Kwantificering van circulaire RNA's met behulp van digitale druppel-PCR

dd-PCR is een zeer gevoelige en nauwkeurige methode voor absolute kwantificering van doel-DNA of RNA. Het is gebruikt voor ziektediagnose waar andere conventionele methoden geen nauwkeurige resultaten geven. dd-PCR is de meest gevoelige techniek voor het detecteren van zeer lage overvloedige nucleïnezuurmoleculen.

In tegenstelling tot kwantitatieve PCR vereist dd-PCR geen huishoudgencontrole voor kwantificering. Vanwege de gevoeligheid en nauwkeurigheid kan dd-PCR worden gebruikt als een hulpmiddel voor moleculaire diagnostiek en onderzoek met laag overvloedige RNA-moleculen zoals micro-RNA's en circulaire RNA's. Alvorens dd-PCR te gebruiken, moet men RT-PCR of RT-qPCR uitvoeren om te bevestigen dat de primers hun doelgenen versterken zonder enige niet-specifieke PCR-amplificatie.

Bereid om te beginnen een PCR-sjabloonsequentie van 200 nucleotiden in lengte voor door de laatste 100 nucleotiden van de totale circulaire RNA-sequentielengte samen te voegen met de eerste 100 nucleotiden van de circulaire RNA-sequentie. Gebruik de sjabloonvolgorde voor primer, ontworpen door de Primer 3-webtool. Neem een schaal van 10 centimeter met ongeveer 5 miljoen prolifererende C2C12-myoblastcellen en een vierdaagse gedifferentieerde C2C12-myotube voor RNA-isolatie.

Was de cellen drie keer met 10 milliliter 1X PBS en gooi de PBS weg met een pipet. Voeg een milliliter RNA-isolatiereagens toe en lyseer de cellen door krachtig pipetteren. Voeg vervolgens 200 microliter chloroform en vortex toe gedurende 15 seconden.

Centrifugeer de buis bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten bij 12.000 G.Neem 400 microliter van de bovenste waterige laag, laad deze op een silicakolom en centrifugeer gedurende één minuut bij 12.000 G bij kamertemperatuur. Neem de stroom door naar een nieuwe buis en voeg 600 microliter 100% ethanol toe. Voeg 20 microliter magnetische silicaparels toe en plaats de buis op een thermomixer, ingesteld op 25 graden Celsius en 1, 200 RPM gedurende vijf minuten.

Plaats de buis vervolgens gedurende 30 seconden op een magnetische standaard of totdat de oplossing helder wordt. Resuspendeer de magnetische silicaparels in 500 microliter wasbuffer met 90% ethanol. Nadat u de buis gedurende 30 seconden op de magnetische standaard hebt geplaatst, laat u de kralen zich in de richting van de magneet nestelen en gooit u de buffer weg met een pipet.

Droog de buis aan de lucht op 50 graden Celsius gedurende drie minuten op een thermomixer, waarbij het deksel open blijft. Voeg 20 microliter nucleasevrij water toe en resuspendeer de kralen. Verzamel het opgeloste RNA in een nieuwe buis voor kwantiteits- en kwaliteitsbeoordeling met behulp van een spectrofotometer.

Meet de RNA-concentratie met behulp van een spectrofotometer en neem één microgram RNA voor cDNA-synthese. Meng één microgram totaal RNA met één microliter dNTP-mix, vier microliter 5X reverse transcriptasebuffer, twee microliter 10X reverse transcriptase random primer, 0,25 microliter reverse transcriptase-enzym en 0,5 microliter RNase-remmer. Vul het volume aan tot 20 microliter met nucleasevrij water.

Plaats de buis gedurende 10 minuten op 25 graden Celsius, gevolgd door 50 graden Celsius gedurende een uur. Plaats vervolgens de buis gedurende vijf minuten op 85 graden Celsius om het enzym te inactiveren. Stel de PCR-reactie van 22 microliter in 0,2 milliliter PCR-buizen of -strips in, samen met een negatieve controlebuis en niet-sjabloonbesturingsbuizen.

