Name: Translationele orthotopische modellen van glioblastoom multiforme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-17T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Leer een orthotopisch muismodel voor glioblastoom via intracraniale injectie van GEM-afgeleide tumorcellen. Deze methode reproduceert menselijke GBM-kenmerken en helpt therapeutische strategieën te evalueren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We zijn de heer Alan E. Kulaga dankbaar voor de uitstekende technische assistentie en mevrouw Michelle L. Gumprecht voor het verfijnen van de chirurgische technieken. We bedanken Dr. Philip L. Martin voor pathologie-analyse en mevrouw Lilia Ileva en Dr. Joseph Kalen van het Frederick National Laboratory Small Animal Imaging Program voor MRI-scans.
Dit project is geheel of gedeeltelijk gefinancierd met federale fondsen van het National Cancer Institute, National Institutes of Health, onder contractnummer HHSN261201500003I. De inhoud van deze publicatie weerspiegelt niet noodzakelijkerwijs de standpunten of het beleid van het ministerie van Volksgezondheid en Human Services, noch impliceert de vermelding van handelsnamen, commerciële producten of organisaties goedkeuring door de Amerikaanse overheid.

Het hier beschreven onderzoeksprotocol is goedgekeurd door het NCI van het Frederick Animal Care and Use Committee. NCI-Frederick is geaccrediteerd door AAALAC International en volgt het beleid van de volksgezondheidsdienst voor de verzorging en het gebruik van proefdieren. Dierverzorging werd verleend in overeenstemming met de procedures die zijn beschreven in de "Guide for Care and Use of Laboratory Animals (National Research Council, 2011; De National Academies Press, Washington D.C.).
1. Voorbereiding van cellen voor injectie
OPMERKING: Primaire cellen van muizenhersentumoren (MBR's) die voor dit model werden gebruikt, werden oorspronkelijk geïsoleerd uit tamoxifen-geïnduceerde TRP GEM-muizen, zoals beschreven in El Meskini et al.5. Details over het celpreparaat zijn te vinden in deze referentie.
<ol><li>Voer de volgende stappen uit met behulp van steriele techniek in een bioveiligheidskast.</li>
	<li>Kweek primaire hersentumorcellen in vitro totdat ze de exponentiële groeifase bereiken.</li>
	<li>Oogst de cellen in 0,25% trypsine en zodra ze zijn losgemaakt, verdun ze met groeimedium om de trypsine te inactiveren.</li>
	<li>Pellet de cellen door centrifugeren op 400 x g en was met serumvrije media. Herhaal dit één keer voordat u gaat tellen.</li>
	<li>Tel de cellen handmatig of met een geautomatiseerde celteller. Resuspendeer de cellen in 5% steriele methylcellulose in 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) in de gewenste concentratie, op basis van een eindinjectievolume van 2 μL. De gewenste celconcentratie kan variëren op basis van de cellijn en het hersentumormodel. Voor GBM GEM TRP-cellen injecteren we 2 μL van een 25 x 106 cellen / ml-oplossing, of 50.000 cellen.</li>
</ol>2. Muizenstam
<ol><li>Fok of koop een geschikte muizenstam die overeenkomt met de stamachtergrond van de hersentumorcellen. Gebruik voor TRP-cellen 9 weken oude B6D2F1 / J-muizen (van een kruising tussen C57BL / 6J [B6] -vrouwtjes en DBA / 2J [D2] -mannetjes) als ontvangers van tumorcellen.</li>
</ol>3. Het chirurgische gebied instellen
OPMERKING: Alle chirurgische stappen worden uitgevoerd met behulp van aseptische techniek in een schone, ontsmette omgeving. Scrubs en persoonlijke beschermingsmiddelen, waaronder een masker, moeten door de chirurg worden gedragen. Chirurgische hulpmiddelen moeten vóór gebruik met warmte worden gesteriliseerd.
<ol><li>Plaats oppervlaktebeschermers onder het stereotaxische apparaat en op het werkoppervlak.</li>
	<li>Bevestig de vinylslang van het anesthesieapparaat aan de IN-poort van het gasanesthesieplatform van het stereotaxische apparaat en een andere buis aan de OUT-poort.</li>
	<li>Sluit het digitale display aan op een voedingsbron en op het apparaat.</li>
	<li>Sluit de micropompregelaar (figuur 1A) aan op een voedingsbron en bevestig de micropomp (figuur 1A) aan de manipulatorarm van het apparaat (zie ook de instructies van de fabrikant).</li>
	<li>Stel de micropomp in op 5,6 nL/s voor de volume-injectie van 2.000 nL.</li>
