Isolatiemethode voor hematopoëtische stamcellen op lange en korte termijn

De hematopoëtische stamcel- of HSC-isolatiemethode op lange en korte termijn zal onderzoekers helpen de celvernieuwingsmechanismen en biologische basis van heterogeniteit in het HSC-compartiment beter te begrijpen. Een transcriptiefactor, Hoxb5, die een exclusieve marker van HSC's op lange termijn kan zijn, werd geïdentificeerd. Op basis hiervan werd een Hoxb5-reporter muizenlijn opgezet en werden de lange termijn en de korte termijn HSC's met succes geïsoleerd.

Om te beginnen met het verzamelen van de donorbeenmergcellen, steriliseer een vijzel en stamper met 70% ethanol en laat ze volledig drogen. Evenwicht die met celkleuringsbuffer bestaande uit calcium- en magnesiumvrije PBS-bevattende supplementen. Doe de botten geïsoleerd van de donormannetje Hoxb5-tri-mCherry-muis in de mortel en voeg drie milliliter van de celkleuringsbuffer toe.

Borstel de botten open met de stamper, splits vervolgens de celklonten door voorzichtig pipetteren en breng de celsuspensie door een celzeef van 100 micron over in een buis van 50 milliliter. Herhaal het proces met een verse celkleuringsbuffer totdat de oplossing helder wordt. Meestal is drie keer herhalen voldoende om een duidelijke oplossing op te leveren.

Na het isoleren van de dijbenen en het scheenbeen van de CD45.1.2 congene muis, knipt u beide uiteinden van de botten met een scherpe steriele schaar. Met behulp van een 23-gauge naald uitgerust met een spuit van vijf milliliter gevuld met ijskoude celsuspensiebuffer, spoelt u het beenmerg uit in een steriele celkweekschaal met celsuspensiebuffer. Splits de celklonten uit elkaar door voorzichtig pipetteren en filter vervolgens de celsuspensie door een celzeef van 40 micron met behulp van een P1000-pipet.

Voor de gating-opstelling bereidt u het monster voor volgens de instructies in de tekst en brengt u 400 microliter ervan over naar een polystyreenreageerbuis met ronde bodem met een 35-micron celzeef snap cap. Bereid het dodecelpersende reagens vóór de analyse voor en voeg het toe aan het monster, volgens de instructies van de fabrikant. Schakel vervolgens de flowcytometer in en start de analysesoftware volgens de instructies van de fabrikant.

Druk vervolgens op Laden om te beginnen met het ophalen van de gegevens. Na het uitsluiten van doubletten, dode cellen en afstammingspositieve cellen, gate de afstammingsnegatieve, de c-kit-positieve, Sca-1-positieve fractie. Sluit vervolgens de Flk2-positieve fractie af.

Gate vervolgens Hoxb5-positieve of Hoxb5-negatieve pHSC's in de CD150-positieve, CD34-negatieve of lage fractie. Bereid vervolgens een 1,5 millimeter eiwitarme bindingsbuis met 600 microliter calcium en magnesiumvrije PBS, aangevuld met 10% warmte-geïnactiveerde FBS. Om de Hoxb5-positieve of Hoxb5-negatieve pHSC-sortering uit te voeren, stelt u de voorbereide 1,5-milliliter eiwitarme bindingsbuis in op een sorteerapparaat en sorteert u de Hoxb5-positieve of Hoxb5-negatieve pHSC's in de buis met behulp van de eerder genoemde gating-strategie.

Gebruik bij de eerste sortering de opbrengst van de sorteerprecisiemodus. Plaats de 96-putplaat met de eerder voorbereide ondersteunende cellen op het stadium van de geautomatiseerde celdepositie-eenheid. Stel vervolgens de 1,5 milliliter eiwitarme bindingsbuis in op de laadpoort van de flowcytometer.

Sorteer de Hoxb5-positieve of Hoxb5-negatieve pHSC's in de 96-putplaat met de ondersteunende cellen met behulp van de eerder genoemde gating-strategie. Sorteer 10 Hoxb5-positieve of Hoxb5-negatieve pHSC's om hun zelfvernieuwingscapaciteiten te testen. De flowcytometrieplots van de beenmerganalyse van de donor Hoxb5-tri-mCherry-muizen onthulden dat ongeveer 20 tot 25% van de cellen in de pHSC-fractie gedefinieerd door afstammingsnegatieve, c-kit-positieve, Sca-1-positieve, CD150-positieve, CD34-negatieve of lage, Flk2-negatieve Hoxb5-positieve pHSC's waren.

Hier worden de representatieve flowcytometrieplots van de perifere bloedanalyse van de ontvangende muizen weergegeven. Verder onthulde de perifere bloedanalyse van de ontvangende muizen na primaire transplantatie dat hoewel Hoxb5-positieve en Hoxb5-negatieve pHSC's vier weken na transplantatie vergelijkbaar donorchimerisme vertoonden, continue hematopoiese werd waargenomen bij alleen de Hoxb5-positieve pHSC-ontvangers. De Hoxb5-negatieve HSC's begonnen acht weken na transplantatie het vermogen te verliezen om hematopoëtische cellen te produceren.

In de secundaire transplantatieanalyse vertoonden alleen de Hoxb5-positieve pHSC-ontvangers een robuuste hematopoiese. Daarentegen werden donorcellen nauwelijks waargenomen in de Hoxb5-negatieve pHSC-ontvangende muizen, wat suggereert dat Hoxb5-negatieve pHSC's het zelfvernieuwingsvermogen verloren binnen 16 weken na primaire transplantatie. Dit protocol duurt meestal negen tot 12 uur, dus het is belangrijk om het monster zoveel mogelijk op vier graden Celsius te houden tijdens de procedures om de levensvatbaarheid van de cel te behouden.