick+and+cost-effective+method+for+DNA-free+total+RNA+isolation+using+magnetic+silica+beads%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">A quick and cost-effective method for DNA-free total RNA isolation using magnetic silica beads.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Oberacker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+Synthesis+of+Functionalized+Paramagnetic+Beads+for+Nucleic+Acid+Purification+and+Manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Simple Synthesis of Functionalized Paramagnetic Beads for Nucleic Acid Purification and Manipulation.</a> Bio-protocol. 9 (20), 3394(2019).</li>
<li>Rački, N., Dreo, T., Gutierrez-Aguirre, I., Blejec, A., Ravnikar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+transcriptase+droplet+digital+PCR+shows+high+resilience+to+PCR+inhibitors+from+plant%2C+soil+and+water+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Reverse transcriptase droplet digital PCR shows high resilience to PCR inhibitors from plant, soil and water samples.</a> Plant Methods. 10 (1), 42(2014).</li>
<li>Taylor, S. C., Carbonneau, J., Shelton, D. N., Boivin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+droplet+digital+PCR+from+RNA+and+DNA+extracts+with+direct+comparison+to+RT-qPCR%3A+Clinical+implications+for+quantification+of+Oseltamivir-resistant+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimization of droplet digital PCR from RNA and DNA extracts with direct comparison to RT-qPCR: Clinical implications for quantification of Oseltamivir-resistant subpopulations.</a> Journal of Virological Methods. 224, 58-66 (2015).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

CircRNA-onderzoek is het afgelopen decennium gegroeid met de ontdekking van high-throughput sequencing-technologieën. Als gevolg hiervan is het beschouwd als een potentieel molecuul voor toekomstige RNA-therapeutica. Bovendien is bekend dat het fungeert als een biomarker bij verschillende ziekten, waaronder kanker en hart- en vaatziekten 4,8. De identificatie van circRNA is echter lastig vanwege de lage abundantie en het heeft slechts één specifieke backsplice ju...

Recente ontwikkelingen in RNA-sequencingtechnologieën en nieuwe computationele algoritmen hebben een nieuw lid ontdekt van de groeiende familie van niet-coderende RNA's, genaamd circulair RNA (circRNA)1. Zoals de naam al doet vermoeden, zijn circRNA's een familie van enkelstrengs RNA-moleculen zonder vrije uiteinden. Ze worden gevormd door niet-canonieke head-to-tail splicing genaamd back-splicing, waarbij de upstream splice acceptor site covalent aansluit op de downstream splice donor site om een stabiele RNA cirkel 1,2 te vormen. Dit proces kan worden gemedieerd door verschillende factoren, waaronder omgekeerde Alu-repetitieve elementen die aanwezig zijn in de upstream en downstream van gecirculeerde exonen, of kan worden gemedieerd door sommige splicingfactoren of RNA-bindende eiwitten (RBPs)2,3. Circulaire RNA's die uitsluitend uit de exonische of intronische sequentie worden gegenereerd, worden geclassificeerd als exonische circRNA en circulaire intronische RNA's of ci-RNA's, terwijl sommige exonische circRNA's het intron behouden en exon-intron circRNA's (EIcircRNA's) worden genoemd(EIcircRNA's)3,4. De functies van circRNA's zijn veelzijdig, waaronder het sponzen van miRNA en/of RBP, het reguleren van transcriptie en het reguleren van de cellulaire functie door te vertalen in peptiden 3,5,6,7. Verschillende rapporten hebben het belang van circRNA's in verschillende ziekten en fysiologische processen benadrukt8. Bovendien maken weefselspecifieke expressiepatronen en resistentie tegen exonucleasevertering het een functionele biomarker voor ziektediagnose en kan het ook worden gebruikt als een geschikt therapeutisch doelwit8. Gezien het belang ervan bij het reguleren van gezondheid en ziekten, is de nauwkeurige kwantificering van circRNA-expressie de behoefte van het uur.
Er zijn verschillende biochemische methoden ontwikkeld om cirkelRNA's in biologische monsters te kwantificeren9. Een van de handigste en meest geaccepteerde methoden voor circRNA-kwantificering is reverse transcriptie gevolgd door kwantitatieve polymerasekettingreactie (RT-qPCR) met behulp van divergente primerparen10. De meerderheid van de circRNA's is echter in lage abundantie in vergelijking met lineaire mRNA's, waardoor het een uitdaging is om ze te kwantificeren11. Om dit probleem op te lossen, hebben we geprobeerd om digitale druppel-PCR (dd-PCR) te gebruiken om het aantal cirkel-RNA's in een bepaald monster nauwkeurig te kwantificeren. De dd-PCR is een geavanceerde PCR-technologie die het microfluïdica-principe volgt; het genereert meerdere waterige druppels in olie en de PCR komt in elke druppel voor als een individuele reactie12. De reactie treedt op in individuele druppels en wordt geanalyseerd met behulp van een druppellezer, die het aantal positieve of negatieve druppels voor het gen van belang geeft12. Het is de meest gevoelige techniek om een gen van belang nauwkeurig te kwantificeren, zelfs als er slechts één kopie in een bepaald monster is. Verminderde gevoeligheid voor remmers, betere precisie en het weglaten van het referentiegen voor kwantificering maken het voordeliger dan conventionele qPCR 13,14,15. Het is op grote schaal gebruikt als een onderzoeks- en diagnostisch hulpmiddel voor de absolute kwantificering van een gen van belang16,17. Hier beschrijven we het gedetailleerde dd-PCR-protocol voor circRNA-kwantificering bij het differentiëren van muis C2C12-myotubes en prolifererende muis C2C12-myoblasten met behulp van divergente primers.

