High-Content screening assay voor de identificatie van antilichaam-afhankelijke cellulaire cytotoxiciteit modificerende verbindingen

Antilichaamafhankelijke cellulaire cytotoxiciteit, of kortweg ADCC, kan worden gemedieerd door natural killer-cellen, die we NK-cellen, granulocyten en de macrofagen noemen. Dit zijn de effectorcellen van ADCC. Als een antilichaam zoals trastuzumab, dat zich richt op de epidermale groeifactorreceptor, HER2, zich bindt aan tumorcellen, dan gebruiken deze effectorcellen hun FcyR-receptoren om het constante FC-gebied van de antilichamen te binden.

Het antilichaam overbrugt de tumorcellen en de FcyR-receptordragende effectorcellen, waardoor de afgifte van hun cytotoxische korrels wordt geactiveerd. Dit leidt tot apoptose van de kankercellen. ADCC kan effectief zijn tegen tumoren die niet reageren op de antiproliferatieve effecten van trastuzumab.

Om het ADCC-systeem op te zetten, moeten we de anti-HER2-positieve JIMT-1-borstcarcinoomcellen co-incuberen met de NK-92-cellijn in aanwezigheid van het anti-HER2-antilichaam trastuzumab. De JIMT-1 cellijn die we gebruiken voor de test drukt stabiel het groene fluorescerende eiwit uit. Codeer eerst de 96-well high-content zeefplaat met het JIMT-medium.

Pipetteer 50 microliter medium in elk putje van de plaat. Plaats de plaat een uur in een CO2-incubator. Coating is cruciaal voor de bevestiging van JIMT-1-cellen aan het glazen oppervlak van de plaat.

Tijdens de coatingstap, trypsinize JIMT-1 cellen. Was de cellen met twee milliliter steriele PBS. Voeg vervolgens een milliliter Trypsine-EDTA toe aan de kolf.

Plaats de kolf gedurende 10 minuten terug in een CO2-incubator. Tik na de incubatie op de kolf om te controleren of JIMT-1-cellen zijn losgekomen. Stop de spijsvertering met twee milliliter JIMT-1-media en verzamel de celsuspensie in een buis van 15 milliliter.

Tel vervolgens de JIMT-1-cellen met trypanblauw in een blauwe gietkamer. Pas het celnummer aan op 133.000 cellen per ml. Zuig het coatingmedium op en voeg vervolgens 75 microliter celsuspensie toe aan elk putje.

Laat de cellen zich hechten tijdens een nachtelijke incubatie bij 37 graden Celsius in een CO2-incubator. Zuig de volgende dag het medium op en voeg 50 microliter vers JIMT-1-medium toe aan de putten en breng de plaat over naar het screeningslaboratorium met hoge doorvoer. De robot wordt gebruikt om de teststoffen over te brengen op de hoog-inhoud screening microplaten.

Met de robotarm grijpt de robot de pintoolunit, die is gekalibreerd om 25 nanoliter over te brengen. Breng in totaal 100 nanoliter teststoffen over van de samengestelde bibliotheekplaat naar de testplaat in vier stappen. Zorg ervoor dat de uiteindelijke concentratie van teststoffen 20 micromolair is.

Was tussen elke stap eerst het pingereedschap in 50% DMSO en vervolgens in 70% ethanol. Incubeer de plaat gedurende een uur in een CO2-incubator bij 37 graden Celsius. Kweek NK-cellen in T25-weefselkweekkolven.

Terwijl de medicamenteuze behandeling van JIMT-1-cellen aan de gang is, verzamelt u de NK-cellen van een T25-kolf naar een centrifugebuis van 15 milliliter. Tel de NK-92 cellen met trypan blauw in een blauwe telkamer. Pas het celnummer aan op 400.000 cellen per ml.

Centrifugeer het volume NK-celsuspensie dat 400.000 cellen per ml bij 150 g bevat gedurende drie minuten bij kamertemperatuur. Bereid het ADCC-medium door 20 microgram per ml anti-HER2-antilichaam trastuzumab toe te voegen aan JIMT-1-medium. Pipetteer 20.000 NK-cellen in 50 microliter ADCC-medium naar de doel-JIMT-1 GFP-cellen.

