Verzameling van alfalfawortelexsudaten om de impact van di (2-ethylhexyl) ftalaat op de productie van metabolieten te bestuderen
2 juni 2023
De afscheiding van wortelexsudaten is meestal een externe ontgiftingsstrategie voor planten onder stressomstandigheden. Dit protocol beschrijft hoe de impact van xenobiotica op alfalfa kan worden beoordeeld via niet-gerichte metabolomische analyse.
Dit protocol beschrijft hoe de impact van xenobiotica op alfalfa kan worden beoordeeld tijdens niet-gerichte metabolomics-analyse. De techniek is zeer eenvoudig en handig voor bediening en meer soorten wortelexsudaten kunnen worden geïdentificeerd. Dat helpt bij het construeren van de metabolomische fingerprinting van exsudaten van plantenwortels.
Begin de sterilisatie van de medicago sativa of alfalfazaden door de zaden gedurende 10 minuten te spoelen met 0,1% natriumhypochloriet. Gevolgd door een wasbeurt met 75% ethylalcohol gedurende 30 minuten. Spoel vervolgens de gesteriliseerde zaden meerdere keren af met gedestilleerd water.
En ontkiem ze vervolgens op het vochtige filterpapier dat in een steriele petrischaal is geplaatst. Bij 30 graden Celsius in het donker. Breng na ontkieming 20 gelijkmatig ontkiemde grote mollige zaden over op een engraftmentmand in een kweekfles gevuld met voedingsoplossing.
Plaats alle kweekflessen in een groeikamer met gecontroleerde omstandigheden. Breng na twee weken 15 uniforme alfalfa-zaailingen over naar een nieuwe glazen fles om ze bloot te stellen aan één milligram per kilogram en 10 milligram per kilogram DEHP-stress voor het kweekexperiment. Wikkel de behandeling en controleer glazen flessen met aluminiumfolie en parafilm om fotolyse en vervluchtiging van de DEHP te voorkomen.
Vul de voedingsoplossing dagelijks aan om het vloeistofniveau te handhaven. Plaats en draai de flessen om de twee dagen willekeurig om consistente groeiomstandigheden voor de alfalfa-zaailingen te garanderen. Verwijder na zeven dagen kweken de alfalfa-zaailingen uit de flessen.
En was ze meerdere keren met ultrapuur water om ze voor te bereiden op het verzamelen van wortelexsudaten. Begin het wortelexsudaatverzamelingsexperiment door 10 uniforme alfalfa-zaailingen over te brengen naar centrifugebuizen gevuld met 50 milliliter gesteriliseerd gedeïoniseerd water. Om wortelexsudaten te verzamelen, houdt u de buizen zes uur rechtop met de wortels ondergedompeld in water.
Als u klaar bent, wikkelt u de centrifugebuizen in met aluminiumfolie om de wortels tegen licht te beschermen. Verwijder de planten en vriesdroog de verzamelde vloeistof voor metabolietprofilering. Ga verder met het extractie-experiment door 1,8 milliliter extractieoplossing toe te voegen aan de gevriesdroogde monsters.
In vortex gedurende 30 seconden. Breng vervolgens de ultrasone golven gedurende 10 minuten aan op de buizen in een ijswaterbad. Voordat de monsters worden gecentrifugeerd.
Breng voorzichtig 200 microliter supernatant over in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Zuig 45 microliter supernatant uit de centrifugebuis en meng het in kwaliteitscontrole- of QC-monsters met een eindvolume van 270 microliter. Als u klaar bent, vriesdroogt u de extracten in een vacuümconcentrator.
Zodra het drogen is voltooid, voegt u vijf microliter interne standaard ribonuclease toe en gaat u verder met drogen. Voeg na verdamping 30 microliter methoxyaminatiehydrochlorideoplossing toe en incubeer de buizen gedurende 30 minuten bij 80 graden Celsius. Voeg vervolgens 40 microliter BSTFA-reagens toe aan de monsters voordat u de buizen gedurende 1,5 uur op 70 graden Celsius plaatst voor derivatisatie.