	<li>Zet de hete kraalsterilisator aan.</li>
	<li>Sluit het verwarmingskussen van de muis aan op de temperatuurregelaar en sluit het aan op een voedingsbron. Plaats de plaat op het podiumplatform. Stel de plaattemperatuur in op 37 °C.</li>
	<li>Backload een 30 G precisiespuit en zorg ervoor dat u geen bubbels introduceert. Plaats de zuiger en bevestig de naald. Zorg ervoor dat u de naald alleen bij de naaf vastpakt. Druk de zuiger in totdat een druppel van het methylcellulosecelmengsel door de naald stroomt. Reinig de naald met een 70% alcoholbereidingspad door voorzichtig de zijkanten van de naald af te vegen of door een steriel gaasje op het werkoppervlak te plaatsen en het te deppen. Zorg ervoor dat u de naald niet buigt of breekt.</li>
	<li>Bevestig de precisiespuit aan de micropomp en draai de manipulatorarm weg van het podium om verplaatsing van de spuitnaald te voorkomen voordat u de muis op het podium plaatst.</li>
</ol>4. De muis voorbereiden op een operatie
<ol><li>Verdoof de muis door deze in de inductiekamer te plaatsen met de isofluraan vaporizer ingesteld op 2,5%, of volgens institutionele richtlijnen. Zet de isofluraanstroom naar de neuskegel aan.</li>
	<li>Breng de muis over naar het stereotaxische apparaat en bevestig deze aan de neuskegel, met de bovenste tanden op de neuskegelsteun geplaatst (figuur 1B, 9). Draai de knop op de neuskegel vast om vast te zetten (figuur 1B). Zorg voor een passend niveau van anesthesie door een teenknijper uit te voeren om te controleren op reflex.<ol><li>Controleer de oren, voeten en slijmvliezen op kleur (roze) om voldoende oxygenatie te garanderen. Controleer ook de ademhalingsfrequentie (een toename of afname kan wijzen op de noodzaak om isofluraanniveaus aan te passen).</li>
	</ol></li>
	<li>Steek oorbalkjes (figuur 1B) in beide oren en draai de knop vast om het hoofd vast te zetten.</li>
	<li>Breng oogzalf aan om de ogen te smeren terwijl de muis onder narcose is.</li>
	<li>Gebruik een gebogen tang om het haar op het hoofd van de muis te plukken naar een gebied dat ongeveer 150% groter is dan de geplande incisie, om adequate aseptische omstandigheden te garanderen.</li>
	<li>Injecteer 0,5-1 mg/kg buprenorfine SR-analgesie subcutaan of gebruik een ander door het protocol goedgekeurd analgeticum.</li>
	<li>Plaats de rectale sonde van de muis om de interne temperatuur te controleren en onderkoeling als gevolg van anesthesie te voorkomen. Houd de lichaamstemperatuur van de muis tussen 36,5 en 38,5 °C.</li>
	<li>Ontsmet het operatieveld met behulp van buitenste cirkels, afwisselend drie keer een chirurgische scrub en ethanol.</li>
	<li>Gebruik een tang om de huid strak te trekken en maak een incisie van ongeveer 1 cm met het scalpelmesje, beginnend tussen de ogen. De bregma moet zichtbaar zijn door de incisie. OPMERKING: Voor de juiste steriele techniek raakt u de chirurgische plaats alleen aan met de uiteinden van gesteriliseerde gereedschappen en plaatst u gereedschapspunten alleen op een steriel oppervlak (zoals de binnenkant van een geautoclaveerd gereedschapspakket).</li>
	<li>Gebruik het houten uiteinde van de applicator met katoenpunt om overtollig bindweefsel weg te schrapen en vervolgens het katoenen uiteinde van een andere applicator te drogen.</li>
</ol>5. Celinjectie
<ol><li>Plaats de manipulatorarm met de bevestiging van de spuit over de muis en draai de knop vast om vast te zetten. Gebruik de X- en Y-knoppen in het horizontale vlak om de spuitbevestiging over bregma te bewegen. Laat de naald zakken met de Z-knop om de bregmapositie te bevestigen. Stel de digitale uitleesconsole in op nul.</li>
	<li>Gebruik de X- en Y-knoppen en de bijbehorende digitale uitlezing om de naald naar de gewenste positie te verplaatsen. Voor de corticale cortexlocatie zijn de juiste coördinaten 3 mm posterieur, 2 mm lateraal rechts naar de bregma en 2 mm diep van de dura mater. Gebruik de Z-knop om de naald naar het oppervlak van de schedel te verplaatsen.</li>
	<li>Prik een gat in de schedel met een spuit van 1 ml met een bijgevoegde naald van 25 G. Plaats de schuine kant van de naald in de richting van de 30 G precisiespuit en naald en draai de manipulatorarm voorzichtig naar de zijkant. Rol met duim en vinger de naald langzaam heen en weer met zachte druk totdat de naaldpunt net de schedeldop doorboort.</li>