Het uiteindelijke volume is 100 microliter en de uiteindelijke trastuzumabconcentratie is 10 microgram per ml. Plaats de testplaat in de high-content analyseapparatuur, die een ingebouwde incubator heeft die een 37 graden Celsius is ingesteld. De platen zijn op twee tijdstippen in beeld gebracht.

Ten eerste verkrijgen we beelden onmiddellijk na de toevoeging van de effectorcellen aan de doelcellen en de tweede reeks afbeeldingen wordt genomen op drie uur na de toevoeging van NK-cellen. Selecteer eerst het type microplaat. Gebruik 96-well high-content zeefplaten.

Selecteer deze optie om de focus te selecteren omdat de test wordt uitgevoerd in platen met een objectief van 10x in de niet-confocale modus. Kies voor binning twee om de signaal-ruisverhouding te verdubbelen. Selecteer de juiste kanalen, belichtingstijd, laservermogen, scherpstelvlak en golflengte.

Neem de brightfield-beelden op 650-760 nanometer en detecteer de EGFP-getransduceerde JIMT-1-cellen met 488 nanometer excitatie en 500-550 nanometer emissiegolflengte. Voordat u met de meting begint, maakt u voorbeeldafbeeldingen met de snapshotfunctie om de juiste instellingen te controleren. Stel ten slotte het aantal velden en het aantal tijdspunten voor de afbeelding in.

Kies bijvoorbeeld negen velden en twee tijdpunten. Om de ADCC-efficiëntie te analyseren, telt u de levensvatbare JIMT-1-cellen in het ADCC-besturingsputje. Gebruik de module fijne cellen om gebieden op de afbeelding te detecteren die overeenkomen met cellen.

Detecteer elke cel als een gebied op de afbeelding met een hogere fluorescentie-intensiteit dan de omgeving. Selecteer de cellen met behulp van het ingebouwde M-algoritme met 80 micrometer als diameter. Stel de instelling voor de splitsingsgevoeligheid, waarmee een groot object in kleinere objecten wordt verdeeld, in op de waarde 0,5.

Pas de algemene drempel, het laagste pixelintensiteitsniveau, aan op nul. Sluit de detectie van achtergrondgebied met hoge EGFP-fluorescentie-intensiteit in twee stappen uit. Pas eerst de functie intensiteitseigenschappen berekenen toe om de EGFP-fluorescentie-intensiteit in het eerder geselecteerde celgebied te bepalen.

Stel daarna een minimale en maximale intensiteitsdrempel in met behulp van de optie selecte populatie, zodat we het aantal levensvatbare JIMT-1 GFP-doelcellen aan het einde van ADCC krijgen. Bereken de ADCC-efficiëntie door het celnummer dat na drie uur wordt gedetecteerd te delen door het celnummer dat op tijdstip nul wordt gedetecteerd. De praktische toepassing van onze methode willen we graag aantonen met representatieve resultaten.

We hebben een testplaat opgezet met 16 verbindingen die willekeurig uit de schappen zijn gehaald. We hebben ook drie verbindingen opgenomen, colchicine, vincristine en podofyllotoxine met een verwacht ADCC-remmend effect. DMSO werd gebruikt als negatieve controle.

Elk medicijn werd gebruikt in vier herhalingen op de plaat. De figuur toont het resultaat van het testscherm. In de minus NK-groep werd de toxiciteit van de geneesmiddelen op JIMT-1-cellen getest.

In de plus NK-groep werden NK-cellen en trastuzumab toegevoegd, die ongeveer 50% cytotoxiciteit veroorzaakten. Het verwachte ADCC-remmende effect van de drie teststoffen kon met de test worden gedetecteerd. We hebben een co-kweektestsysteem opgezet dat de klinisch relevante interactie tussen borstkankercellen, NK-cellen en het therapeutische monoklonale antilichaam trastuzumab modelleert.

De test is gebaseerd op geautomatiseerde microscopie in combinatie met beeldanalyse en is geschikt voor het screenen van chemische samenstellingsbibliotheken om ADCC-modificerende geneesmiddelen te identificeren. De procedure kan mogelijk worden gebruikt om adjuvante moleculen te identificeren die een antitumorrespons versterken of om chemicaliën met een nadelig effect te identificeren.