Zodra de incubatie voorbij is en het gederivatiseerde monster kamertemperatuur bereikt, voegt u vijf microliter vetzuurmethylesters opgelost in chloroform toe aan de gederivatiseerde monsters. Met behulp van een capillaire kolom van 30 meter bij 250 micrometer bij 0,25 micrometer, scheidt u een microliter van de wortelexsudaten met een dragergas helium met een stroomsnelheid van 1,0 milliliter per minuut. Stel de injectietemperatuur in op 280 graden Celsius.
En houd de overdrachtslijntemperatuur op 280 graden Celsius. Stel het ovenprogramma in voor scheiding. Na het scheiden van de extracten, voert u massaspectrometrie uit in elektronenbotsingsmodus met een energie van min 70 elektronvolt.
Houd de ionenbrontemperatuur op 250 graden Celsius. Verkrijg massaspectra met behulp van de volledige scanbewakingsmodus met een massascanbereik van 50 tot 500 massa door lading met een snelheid van 12,5 spectra per seconde. 778 pieken werden gedetecteerd in de chromatograaf van het controlemonster.
Waarvan 314 metabolieten werden geïdentificeerd volgens de massaspectra. De zuren werden verder onderverdeeld in vetzuren, aminozuren, organische zuren en fenolzuren. Bovendien werden enkele veel voorkomende stoffen die over het algemeen aanwezig zijn in de wortelexsudaten ook gedetecteerd in alfalfa-wortelexsudaten, waaronder pyrimidines, hydroxypyrimidines, flavonoïden, fenolen, ketonen, pyrimidines en diterpenen.
Op basis van de VIP-score werd een heatmap uitgezet om de variatie in differentiële metabolieten tussen verschillende DEHP-behandelingen te visualiseren. In vergelijking met de controlemonsters veranderde de blootstelling aan DEHP het gehalte aan 50 metabolieten en alfalfawortelexsudaten significant. Voornamelijk inclusief enkele koolhydraten en organische zuren met een laag molecuulgewicht.
De analyse van de metabole routes toonde aan dat DEHP het metabolisme van koolhydraten, die het product zijn van fotosynthese, aanzienlijk remde, wat aangeeft dat DEHP de fotosynthese van alfalfa tot op zekere hoogte kan onderdrukken DEHP werd gezien als het bevorderen van het metabolisme van vetzuren die helpen stress van DEHP te weerstaan. Ten minste de zaadwortelexsudaten moeten voor elke behandeling worden uitgevoerd om een nauwkeurige metabolomische gegevensanalyse te garanderen. We kunnen differentieel metaboliseren en de belangrijke regels in het milieugedrag van verontreinigingen verder onderzoeken.
De interacties tussen planten en de bredere veldbiologische gemeenschap kunnen meestal worden ontcijferd met behulp van deze methode.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode voor het beoordelen van de impact van xenobiotica op alfalfa met behulp van niet-gerichte metabolomische analyse. Het benadrukt het belang van wortelexudaten als detoxificatiestrategie voor planten onder stressomstandigheden.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Plantbiologie
- Metabolomica
- Omgevingsstressreacties
Achtergrond
- Wortelexudaten spelen een cruciale rol in de interacties van planten met hun omgeving.
- Xenobiotica kunnen de gezondheid en het metabolisme van planten beïnvloeden.
- Niet-gerichte metabolomics maakt een uitgebreide profilering van metabolieten mogelijk.
- Inzicht in deze interacties kan bijdragen aan landbouwpraktijken.
Doel van het onderzoek
- Om de effecten van xenobiotica op luzerne te evalueren.
- Om verschillende typen wortelextracten te identificeren.
- Om een metabolomische vingerafdruk van wortelextracten van planten op te stellen.
Gebruikte methoden
- Sterilisatie van alfalfazaad met natriumhypochloriet en ethylalcohol.
- Spoelen van zaden met gedestilleerd water na sterilisatie.
- Toepassing van niet-gerichte metabolomische analysetechnieken.