<table><tbody><tr><td>1.5 ml microcentrifuge tube</td><td>Tarson</td><td>500010</td><td></td></tr><tr><td>0.2 ml tube strips with cap</td><td>Tarson</td><td>610020, 510073</td><td></td></tr><tr><td>Filter Tips</td><td>Tarson</td><td>528104</td><td></td></tr><tr><td>DNase/RNase-Vrij Gedistilleerd Water</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10977023</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat-gebufferd zout (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Cell scrapper</td><td>HiMedia</td><td>TCP223</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>SRL</td><td>96764</td><td></td></tr><tr><td>DNA-diluent</td><td>HiMedia</td><td>MB228</td><td></td></tr><tr><td>Random primers</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>48190011</td><td></td></tr><tr><td>dNTP-set</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0181</td><td></td></tr><tr><td>Murine RNase-remmer</td><td>NEB</td><td>M0314S</td><td></td></tr><tr><td>Maxima reverse transcriptase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EP0743</td><td></td></tr><tr><td>QX200 dd-PCR Evagreen Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1864033</td><td></td></tr><tr><td>Droplet generatie olie voor Evagreen</td><td>Bio-Rad</td><td>1864006</td><td></td></tr><tr><td>PCR Plate Heat Seal, folie, doorprikpunt</td><td>Bio-Rad</td><td>1814040</td><td></td></tr><tr><td>DG8 Cartridges en Gaskets</td><td>Bio-Rad</td><td>1864007</td><td></td></tr><tr><td>DG8 Cartridge houder</td><td>Bio-Rad</td><td>1863051</td><td></td></tr><tr><td>QX200 Droplet Generator</td><td>Bio-Rad</td><td>1864002</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR 96-Well Plates</td><td>Bio-Rad</td><td>12001925</td><td></td></tr><tr><td>PX1 PCR Plate Sealer</td><td>Bio-Rad</td><td>1814000</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Touch Thermal Cycler met 96&ndash;Deep Well Reaction Module</td><td>Bio-Rad</td><td>1851197</td><td></td></tr><tr><td>QX200 Droplet Reader</td><td>Bio-Rad</td><td>1864003</td><td></td></tr><tr><td>Quantasoft Software</td><td>Bio-Rad</td><td>1864011</td><td></td></tr><tr><td>Silica kolom</td><td>Umbrella Life Science</td><td>38220090</td><td></td></tr><tr><td>UCSC Genome Browser</td><td></td><td>https://genome.ucsc.edu/</td><td></td></tr><tr><td>Primer 3</td><td></td><td>https://primer3.ut.ee/</td><td></td></tr></tbody></table>