	<li>Gebruik een applicator met katoenen punt om bloed weg te deppen van het naaldgat. Plaats de manipulatorarm terug in de juiste positie met de geladen precisiespuitnaald boven het gat. Lijn de punt van de naald uit met het gat, gebruik de Z-knop om de naald naar de hersendura te laten zakken en stel de digitale uitleesconsole op nul.</li>
	<li>Laat met de Z-knop de naald 1 mm zakken en wacht 1 minuut. Herhaal dit totdat de gewenste diepte is bereikt (2 mm zoals aangegeven). OPMERKING: De naald wordt langzaam neergelaten om extra schade aan het omliggende hersenweefsel en de terugstroom van de celoplossing te voorkomen.</li>
	<li>Start de micropomp en controleer vervolgens of de pomp stopt wanneer 2 μL is geïnjecteerd. Dit proces duurt ongeveer 6 minuten bij de aangegeven snelheid. Wacht vervolgens 1 minuut voordat u de naald verplaatst.</li>
</ol>6. Verwijdering van de naald en wondsluiting
<ol><li>Til de naald 1 mm op en wacht 1 min. Herhaal dit totdat de naald volledig vrij is van de schedel.</li>
	<li>Gebruik indien nodig een applicator met katoenpunt om bloed weg te deppen van de injectieplaats.</li>
	<li>Gebruik het houten uiteinde van een applicator met katoenen punt en neem een klein stukje botwas (~ 1 mm) en vorm het tot een kegel. Plaats het in de opening in de schedel en duw de was in het gat.</li>
	<li>Verwarm de tang met behulp van een kralensterilisator en gebruik ze om de resterende was op de schedel te smelten en glad te maken.</li>
	<li>Plaats ongeveer twee druppels bupivacaïne (verdovings)oplossing in de incisie en gebruik een tang om de randen van de huid samen te trekken.</li>
	<li>Trek de huid strak en plaats een of twee wondclips om de huid te sluiten.</li>
	<li>Plaats de muis in een schone herstelkooi op een verwarmingskussen in een tochtvrije ruimte en observeer de muis nauwkeurig. Laat de muis volledig ontwaken uit de anesthesie en hervat de normale activiteit voordat u hem terugbrengt naar de normale behuizing.</li>
	<li>Controleer de muis dagelijks na de chirurgische ingreep en dien pijnbestrijding toe, volgens de institutionele richtlijnen.<ol><li>Als buprenorfine SR (stap 4.6) wordt gebruikt voor analgesie, duurt de formule met aanhoudende afgifte 72 uur. Herhaal de injectie alleen als er na 72 uur zichtbare pijn of ongemak aanwezig is. Wanneer correct uitgevoerd, herstellen de muizen goed van de intracraniële injecties en is extra analgesie niet nodig.</li>
		<li>Verwijder de nietjes 7-10 dagen na de operatie.</li>
	</ol></li>
	<li>Controleer de tumorgroei door beeldvorming van levende dieren (MRI).<ol><li>Euthanaseer de muizen wanneer humane eindpunten worden bereikt (d.w.z. als het dier 20% lichaamsgewicht verliest of onderkoeld raakt).</li>
		<li>Vanwege de invasieve aard van deze hersentumoren, observeer de muizen op neurologische symptomen, zoals ongelijkmatige gang, gedeeltelijke verlamming, draaien of hoofdkanteling. Euthanaseer een muis als een van deze klinische tekenen van gevorderde tumorgroei wordt waargenomen.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Tamimi, A. F., Juweid, M. Epidemiology and Outcome of Glioblastoma. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTamimi%2C+AF+%22Glioblastoma%22">Glioblastoma</a>. , (2017).</li>
<li>Robertson, F. L., Marques-Torrejon, M. A., Morrison, G. M., Pollard, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+models+and+tools+to+tackle+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Experimental models and tools to tackle glioblastoma.</a> Disease Models & Mechanisms. 12 (9), (2019).</li>
<li>Wen, P. Y., Kesari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malignant+gliomas+in+adults%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Malignant gliomas in adults.</a> The New England Journal of Medicine. 359 (5), 492-507 (2008).</li>
<li>Haddad, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+glioblastoma+for+the+evaluation+of+novel+therapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology+Advances%22%5BJournal%5D)">Mouse models of glioblastoma for the evaluation of novel therapeutic strategies.</a> Neuro-Oncology Advances. 3 (1), (2021).</li>
