Letaliteit Bioassay met behulp van Artemia salina L.

Dit protocol is een zeer nuttig hulpmiddel voor een voorlopige algemene toxiciteitsevaluatie van verschillende soorten monsters, zoals extracten, fracties en verbindingen uit verschillende natuurlijke of synthetische bronnen. Het belangrijkste voordeel van ons protocol is dat het heel gemakkelijk en goedkoop is en op veel monsters tegelijkertijd kan worden gebruikt. Bovendien verbetert de handgemaakte apparatuur de betrouwbaarheid van de site.

In deze techniekfase doen we een screening om de monsters te selecteren op basis van hun voorlopige algemene toxiciteitsprofiel dat verdere specifieke tests zal ondergaan, zoals uitgebreide cellijnen of zelfs in-vivo tests. Deze methode wordt voornamelijk gebruikt in medicinale en andere productchemiegebieden om biotische monsters te screenen. Ons protocol kan ook worden gebruikt voor andere soorten monsters zoals nanosystemen.

Wees bij het eerste optreden geduldig, want dit vereist fijne observatievaardigheden en veel aandacht voor alle gerapporteerde parameters Marcia Filipe en Vera Isca, de promovendi van ons lab zullen helpen om deze procedure te demonstreren. Begin met het plaatsen van de trechtervormige container in de zwarte steun en draai de trechter in een geschikte richting om de niveaumarkering en de kraan te zien. Om de handgemaakte migratieapparatuur te maken, snijdt u de bovenkant van twee plastic flessen van 0,5 liter om een uiteindelijke hoogte van 12 centimeter te verkrijgen.

Maak een gat van 1,5 centimeter diameter aan één kant en zeven centimeter van de bodem van elke fles en steek een rubberen buis van 13 centimeter tussen de twee openingen. Sluit de openingen af met hete lijm en laat ze 15 minuten drogen. Zet de flessen op een plat oppervlak en vul ze met water om te controleren of er geen lekkage is.

Voeg 28 gram van het zout toe aan 800 milliliter kraanwater om de kunstmatige zoutoplossing te bereiden, of pekelgarnalenzout in een concentratie van 35 gram per liter. Meng het met een roerstaaf tot al het zout goed is opgelost. Om de monsters te bereiden, lost u een geschikte hoeveelheid van elk extract en elke verbinding dimethylsulfoxide, of DMSO, op in een eindconcentratie van 10 milligram per milliliter.

Verdun vervolgens 10 microliter van elk monster in een nieuwe microcentrifugebuis met behulp van 990 microliter van de kunstmatige zoutoplossing om een uiteindelijke concentratie van 0,1 milligram per milliliter te verkrijgen. Bereid onder een zuurkast in een Erlenmeyer-kolf een oplossing van kaliumdichromaat in gedestilleerd water in een concentratie van één milligram per milliliter. Vul het broedvat met het medium tot 500 milliliter en voeg één lepel of ongeveer 0,5 gram pekelgarnalcysten toe aan de zoutoplossing.

Sluit de container. Plaats een lamp die rechtstreeks op de apparatuur wijst en schakel deze in. Bevestig het luchttoevoersysteem aan de connector die bovenop de apparatuur is geplaatst en schakel de pomp in.

Pekelgarnalencysten komen uit in de kunstmatige zoutoplossing onder krachtige beluchting, continue verlichting en stabiele temperatuur. Na 24 tot 48 uur, wanneer de eieren zijn uitgekomen, schakelt u de luchtpomp uit en wacht u tot de nauplii zijn gescheiden van de lege eierdozen. Om de niet-gehate eieren van de levende nauplii te scheiden, opent u de uitlaatkraan aan de onderkant en voert u de inhoud van de trechter af in een van de containers van de handgemaakte migratieapparatuurcontainer.

Zorg ervoor dat de oplossing die de nauplii en de resterende niet-gehate eieren bevat, zich onder het buisniveau bevindt. Plaats de apparatuur vier uur in de incubator en voeg vervolgens in de tweede container de resterende zoutoplossing boven de hoogte van de buis toe. Bedek de container met nauplii en de resterende niet-gehate eieren met aluminiumfolie en plaats de lamp op de tweede container met alleen de zoutoplossing.

De pekelgarnalen worden aangetrokken door het licht en migreren van de ene container naar de andere, wat leidt tot een efficiënte scheiding tussen eieren en levende artemia. Verzamel uit de oogstcontainer 900 microliter zoutoplossing met 10 tot 15 nauplii en plaats de oplossing in één put van een 24 putplaat. Alle monsters worden getest in quadruplicaten.

Voeg 100 microliter van elke negatieve controle toe. Positieve controle, de kunstmatige zoutoplossing en elk van de monsters naar de putten en incuberen de plaat onder verlichting gedurende 24 uur. Registreer na 24 uur het aantal dode larven in elke put onder een binoculaire microscoop bij 12 x vergroting.

Voeg 100 microliter kaliumdichromaatoplossing toe om de dood van de resterende levende larven te induceren en wacht zes uur. Tel de totale dode larve in elke put onder een microscoop en bepaal het sterftecijfer volgens de vergelijking die op het scherm wordt weergegeven. Voer alle tests in drievoud uit en bereken de standaarddeviaties.

Druk ten slotte de resultaten uit als het gemiddelde van drie onafhankelijke experimenten met elk interne quadruplicaten plus, minus standaarddeviaties. De structuur van de geselecteerde verbindingen geëxtraheerd uit Plectranthus-soorten en verkregen door semi-synthese worden weergegeven in deze figuur. Een nieuw uitgekomen nauplii van Artemia Salina zoals gezien onder de microscoop is te zien op deze afbeelding.

Deze grafische afbeelding geeft het sterftecijfer van Artemia Salina weer na 24 uur blootstelling aan vier methanolextracten van Plectranthus-soorten bij 0,1 milligram per milliliter. Alle extracten waren aanvaardbaar in termen van algemene toxiciteit met behulp van deze test. Hier komt zout overeen met de zoutoplossing of blanco.

Kaliumdichromaat werd gebruikt als een positieve controle en DMSO werd gebruikt als een negatieve controle. Alle geteste extracten vertoonden zeer bemoedigende resultaten met zeer lage waarden van sterftepercentages die vergelijkbaar waren met die geregistreerd voor de blanco en de negatieve controle. Het sterftecijfer van Artemia Salina na 24 uur blootstelling aan de vijf zuivere verbindingen bij 0,1 milligram per milliliter wordt in deze figuur weergegeven.

Uit deze gegevens blijkt duidelijk dat slechts vijf minimale toxiciteit vertonen met behulp van deze test U moet drie stappen in het bijzonder onthouden, uitkomen, migratie en verzameling. Daarom hebben we andere garnalen gescheiden van en de nummers om mee te werken. De voorlopige site is een eenvoudig en goedkoop model kanaal toxiciteit in vergelijking met andere sites zoals celkweek of zebravissen.

Verder kunnen dan duurdere cytotoxiciteitsplaatsen worden geëxploiteerd.