kwantificering van circulaire rna's met behulp van digitale druppel-pcr

Quantification of Circular RNAs Using Digital Droplet PCR

Digitale druppelpolymerasekettingreactie (dd-PCR) is een van de meest gevoelige kwantificeringsmethoden; het fractioneert de reactie in bijna 20.000 water-in-oliedruppels en de PCR komt voor in de individuele druppels. De dd-PCR heeft verschillende voordelen ten opzichte van conventionele real-time qPCR, waaronder verhoogde nauwkeurigheid bij het detecteren van doelen met een lage abundantie, het weglaten van referentiegenen voor kwantificering, het elimineren van technische replicaties voor monsters en het tonen van een hoge veerkracht tegen remmers in de monsters. Onlangs is dd-PCR een van de meest populaire methoden geworden voor het nauwkeurig kwantificeren van doel-DNA of RNA voor genexpressieanalyse en diagnostiek. Circulaire RNA's (circRNA's) zijn een grote familie van recent ontdekte covalent gesloten RNA-moleculen zonder 5' en 3' uiteinden. Het is aangetoond dat ze genexpressie reguleren door te fungeren als sponzen voor RNA-bindende eiwitten en microRNA's. Bovendien worden circRNA's uitgescheiden in lichaamsvloeistoffen en hun weerstand tegen exonucleasen zorgt ervoor dat ze dienen als biomarkers voor ziektediagnose. Dit artikel is bedoeld om te laten zien hoe divergent primerontwerp, RNA-extractie, cDNA-synthese en dd-PCR-analyse kunnen worden uitgevoerd om specifieke circulaire RNA (circRNA) niveaus in cellen nauwkeurig te kwantificeren. Tot slot demonstreren we de precieze kwantificering van circRNA's met behulp van dd-PCR.

Het absolute aantal cirkel-RNA's in elk monster kan worden afgeleid uit de geëxporteerde dd-PCR-gegevens. Real-time kwantitatieve PCR-analyse suggereerde differentiële expressie van circBnc2 in de gedifferentieerde C2C12-myotubes (gegevens niet getoond). Hier wilden we het absolute kopienummer van circBnc2 controleren in prolifererende C2C12-myoblasten en myotubes. Omdat de expressie van circBnc2 in twee omstandigheden wordt vergeleken, is het erg belangrijk om alle monsters voor RNA-isolatie, ...

Dit protocol beschrijft de gedetailleerde methode van digitale druppel PCR (dd-PCR) voor nauwkeurige kwantificering van circulaire RNA (circRNA) niveaus in cellen met behulp van divergente primers.

Kwantificering van circulaire RNA's met behulp van digitale druppel-PCR

Digital droplet polymerase chain reaction (dd-PCR) is one of the most sensitive quantification methods; it fractionates the reaction into nearly 20,000 ...