<li>El Meskini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+preclinical+orthotopic+model+for+glioblastoma+recapitulates+key+features+of+human+tumors+and+demonstrates+sensitivity+to+a+combination+of+MEK+and+PI3K+pathway+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">A preclinical orthotopic model for glioblastoma recapitulates key features of human tumors and demonstrates sensitivity to a combination of MEK and PI3K pathway inhibitors.</a> Disease Models & Mechanisms. 8 (1), 45-56 (2015).</li>
<li>Song, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+etiology+of+high-grade+astrocytomas%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Evolutionary etiology of high-grade astrocytomas.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (44), 17933-17938 (2013).</li>
<li>Cancer Genome Atlas Research Network. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+genomic+characterization+defines+human+glioblastoma+genes+and+core+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways.</a> Nature. 455 (7216), 1061-1068 (2008).</li>
<li>Motomura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+analysis-based+proteomic+subclassification+of+newly+diagnosed+glioblastomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical analysis-based proteomic subclassification of newly diagnosed glioblastomas.</a> Cancer Science. 103 (10), 1871-1879 (2012).</li>
<li>Choyke, P. L., Dwyer, A. J., Knopp, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+tumor+imaging+with+dynamic+contrast-enhanced+magnetic+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Magnetic+Resonance+Imaging%22%5BJournal%5D)">Functional tumor imaging with dynamic contrast-enhanced magnetic resonance imaging.</a> Journal of Magnetic Resonance Imaging. 17 (5), 509-520 (2003).</li>
<li>Raza, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+necrosis-associated+genes+in+glioblastoma+by+cDNA+microarray+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of necrosis-associated genes in glioblastoma by cDNA microarray analysis.</a> Clinical Cancer Research. 10, 212-221 (2004).</li>
<li>Raza, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Necrosis+and+glioblastoma%3A+a+friend+or+a+foe%3F+A+review+and+a+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Necrosis and glioblastoma: a friend or a foe? A review and a hypothesis.</a> Neurosurgery. 51 (1), 2-12 (2002).</li>
<li>Hambardzumyan, D., Bergers, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma%3A+defining+tumor+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma: defining tumor niches.</a> Trends in Cancer. 1 (4), 252-265 (2015).</li>
<li>Kijima, N., Kanemura, Y. Glioblastoma. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKijima%2C+N+%22Mouse+Models+of+Glioblastoma%22">Mouse Models of Glioblastoma</a>. , Exon Publications. (2017).</li>
<li>Casanova, F., Carney, P. R., Sarntinoranont, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+needle+insertion+speed+on+tissue+injury%2C+stress%2C+and+backflow+distribution+for+convection-enhanced+delivery+in+the+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Effect of needle insertion speed on tissue injury, stress, and backflow distribution for convection-enhanced delivery in the rat brain.</a> PloS One. 9 (4), 94919(2014).</li>
<li>Jin, F., Jin-Lee, H. J., Johnson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Models+of+Experimental+Glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Gliomas%22%5BJournal%5D)">Mouse Models of Experimental Glioblastoma.</a> Gliomas. , Exon Publications. (2021).</li>
<li>Zalles, M., Towner, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-Clinical+Models+and+Potential+Novel+Therapies+for+Glioblastomas%5BTitle%5D)+AND+%22Gliomas%22%5BJournal%5D)">Pre-Clinical Models and Potential Novel Therapies for Glioblastomas.</a> Gliomas. , Exon Publications. 1-13 (2021).</li>
<li>Wierzbicki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+and+therapeutic+monitoring+of+H3K27M-mutant+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Oncology+Reports%22%5BJournal%5D)">Targeting and therapeutic monitoring of H3K27M-mutant glioma.</a> Current Oncology Reports. 22 (2), 19(2020).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben.

