Name: Isolatiemethode voor hematopoëtische stamcellen op lange en korte termijn (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: Leer een isolatiemethode voor hematopoëtische stamcellen op lange en korte termijn met behulp van een Hoxb5-reportersysteem. Dit protocol verbetert het begrip van celvernieuwingsmechanismen en stamcelheterogeniteit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We zijn Hiroshi Kiyonari dankbaar voor de dierenverzorging en voor het leveren van ontvangende muizen bij RIKEN BDR, evenals Hitomi Oga, Kayoko Nagasaka en Masaki Miyahashi voor laboratoriumbeheer aan de Universiteit van Kobe. De auteurs waarderen ook de voortdurende steun voor dit werk enorm. Masanori Miyanishi werd ondersteund door de Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) KAKENHI Grant Numbers JP17K07407 en JP20H03268, The Mochida Memorial Foundation for Medical and Pharmaceutical Research, The Life Science Foundation of Japan, The Takeda Science Foundation, The Astellas Foundation for Research on Metabolic Disorders en AMED-PRIME, AMED onder Grant Number JP18gm6110020. Taro Sakamaki wordt ondersteund door JSPS KAKENHI Grant Numbers JP21K20669 en JP22K16334 en werd ondersteund door het JSPS Core-to-Core Program en RIKEN Junior Research Associate Program. Katsuyuki Nishi werd ondersteund door JSPS Grant Number KAKENHI JP18J13408.

Alle beschreven dierproeven zijn goedgekeurd door het RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research.
1. Voorconditionering van de ontvangende muizen
<ol><li>Bereid mannelijke C57BL / 6 congene muizen van 8-10 weken oud voor als ontvangende muizen. Het aantal ontvangende muizen is afhankelijk van het experimentele protocol. We bereiden meestal 10-20 muizen voor elke aandoening.<ol><li>Voed de muizen met gesteriliseerd water aangevuld met enrofloxacine (170 mg / L). Aangezien bestraalde ontvangende muizen zeer vatbaar zijn voor infecties, moet u de kooien zo schoon mogelijk houden. OPMERKING: Suppletie met antibiotica begint 24 uur voorafgaand aan de bestraling en gaat door tot 3 weken na transplantatie om infecties te voorkomen.</li>
	</ol></li>
	<li>Totale lichaamsbestraling<ol><li>Totale lichaamsbestraling vernietigt de ontvangende beenmergcellen om de transplantatie van de donorcellen te garanderen. Breng de ontvangende muizen over in een bestralingskooi. Lethally bestralen van de ontvangende muizen met een enkele dosis van 8,7 Gy op 12-16 uur vóór transplantatie. OPMERKING: De stralingsdosis en -tijd kunnen variëren, afhankelijk van de apparatuur. De dodelijke stralingsdosis moet worden bevestigd met de bestralings- en muizenstam van de onderzoeker.</li>
		<li>Breng ze terug naar hun kooien na de totale lichaamsbestraling.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Verzameling van de beenmergcellen van de donor
<ol><li>Bereid een mannelijke Hoxb5-tri-mCherry-muis van 12 weken oud voor en euthanaseer de muis door CO2-blootstelling gevolgd door cervicale dislocatie of met behulp van methoden die zijn goedgekeurd door de lokale ethische commissie voor dieren. OPMERKING: Het reagensvolume per muis wordt in de volgende stappen beschreven.</li>
	<li>Verwijder onder steriele omstandigheden de huid en stel de botten bloot (dijbeen, scheenbeen, bekken, opperarmbeen). Snijd de belangrijkste spieren en neem de botten (dijbeen, scheenbeen, bekken, opperarmbeen) van de muis. Leg ze in steriele celkweekschaaltjes met Ca 2+- en Mg2+-vrije, ijskoude PBS.</li>
	<li>Knip de spieren en vezelige weefsels van de botten met een pincet, een kleine schaar en doekjes om besmetting te voorkomen. Pas op dat u de botten tijdens deze stap niet breekt. Gooi gebroken botten weg om de steriliteit te behouden.</li>
	<li>Steriliseer een vijzel en stamper met 70% ethanol (EtOH) en laat ze volledig drogen. Evenwicht met celkleuringsbuffer (Ca 2+- en Mg2+-vrije PBS aangevuld met 2% warmte-geïnactiveerde FBS, 2 mM EDTA, 100 U/ml penicilline en 100 μg/ml streptomycine).</li>
	<li>Doe de botten in de mortel en voeg 3 ml celkleuringsbuffer toe. Plet de botten open met de stamper. Splits de celklonters door voorzichtig pipetteren en breng de celsuspensie door een celzeef van 100 μm over in een buis van 50 ml.</li>
	<li>Herhaal stap 2.5 totdat de oplossing duidelijk wordt. Meestal is drie keer voldoende.</li>
</ol>3. Scheiding van de c-kit+ cellen door magnetische sortering