dd-PCR is een zeer gevoelige en nauwkeurige methode voor absolute kwantificering van doel-DNA of RNA. Het is gebruikt voor ziektediagnose waar andere conventionele methoden geen nauwkeurige resultaten geven. dd-PCR is de meest gevoelige techniek voor het detecteren van zeer lage overvloedige nucleïnezuurmoleculen.In tegenstelling tot kwantitatieve PCR vereist dd-PCR geen huishoudgencontrole voor kwantificering. Vanwege de gevoeligheid en nauwkeurigheid kan dd-PCR worden gebruikt als een hulpmiddel voor moleculaire diagnostiek en onderzoek met laag overvloedige RNA-moleculen zoals micro-RNA's en circulaire RNA's. Alvorens dd-PCR te gebruiken, moet men RT-PCR of RT-qPCR uitvoeren om te bevestigen dat de primers hun doelgenen versterken zonder enige niet-specifieke PCR-amplificatie.Bereid om te beginnen een PCR-sjabloonsequentie van 200 nucleotiden in lengte voor door de laatste 100 nucleotiden van de totale circulaire RNA-sequentielengte samen te voegen met de eerste 100 nucleotiden van de circulaire RNA-sequentie. Gebruik de sjabloonvolgorde voor primer, ontworpen door de Primer 3-webtool. Neem een schaal van 10 centimeter met ongeveer 5 miljoen prolifererende C2C12-myoblastcellen en een vierdaagse gedifferentieerde C2C12-myotube voor RNA-isolatie.Was de cellen drie keer met 10 milliliter 1X PBS en gooi de PBS weg met een pipet. Voeg een milliliter RNA-isolatiereagens toe en lyseer de cellen door krachtig pipetteren. Voeg vervolgens 200 microliter chloroform en vortex toe gedurende 15 seconden.Centrifugeer de buis bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten bij 12.000 G.Neem 400 microliter van de bovenste waterige laag, laad deze op een silicakolom en centrifugeer gedurende één minuut bij 12.000 G bij kamertemperatuur. Neem de stroom door naar een nieuwe buis en voeg 600 microliter 100% ethanol toe. Voeg 20 microliter magnetische silicaparels toe en plaats de buis op een thermomixer, ingesteld op 25 graden Celsius en 1, 200 RPM gedurende vijf minuten.Plaats de buis vervolgens gedurende 30 seconden op een magnetische standaard of totdat de oplossing helder wordt. Resuspendeer de magnetische silicaparels in 500 microliter wasbuffer met 90% ethanol. Nadat u de buis gedurende 30 seconden op de magnetische standaard hebt geplaatst, laat u de kralen zich in de richting van de magneet nestelen en gooit u de buffer weg met een pipet.Droog de buis aan de lucht op 50 graden Celsius gedurende drie minuten op een thermomixer, waarbij het deksel open blijft. Voeg 20 microliter nucleasevrij water toe en resuspendeer de kralen. Verzamel het opgeloste RNA in een nieuwe buis voor kwantiteits- en kwaliteitsbeoordeling met behulp van een spectrofotometer.Meet de RNA-concentratie met behulp van een spectrofotometer en neem één microgram RNA voor cDNA-synthese. Meng één microgram totaal RNA met één microliter dNTP-mix, vier microliter 5X reverse transcriptasebuffer, twee microliter 10X reverse transcriptase random primer, 0,25 microliter reverse transcriptase-enzym en 0,5 microliter RNase-remmer. Vul het volume aan tot 20 microliter met nucleasevrij water.Plaats de buis gedurende 10 minuten op 25 graden Celsius, gevolgd door 50 graden Celsius gedurende een uur. Plaats vervolgens de buis gedurende vijf minuten op 85 graden Celsius om het enzym te inactiveren. Stel de PCR-reactie van 22 microliter in 0,2 milliliter PCR-buizen of -strips in, samen met een negatieve controlebuis en niet-sjabloonbesturingsbuizen.Voeg 11 microliter dd-PCR-mastermix, 5,5 microliter circulair RNA-specifieke voor- en achterwaartse primermix van één micromolaire concentratie en 5,5 microliter nucleasevrij water toe om de NTC-reactiebuizen op te zetten. Evenzo, om de reageerbuizen op te zetten, voegt u 11 microliter dd-PCR-mastermix, 5,5 microliter circulair RNA-specifieke voorwaartse en omgekeerde primermix van één micromolaire concentratie en 5,5 microliter cDNA toe. Breng voor het genereren van druppels 20 microliter van het PCR-mengsel over van 0,2 milliliter PCR-buizen naar de monsterputten van de druppelgeneratorcartridge.Voeg 70 microliter druppelgeneratieolie voorzichtig toe aan de oliebronnen van de druppelgeneratorcartridge met behulp van een pipet. Bedek de druppelgeneratorcartridge met een rubberen pakking en plaats deze in de druppelgeneratormachine om het monsteroliedruppelmengsel te krijgen, gegenereerd in de druppelputten van de cartridge. Breng voor PCR-versterking 40 microliter van het monsteroliedruppelmengsel over van de druppelputten van de druppelgeneratorcartridge naar een 96-well PCR-plaat met behulp van een pipet.Sluit de 96-well PCR plaat af met de aluminiumfolie sealer. Plaats het in het machineblok voor plaatsealer, voorverwarmd op 180 graden Celsius, en klik op afdichting voor het afdichten van de PCR-plaat. Plaats vervolgens de plaat in de dd-PCR thermische cycler en stel de dekseltemperatuur in op 105 graden Celsius en een hellingsnelheid op twee graden Celsius per seconde.Zodra PCR voorbij is, plaatst u de plaat op de dd-PCR druppeltellermachine met de plaathouder in de juiste positie voor het tellen van de druppels. Open de druppelanalysesoftware en stel de run in door de voorbeeldinformatie in te voeren. Klik op de knop Analyseren om de gegevens te analyseren na het voltooien van de druppellezing.Klik vervolgens op de knop 1D Amplitude om de positieve en negatieve druppels te zien. Om de positieve druppels van de negatieve druppels te scheiden, plaatst u een gemeenschappelijke drempellijn voor alle monsters met hetzelfde doel. Klik op de exportknop om de circulaire RNA-tellingen als csv-bestand te exporteren.De geëxporteerde gegevens tonen het aantal circulaire RNA's dat in elk monster aanwezig is. Bereken handmatig het aantal circulaire RNA's in elk monster per nanogram RNA door rekening te houden met de totale hoeveelheid cDNA die in elke reactie wordt gebruikt. De data-analyse met QuantaSoft Software wordt hier getoond.Alle monsters behalve MT1 vertoonden meer dan 12.000 druppeltellingen. Aangezien het totale aantal druppels laag was in MT1, werd dit monster niet in aanmerking genomen voor de uiteindelijke gegevensanalyse. Interessant is dat er een duidelijk verschil was in het expressiepatroon van Circ B en C2 in de vierdaagse gedifferentieerde myotube-conditie in vergelijking met de myoblastcellen.De analyse van Circ B- en C2-abundantie in termen van kopienummer, gaf aan dat de drie replicaties van C2C12-myoblasten 76,8, 67 en 46 kopieën per nanogram RNA hadden, terwijl de twee myotube-monsters 558 en 610 kopieën per nanogram RNA hadden. De gegevens in het staafdiagram vertegenwoordigen de gemiddelde plus minus standaarddeviatie van twee tot drie biologische replicaties. ddPCR is een van de meest geavanceerde methoden om de nauwkeurige differentiële expressie van doelcirculaire RNA te meten.Deze methode zal een essentieel hulpmiddel zijn om circulair RNA-onderzoek en diagnostische industrieën in het komende jaar te versnellen.