Preklinische modellen zijn essentieel voor de evaluatie van nieuwe therapeutische doelen en nieuwe behandelingsstrategieën in GBM. Genetisch gemanipuleerde muismodellen voor GBM hebben het voordeel dat tumoren voorkomen op de autochtone plaats, maar vaak met een lange latentie en onvoorspelbare tumorgroei13. De GEM-modeltumoren vertonen een latentie van 4-5 maanden en het ideale tijdvenster voor beeldvorming, rekrutering en behandeling is variabel bij individuele muizen. Het orthotopische model he...

Glioblastoom (GBM; graad IV glioom) is de meest voorkomende en kwaadaardige hersentumor en de huidige therapieën zijn niet effectief, wat resulteert in een mediane overleving van 15 maanden1. Betrouwbare en nauwkeurige preklinische modellen die de complexe signaalroutes vertegenwoordigen die betrokken zijn bij de groei en pathogenese van hersentumoren zijn essentieel om de vooruitgang bij het evalueren van nieuwe therapeutische regimes voor GBM te versnellen. Muismodellen waarin menselijke hersentumorcellijnen subcutaan worden geïmplanteerd in immuungecompromitteerde muizen weerspiegelen niet de inheemse immuunomgeving van hersentumoren, noch kunnen ze worden gebruikt om het vermogen van therapeutica om de bloed-hersenbarrière te passerente evalueren 2. Idealiter zouden preklinische muismodellen ook de menselijke GBM-histopathologie nauwkeurig moeten reproduceren, inclusief het hoge niveau van invasiviteit in het omringende parenchym3. Hoewel genetisch gemanipuleerde muismodellen (GEM) tumoren ontwikkelen in de context van een intact immuunsysteem, zijn er vaak gecompliceerde fokschema's nodig en kunnen tumoren zich langzaam en inconsistent ontwikkelen4. GEM-afgeleide allograftmodellen zijn beter geschikt voor preklinische therapeutische studies, waarbij grote cohorten tumordragende muizen nodig zijn in een korter tijdsbestek.
In een eerder rapport beschreven we een orthotopisch GBM-muismodel dat rechtstreeks is afgeleid van GEM-tumoren. Tumorigenese in het GEM wordt geïnitieerd door genetische gebeurtenissen in celpopulaties (voornamelijk astrocyten) die gliaal fibrillair zuur eiwit (GFAP) tot expressie brengen, die resulteren in progressie naar GBM. Deze TRP GEMs bevatten een TgGZT121-transgen (T), dat T121 tot expressie brengt na blootstelling aan de GFAP-aangedreven Cre-recombinase. T121 eiwitexpressie resulteert in de onderdrukking van Rb (Rb1, p107 en p103) eiwitactiviteit. Co-expressie van een GFAP-gedreven Cre-transgen (GFAP-CreERT2) richt zich op expressie naar volwassen astrocyten na inductie met tamoxifen. TRP-muizen herbergen ook een Cre-afhankelijke mutant Kras (KrasG12D; R) allel, om de activering van de receptor tyrosine kinase route weer te geven, en zijn heterozygoot voor het verlies van Pten (P)5,6. Gelijktijdige genafwijkingen in de receptor tyrosinekinase (RTK), PI3K en RB-netwerken zijn betrokken bij 74% van de GBM-pathogenese7. Daarom worden de primaire signaalroutes die zijn veranderd in menselijke GBM vertegenwoordigd door de gemanipuleerde mutaties in TRP-muizen, in het bijzonder GBM-tumoren, waarin gedeelde downstream-doelen van RTK's worden geactiveerd5.
Het gem-afgeleide syngenetische orthotopische model werd gevalideerd als een model dat kenmerken van menselijke hersentumoren samenvat, inclusief invasiviteit en de aanwezigheid van subtype biomarkers, voor gebruik als een platform om kankertherapieën te evalueren die gericht zijn op afwijkende routes in GBM. Cellen werden gekweekt uit tumoren geoogst uit TRP-hersenen en opnieuw geïmplanteerd in de hersenen van op stam afgestemde muizen, met behulp van stereotactische apparatuur voor intracraniële injectie in de cortex. Dit preklinische orthotopische muismodel ontwikkelde GBM-tumoren die zeer cellulair, invasief, pleomorf waren met een hoge mitotische snelheid en lineaire foci van necrose vertoonden door neoplastische cellen en dichte vascularisatie, zoals waargenomen voor menselijke GBM. Tumorvolumes en groei werden gemeten met in vivo magnetische resonantie beeldvorming (MRI).
In dit rapport beschrijven we de optimale techniek voor de intracraniële injectie van primaire GBM-cellen of cellijnen in het wild-type muizenbrein, met TRP-tumoren als voorbeeld. Hetzelfde protocol kan worden aangepast voor immuungecompromitteerde muizen en andere GBM-cellijnen. Cruciale tips worden gegeven voor het vermijden van veelvoorkomende valkuilen, zoals suboptimale celvoorbereiding of cellekkage op de injectieplaats, en voor het correct gebruiken van de stereotactische apparatuur om de reproduceerbaarheid en betrouwbaarheid van het model te garanderen. Voor translationele doeleinden valideren we het model door MRI-detectie van hersentumorgroei bij levende dieren, histologische karakterisering en presenteren we een voorbeeld van behandeling bij tumordragende muizen.