- Identificatie van metabolieten in wortelextracten.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle identificatie van diverse worteleksudaten.
- Inzichten in de detoxificatiemechanismen van alfalfa.
- Opstelling van een metabolomisch profiel voor verder onderzoek.
- Demonstratie van de effectiviteit van de methode bij het beoordelen van plantrespons op xenobiotica.
Conclusies
- Het protocol biedt een betrouwbare methode voor het bestuderen van plantreacties op omgevingsstressfactoren.
- Wortelexudaten zijn essentieel voor het begrijpen van de plantgezondheid onder stress.
- Deze aanpak kan worden toegepast op andere plantensoorten voor bredere inzichten.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Niet-gerichte metabolomische profilering van wortelexsudaten van alfalfa onder DEHP-stress maakt mechanische risicoanalyse mogelijk van plant-omgevingsinteracties die relevant zijn voor agrochemische en milieubiotecnologische pijplijnen. Kwantitatieve analyse van differentiële metabolieten ondersteunt het voorspellende vertrouwen in stressresponspaden, wat bijdraagt aan vroege ontdekking en translationeel onderzoek naar de impact van xenobiotica. Deze workflow positioneert de metabolomica van wortelexsudaten als een herbruikbare capaciteit voor portefeuilbrede beoordeling van plantresilience en detoxificatiestrategieën.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt onderzoek mogelijk naar detoxificatiepaden van planten als reactie op blootstelling aan xenobiotica.
- Ondersteunt de functionele validatie van stress-geïnduceerde metabole verschuivingen op de interface tussen wortel en bodem.
- Vergemakkelijkt de voorspellende betrouwbaarheid bij het identificeren van belangrijke metabolieten en paden voor verdere studie.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Bereidt gevalideerde metabolomische fingerprints voor voor downstream vergelijkende analyses.
- Standaardiseert de collectie van wortelexudaten en GC-TOF-MS-metingen voor reproduceerbaarheid.
- Genereert kwantitatieve output geschikt voor high-throughput screening van omgevingsstressoren.
Translationeel en preklinisch onderzoek
- Rijgt veranderingen in metabolieten in lijn met de ontdekking van omgevingsbiomarkers voor translationele continuïteit.
- Maakt een risico-gecorrigeerde vooruitgang van kandidaatstrategieën voor stressvermindering mogelijk.
- Biedt mechanistische inzichten in plant-omgevingsinteracties die relevant zijn voor duurzame landbouw.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van vroege hypotheseonderzoeken naar stressresponsen van planten tot de identificatie van metabolische biomarkers en preklinische validatie van detoxificatiemechanismen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothese-gedreven analyse van de samenstelling van wortelexsudaten onder gedefinieerde xenobiotische stress.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve metabolietprofielen voor comparatieve analyse van condities.
- Analytics: Biedt data met een hoog informatiegehalte via GC-TOF-MS en bio-informatische outputs voor pathway mapping.
- Translationeel onderzoek: Verbindt metabolomische verschuivingen met strategieën voor omgevingsbiomarkers wanneer dit wordt ondersteund door pathway-analyse.
- Enterprise Reuse: Vestigt een gestandaardiseerde workflow die aanpasbaar is voor andere plantensystemen en stressoren.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in mechanismen van plantenstressrespons en doelvalidatie.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, schaalbare en reproduceerbare metabolomische workflows.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go beslissingen voor het beperken van milieurisico's en strategieën voor gewasresistentie.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering mogelijk van studies naar plant-omgeving interacties binnen R&D-programma's.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in plantenmetabolomics en GC-TOF-MS-instrumentatie.
- Vraagt om een robuuste analytische infrastructuur voor high-throughput monsterverwerking en data-analyse.
- Maakt cross-team standaardisatie van protocollen voor monsterafname en datainterpretatie noodzakelijk.
- Aanpasbaar aan diverse plantmodellen en omgevingsstressoren door middel van protocoloptimalisatie.
- Afhankelijk van strikte replicatie en kwaliteitscontrole voor betrouwbare metabolomische resultaten.