quantification-of-circular-rnas-using-digital-droplet-pcr

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In this video, we present a step-by-step procedure to generate emulsified nano-droplets to detect target nucleic acids by digital polymerase chain reaction or dPCR.

Droplet Digital Polymerase Chain Reaction: A Method to Generate Nanodroplet PCR Reactions for Detecting Rare Tumor Mutations

We beschrijven een digitale eindpuntassay voor het kwantificeren van nucleïnezuren met een vereenvoudigde (analoge) uitlezing. We meten bulkfluorescentie van druppelgebaseerde digitale assays met behulp van een standaard qPCR-machine in plaats van gespecialiseerde instrumenten en bevestigen onze resultaten door middel van microscopie.

Eenvoudige Bulk uitlezing van Digital nucleïnezuur kwantificering Testen

Dit manuscript beschrijft een duplex digitale PCR test die kan worden gebruikt om tegelijkertijd kwantificeren Enterococcus spp. En HF183 genetische merkers als indicatoren van algemene en menselijke-geassocieerde fecale besmetting in recreatiewater.

Een duplex digitale PCR test voor gelijktijdige kwantificering van de<em&gt; Enterococcus spp.</em&gt; En de Human Fecal-geassocieerde HF183 Marker in Waters

Er wordt een gevoelige en nauwkeurige methode beschreven voor de kwantificering van celvrije microRNA's met behulp van een kleurstof-gebaseerde chemie en druppel digitale PCR-technologie.