<table><tbody><tr><td>5% methylcellulose in 1X PBS, autoclaved</td><td>Millipore Sigma</td><td>M7027</td><td></td></tr><tr><td>1mL Tuberculin Syringe, slip tip</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>6" Cotton Tipped Applicators</td><td>Puritan</td><td>S-18991</td><td></td></tr><tr><td>Adjustable stage platform</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Model 901</td><td></td></tr><tr><td>Aerosol Barrier Tips</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-33</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol Prep Pads Sterile, Large - 2.5 x 3 Inch</td><td>PDI</td><td>C69900</td><td></td></tr><tr><td>B6D2  mouse strain (C57Bl/6J x DBA/2J)</td><td>Jackson Laboratory</td><td>Jax #10006</td><td></td></tr><tr><td>Bone Wax</td><td>Surgical Specialties</td><td>901</td><td></td></tr><tr><td>Bupivacaine 0.25%</td><td>Henry Schein</td><td>6023287</td><td></td></tr><tr><td>BuprenorphineSR</td><td>ZooPharm</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Clear Vinyl Tubing 1/8ID X 3/16OD</td><td>UDP</td><td>T10004001</td><td></td></tr><tr><td>CVS Lubricant Eye Ointment</td><td>CVS Pharmacy</td><td>247881</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Scalpels, #10 blade</td><td>Scalpel Miltex</td><td>16-63810</td><td></td></tr><tr><td>Gas anesthesia machine with oxygen hook-up and anesthesia box</td><td>Somni Scientific</td><td>n/a</td><td>Onderzoeker mag faciliteit standaardapparatuur gebruiken</td></tr><tr><td>Gas anesthesia platform for mice</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Model 923-B</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>Graphpad</td><td>Prism&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 9&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; version 9.4.1</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton 30 g needle, &frac12; &ldquo;, small hub, point pst 3</td><td>Hamilton</td><td>Special Order</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton precision microliter syringe, 1701 RN, no needle 10 &micro;L</td><td>Hamilton</td><td>7653-01</td><td></td></tr><tr><td>Hot bead sterilizer with beads</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-45</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen Countess 3 Automated Cell Counter</td><td>Fisher Scientific</td><td>AMQAX2000</td><td></td></tr><tr><td>IsoFlurane</td><td>Piramal Critical Care</td><td>29404</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl Alcohol Prep Pads</td><td>PDI</td><td>C69900</td><td></td></tr><tr><td>ITK_SNAP (Version 36.X, 2011-present)</td><td>Penn Image Computing and Science Laboratory (PICSL) at the University of Pennsylvania, and the Scientific Computing and Imaging Institute (SCI) at the University of Utah</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KOPF Small Animal Stereotaxic Instrument with digital readout console</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Model 940</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex Fitting, PVDF, Straight, Hose Barb Reducer, 1/4" ID x 1/8" ID</td><td>Masterflex</td><td>HV-30616-16</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Heating Plate</td><td>David Kopf Instruments</td><td>PH HP-4M</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Rectal Probe</td><td>David Kopf Instruments</td><td>PH RET-3-ISO</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Super Versi-Dry Surface Protectors</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>74000-00</td><td></td></tr><tr><td>P20 pipette</td><td>Gilson</td><td>F123600</td><td></td></tr><tr><td>Povidone Iodine Surgical Scrub</td><td>Dynarex</td><td>1415</td><td></td></tr><tr><td>Reflex 9 mm Wound Clip Applicator</td><td>Fine Science Tools</td><td>12031-09</td><td></td></tr><tr><td>Reflex 9 mm Wound Clip Remover</td><td>Fine Science Tools</td><td>12033-00</td><td></td></tr><tr><td>Reflex 9 mm Wound Clips</td><td>Fine Science Tools</td><td>12032-09</td><td></td></tr><tr><td>Semken forceps, curved</td><td>Fine Science Tools</td><td>11009-13</td><td></td></tr><tr><td>Temperature Controller</td><td>David Kopf Instruments</td><td>PH TCAT-2LV</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Tuberculin Syringe with 25g needle, slip tip</td><td>BD</td><td>309626</td><td></td></tr><tr><td>UltraMicroPump 3 with Micro2T Controller</td><td>World Precision Instruments</td><td>Model UMP3T</td><td></td></tr></tbody></table>