Voeg 11 microliter dd-PCR-mastermix, 5,5 microliter circulair RNA-specifieke voor- en achterwaartse primermix van één micromolaire concentratie en 5,5 microliter nucleasevrij water toe om de NTC-reactiebuizen op te zetten. Evenzo, om de reageerbuizen op te zetten, voegt u 11 microliter dd-PCR-mastermix, 5,5 microliter circulair RNA-specifieke voorwaartse en omgekeerde primermix van één micromolaire concentratie en 5,5 microliter cDNA toe. Breng voor het genereren van druppels 20 microliter van het PCR-mengsel over van 0,2 milliliter PCR-buizen naar de monsterputten van de druppelgeneratorcartridge.

Voeg 70 microliter druppelgeneratieolie voorzichtig toe aan de oliebronnen van de druppelgeneratorcartridge met behulp van een pipet. Bedek de druppelgeneratorcartridge met een rubberen pakking en plaats deze in de druppelgeneratormachine om het monsteroliedruppelmengsel te krijgen, gegenereerd in de druppelputten van de cartridge. Breng voor PCR-versterking 40 microliter van het monsteroliedruppelmengsel over van de druppelputten van de druppelgeneratorcartridge naar een 96-well PCR-plaat met behulp van een pipet.

Sluit de 96-well PCR plaat af met de aluminiumfolie sealer. Plaats het in het machineblok voor plaatsealer, voorverwarmd op 180 graden Celsius, en klik op afdichting voor het afdichten van de PCR-plaat. Plaats vervolgens de plaat in de dd-PCR thermische cycler en stel de dekseltemperatuur in op 105 graden Celsius en een hellingsnelheid op twee graden Celsius per seconde.

Zodra PCR voorbij is, plaatst u de plaat op de dd-PCR druppeltellermachine met de plaathouder in de juiste positie voor het tellen van de druppels. Open de druppelanalysesoftware en stel de run in door de voorbeeldinformatie in te voeren. Klik op de knop Analyseren om de gegevens te analyseren na het voltooien van de druppellezing.

Klik vervolgens op de knop 1D Amplitude om de positieve en negatieve druppels te zien. Om de positieve druppels van de negatieve druppels te scheiden, plaatst u een gemeenschappelijke drempellijn voor alle monsters met hetzelfde doel. Klik op de exportknop om de circulaire RNA-tellingen als csv-bestand te exporteren.

De geëxporteerde gegevens tonen het aantal circulaire RNA's dat in elk monster aanwezig is. Bereken handmatig het aantal circulaire RNA's in elk monster per nanogram RNA door rekening te houden met de totale hoeveelheid cDNA die in elke reactie wordt gebruikt. De data-analyse met QuantaSoft Software wordt hier getoond.

Alle monsters behalve MT1 vertoonden meer dan 12.000 druppeltellingen. Aangezien het totale aantal druppels laag was in MT1, werd dit monster niet in aanmerking genomen voor de uiteindelijke gegevensanalyse. Interessant is dat er een duidelijk verschil was in het expressiepatroon van Circ B en C2 in de vierdaagse gedifferentieerde myotube-conditie in vergelijking met de myoblastcellen.

De analyse van Circ B- en C2-abundantie in termen van kopienummer, gaf aan dat de drie replicaties van C2C12-myoblasten 76,8, 67 en 46 kopieën per nanogram RNA hadden, terwijl de twee myotube-monsters 558 en 610 kopieën per nanogram RNA hadden. De gegevens in het staafdiagram vertegenwoordigen de gemiddelde plus minus standaarddeviatie van twee tot drie biologische replicaties. ddPCR is een van de meest geavanceerde methoden om de nauwkeurige differentiële expressie van doelcirculaire RNA te meten.

Deze methode zal een essentieel hulpmiddel zijn om circulair RNA-onderzoek en diagnostische industrieën in het komende jaar te versnellen.