Circulerende MicroRNA Kwantificering Met behulp van DNA-bindende Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

Circulerende microRNAs is gebleken belofte als biomarkers voor cardiovasculaire aandoeningen en acuut myocardiaal infarcten. In deze studie beschrijven we een protocol voor extractie van miRNA, omgekeerde transcriptie en digitale PCR voor de absolute kwantificering van miRNAs in het serum van patiënten met hart-en vaatziekten.

Digitale PCR voor het kwantificeren van de circulerende MicroRNAs in acuut myocardinfarct en hart-en vaatziekten

Hier presenteren we een protocol voor het opsporen van tumor somatische mutaties in het Circulerend DNA dat aanwezig is in patiënt biologische vloeistoffen (biovloeistoffen). Onze druppel digitale polymerase kettingreactie (dpcr)-gebaseerde methode maakt kwantificering van de tumor mutatie allel Frequency (MAF) mogelijk, waardoor een minimaal invasieve aanvulling op de diagnose en temporele monitoring van de tumorrespons wordt vergemakkelijkt.

Detectie en monitoring van tumor geassocieerd Circulerend DNA bij patiënt biovloeistoffen

Circulaire Rna's (Circrna's) zijn niet-Codeer Rna's die mogelijk rollen hebben in transcriptionele regulatie en die interacties tussen eiwitten bemiddel- Na beoordeling van verschillende parameters voor de bouw van circRNA sequencing Bibliotheken, een protocol werd gecompileerd met behulp van gestrande Total RNA Library voorbereiding met RNase R pre-behandeling en wordt hier gepresenteerd.

Identificatie van circulaire Rna's met RNA-sequencing

Dit werk vat stappen samen voor het ontwikkelen van verschillende testen voor SARS-CoV-2-detectie met behulp van een tweekleurig ddPCR-systeem. De stappen zijn uitgebreid en er zijn opmerkingen opgenomen over hoe de assays en experimentprestaties kunnen worden verbeterd. Deze testen kunnen worden gebruikt voor meerdere SARS-CoV-2 RT-ddPCR-toepassingen.

Tweestaps omgekeerde transcriptiedruppel digitale PCR-protocollen voor SARS-CoV-2-detectie en kwantificering

Hier presenteren we een protocol voor het meten van absolute mitochondriale (mt) DNA-kopienummer en mtDNA-deletie heteroplasmieniveaus in enkele cellen.

Het meten van eencellig mitochondriaal DNA-kopienummer en heteroplasmie met behulp van digitale druppelpolymerasekettingreactie

Nauwkeurige kwantificering van kopieën van het vectorgenoom van adeno-geassocieerd virus (AAV) is van cruciaal belang, maar er moet nog een gestandaardiseerd protocol worden opgesteld. Dit protocol beschrijft een gevalideerde methode voor het bereiden van gezuiverde AAV-monsters en het uitvoeren van een digitale druppelpolymerasekettingreactie (dd_PCR) om de virale genoomtiter betrouwbaar te kwantificeren.

Kwantificering van adeno-geassocieerde virale genomen in gezuiverde vectormonsters door digitale druppelpolymerasekettingreactie

Deze studie presenteert een robuuste methode om axonale mRNA's te isoleren met poreuze membraaninserts, waardoor totale neuron- versus neurietscheiding en RNA-zuivering mogelijk zijn. In combinatie met RTddPCR maakt de aanpak absolute kwantificering van low-copy transcripts mogelijk, wat studies naar mRNA-transport en lokale translatie met hoge gevoeligheid, reproduceerbaarheid en brede experimentele toepasbaarheid vergemakkelijkt.

Isolatie en kwantificering van axonale mRNA's met behulp van poreuze membraaninserts en RTddPCR

Leer digitale druppel-PCR voor nauwkeurige kwantificering van circulaire RNA's in C2C12-spiercellen. Deze methode biedt hoge gevoeligheid zonder referentiegenen en versnelt moleculair diagnostisch onderzoek.

Kwantificering van circulaire RNA's met behulp van digitale druppel-PCR

Meer video's verkennen