translationele orthotopische modellen van glioblastoom multiforme

Translational Orthotopic Models of Glioblastoma Multiforme

Genetisch gemanipuleerde muis (GEM) modellen voor menselijk glioblastoom multiforme (GBM) zijn van cruciaal belang voor het begrijpen van de ontwikkeling en progressie van hersentumoren. In tegenstelling tot xenografttumoren, ontstaan tumoren in GEM's in de oorspronkelijke micro-omgeving in een immunocompetente muis. Het gebruik van GBM GEMs in preklinische behandelingsstudies is echter een uitdaging vanwege lange tumorlatenties, heterogeniteit in neoplasmafrequentie en de timing van geavanceerde tumorontwikkeling. Muizen geïnduceerd via intracraniële orthotopische injectie zijn beter handelbaar voor preklinische studies en behouden kenmerken van de GEM-tumoren. We genereerden een orthotopisch hersentumormodel afgeleid van een GEM-model met Rb, Kras en p53-aberraties (TRP), dat GBM-tumoren ontwikkelt met lineaire foci van necrose door neoplastische cellen en dichte vascularisatie analoog aan menselijke GBM. Cellen afgeleid van GEM GBM-tumoren worden intracraniaal geïnjecteerd in wild-type, stam-gematchte ontvangende muizen en reproduceren graad IV-tumoren, waardoor de lange tumorlatentieperiode bij GEM-muizen wordt omzeild en de creatie van grote en reproduceerbare cohorten voor preklinische studies mogelijk wordt. De zeer proliferatieve, invasieve en vasculaire kenmerken van het TRP GEM-model voor GBM worden samengevat in de orthotopische tumoren en histopathologiemarkers weerspiegelen menselijke GBM-subgroepen. Tumorgroei wordt gemonitord door seriële MRI-scans. Vanwege de invasieve aard van de intracraniële tumoren in immunocompetente modellen, is het zorgvuldig volgen van de hier beschreven injectieprocedure essentieel om extracraniële tumorgroei te voorkomen.

Muizen geïnjecteerd met hersentumorcellen moeten dagelijks worden gecontroleerd op tekenen van tumorgroei zoals toevallen, ataxie of gewichtsverlies. De groei van hersentumoren kan ook worden gecontroleerd door MRI-scans met regelmatige tussenpozen. Wekelijkse MRI-scans maken het mogelijk om de toenemende tumorlast in de hersenen en tumorvolumemetingen te visualiseren (figuur 1C). In het bijzonder vertonen TRP-tumoren agressieve groei en 3D-tumorvolumes zijn meetbaar met MRI binnen 2 tot 3 w...

Hier beschrijven we een preklinisch orthotopisch muismodel voor GBM, vastgesteld door intracraniële injectie van cellen afgeleid van genetisch gemanipuleerde muismodeltumoren. Dit model toont de ziektekenmerken van menselijke GBM. Voor translationele studies wordt de hersentumor van de muis gevolgd door in vivo MRI en histopathologie.

Translationele orthotopische modellen van glioblastoom multiforme

Genetically engineered mouse (GEM) models for human glioblastoma multiforme (GBM) are critical to understanding the development and progression of brain ...

We beschrijven de optimale techniek voor intracraniële injectie van GEM-afgeleide glioblastoomcellen in een immunocompetent muizenbrein, resulterend in tumoren die de belangrijkste kenmerken van menselijk glioblastoom recapituleren. Deze techniek voor orthotopische injectie van GEM-afgeleide TRP-cellen levert zeer reproduceerbare, schaalbare en consistente resultaten op voor tumoren die hun oorsprong vinden in de cortex, maar toch de invasiviteit van GEM-tumoren behouden. Muis glioblastoom hersentumoren vertonen agressieve groei en dringen het omliggende hersenparenchym binnen.Daarom kan het worden gebruikt om therapieën te evalueren die tumorinfiltratie en migratie bij patiënten kunnen onderdrukken. Dit protocol kan worden aangepast voor andere hersentumormodellen, virussen, therapeutica of worden aangepast voor injectie in verschillende hersengebieden met de aanpassingen van stereotaxische coördinaten. De procedure wordt gedemonstreerd door Devon Atkinson, een onderzoeksmedewerker van mijn laboratorium.Plaats om te beginnen oppervlaktebeschermers onder het stereotaxische apparaat en op het werkoppervlak. Sluit de vinylbuis van het anesthesieapparaat aan op de in-poort van het gas

translational-orthotopic-models-of-glioblastoma-multiforme

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Het doel van dit artikel is het beschrijven van het gebruik van een orthotope glioblastoma model voor chemoradiatie studies. Dit artikel gaat echter cel verwerking, het implanteren, en radiotherapie van de muis met behulp van een intracraniële model.

Combinatie Radiotherapie in een orthotope Mouse hersentumor Model

We beschrijven een geïntegreerde methode voor de exacte, stereotactische implantatie van menselijke glioblastoma multiforme cellen in de hersenen van muizen en vervolgens naakt...

Stereotactische Intracraniale Implantatie en<em&gt; In vivo</em&gt; Bioluminescent Imaging van tumorxenograften in een Muis Model Systeem van glioblastoma multiforme

Kwaadaardige gliomen vormen een heterogene groep van zeer infiltratieve gliane neoplasmata met duidelijke klinische en moleculaire kenmerken. Primaire orthotopische xenograften heroveren de histopathologische en moleculaire kenmerken van kwaadaardige glioomsubtypes in preklinische diermodellen.

Primaire orthotopische glioom xenograften recapituleren infiltratieve groei en isocitraat dehydrogenase I mutatie

We hebben een corticaal orthotope glioblastoom model vastgesteld muizen intravitale twee-foton microscopie dat de biofysische beperkingen recapituleert beginsel zullen spelen tijdens de groei van de tumor. Een chronische glazen venster vervangen van de schedel boven de tumor kan de follow-up van de progressie van de tumor na verloop van tijd door twee-foton microscopie.

Een orthotope Glioblastoma Muis Model Handhaving Brain Parenchymale fysieke beperkingen en geschikt voor intravitale twee-foton microscopie

Fenotypisch wild-type astrocyten en neurale stamcellen die zijn geoogst uit muizen die zijn gemodificeerd met gefloxte, conditionele oncogeen allelen en getransformeerd via virale Cre-gemedieerde recombinatie, kunnen worden gebruikt om de pathogenese van astrocytomen in vitro en in vivo te modelleren door orthotopische injectie van getransformeerde cellen in hersenen van syngene, immuuncompetente nestgenoten.

Modeling Astrocytoom Pathogenese In Vitro En In Vivo Met behulp van corticale Astrocyten of neurale stamcellen uit Conditional, genetisch gemanipuleerde muizen

Hier beschrijven we een efficiënt en veelzijdig protocol om nieuwe glioblastoma (GBM) te induceren, monitoren en analyseren met behulp van transposon DNA dat in de ventrikels van neonatale muizen wordt geïnjecteerd. Cellen van de subventriculaire zone, die het plasmide opnemen, transformeren, prolifereren en genereren tumoren met histo-pathologische kenmerken van menselijk GBM.

Transposon Mediated Integratie van plasmide DNA in de subventriculaire zone van pasgeboren muizen om Novel Modellen van glioblastoma Genereer

GL261-glioomcellen bieden een bruikbaar immunocompetent diermodel van glioblastoom. De doelen van dit protocol zijn om de juiste technieken te demonstreren voor het monitoren van intracraniële tumorgroei met behulp van in vivo bioluminescentie-beeldvorming, en om de bruikbaarheid van luciferase-gemodificeerde GL261-cellen te verifiëren voor het bestuderen van tumorimmunologie en immunotherapeutische benaderingen voor de behandeling van glioblastoom.

Bioluminescentie beeldvorming van een Immunocompetente diermodel voor Glioblastoma

Hier presenteren we een protocol voor de voorbereiding en het stereotaxic beheer van allogene menselijke lymfocyten in immunodeficiëntie muizen uitvoering orthotopic menselijke primaire hersentumoren. Deze studie biedt een bewijs-van-concept voor zowel de haalbaarheid en antitumorale werkzaamheid van cellulaire immuuntherapie intrabrain-geleverd.

Stereotactische adoptief overdracht van cytotoxische immuuncellen in lymfkliertest modellen van Orthotopic mens Glioblastoma Multiforme Xenografts

Het doel van dit protocol is om onderzoekers een zeer reproduceerbare techniek te bieden voor intracraniële implantaties.

Stereotactische intracraniële implantatie van door de patiënt afgeleide xenograftcellijnen van de glioblastoom bij muizen

We presenteren een 3D-glioblastoommigratiemodel met behulp van door patiënten afgeleide magnetische gliomasferen, gegenereerd uit nieuw gediagnosticeerde en terugkerende tumoren. Dit platform maakt het mogelijk om patiëntspecifieke migratiedynamiek te visualiseren en de therapeutische effectiviteit te beoordelen. De assay kan na migratie worden gemultiplexed om eiwitlokalisatie en expressiepatronen te evalueren.

Reproducerbare 3D glioblastoom migratietest met magnetische nanodeeltjesgemedieerde sferoidlokalisatie onder hypoxische omstandigheden

Leer een orthotopisch muismodel voor glioblastoom via intracraniale injectie van GEM-afgeleide tumorcellen. Deze methode reproduceert menselijke GBM-kenmerken en helpt therapeutische strategieën te evalueren.

Translationele orthotopische modellen van glioblastoom multiforme

Meer video's verkennen