<ol><li>Antilichaamkleuring voor magnetische sortering<ol><li>Centrifugeer de monsters gedurende 5 minuten bij 400 x g en 4 °C. Zuig het supernatant op en resuspensie de pellet in 1 ml celkleuringsbuffer. Voeg 10 μL rat-IgG (5 mg/ml) toe om de niet-specifieke antilichaambinding te verminderen en pipetteer voorzichtig op en neer met een P1.000-pipet. Incubeer op ijs gedurende 15 min.</li>
		<li>Voeg het c-Kit-antilichaam (kloon 2B8) toe in een concentratie van 4 μg/ml en meng met een P1.000-pipet. Incubeer op ijs gedurende 15 min.</li>
		<li>Voeg 5 ml celkleuringsbuffer toe en meng goed. Centrifugeer de monsters bij 400 x g, 4 °C, 5 min. Zuig het supernatant op en resuspensie de pellet in 500 μL celkleuringsbuffer.</li>
		<li>Voeg 35 μL anti-APC microbeads toe om de c-Kit+ cellen te verrijken en meng met een P1.000 pipet. Incubeer op ijs gedurende 15 min.</li>
		<li>Voeg 4-5 ml celkleuringsbuffer toe. Centrifugeer de monsters gedurende 5 minuten bij 400 x g en 4 °C. Zuig het supernatant op en resuspensie de pellet in 1 ml celkleuringsbuffer.</li>
	</ol></li>
	<li>De c-Kit+ cellen magnetisch sorteren<ol><li>Volg de instructies van de fabrikant om de cellen te sorteren. Kortom, prime een magnetische sorteerkolom met 3 ml celkleuringsbuffer. Filter het monster (1 ml) door een celzeef van 40 μm en laad het monster op de magnetische sorteerkolom.</li>
		<li>Was door drie keer 3 ml celkleuringsbuffer toe te voegen. Voeg de celkleuringsbuffer alleen toe als het kolomreservoir leeg is.</li>
		<li>Plaats de magnetische sorteerkolom bovenop een ijskoude buis van 15 ml en voeg 5 ml celkleuringsbuffer toe. Spoel de cellen weg door de zuiger stevig in de kolom te duwen. Houd de doorstroming op ijs. OPMERKING: In geval van accidenteel monsterverlies houden we de doorstroming tot het einde van het experiment.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Hematopoëtische stamcelkleuring
<ol><li>Centrifugeer het in stap 3.2.3 bereide monster gedurende 5 minuten bij 400 x g en 4 °C. Zuig het supernatant op.</li>
	<li>Voeg het CD34-antilichaam (kloon RAM34) in een concentratie van 50 μg/ml toe aan de pellet en incubeer gedurende 60 minuten op ijs. OPMERKING: Voorbereiding van de ondersteunende cellen tijdens het eerste uur van incubatie met CD34 wordt aanbevolen om de verwerkingstijd te verkorten.</li>
	<li>Bereid de antilichaammastermix volgens tabel 1. Voeg 100 μL van het hoofdmengsel toe aan het monster en incubeer gedurende 30 minuten op ijs. Het antilichaam voor het CD34-antigeen (kloon; RAM34) heeft 90 minuten nodig voor voldoende kleuring.</li>
	<li>Voeg 4-5 ml celkleuringsbuffer toe. Centrifugeer het monster gedurende 5 minuten bij 400 x g en 4 °C. Zuig het supernatant op. Voeg streptavidin-BUV737 in een concentratie van 3 μg/ml toe aan de pellet en incubeer gedurende 30 minuten op ijs.</li>
	<li>Voeg 4-5 ml celkleuringsbuffer toe. Centrifugeer het monster gedurende 5 minuten bij 400 x g en 4 °C. Zuig het supernatant op en resuspensie de pellet in 400 μL celkleuringsbuffer. Bewaar het monster op ijs.</li>
</ol>5. Ondersteuning van celvoorbereiding
<ol><li>Bereid een CD45.1+ CD45.2+ congene muis van 12 weken oud; Idealiter zou dit dezelfde leeftijd moeten hebben als de donormuis. Euthanaseer de muis door CO2-blootstelling gevolgd door cervicale dislocatie of met behulp van methoden die zijn goedgekeurd door de lokale ethische commissie voor dieren. OPMERKING: In het gegeven voorbeeld werden CD45.1+ CD45.2+ congene muizen in eigen huis gefokt door B6 te kruisen. CD45.1 congene muizen met C57BL/6J muizen16.</li>
	<li>Neem onder steriele omstandigheden zowel dijbenen als scheenbeen en plaats ze in steriele celkweekschalen met Ca 2+- en Mg2+-vrije, ijskoude PBS. Knip de spieren en vezelige weefsels van de botten met een pincet en een kleine schaar.</li>
	<li>Knip beide uiteinden van de botten met een scherpe, steriele schaar. Gebruik een naald van 23 G en een spuit van 5 ml gevuld met ijskoude celsuspensiebuffer (Ca 2+- en Mg2+-vrije PBS aangevuld met 2% warmte-geïnactiveerde FBS, 100 U/ml penicilline en 100 μg/ml streptomycine) om het beenmerg uit te spoelen in een steriele celkweekschaal met celsuspensiebuffer. Splits de celklonten uit elkaar door voorzichtig pipetteren.</li>
	<li>Filter de celsuspensie door een celzeef van 40 μm met behulp van een P1.000-pipet. Tel het celnummer van de celsuspensie met behulp van een hemocytometer en bereid een beenmergcelsuspensie met 1 x 106 cellen/ml.</li>
	<li>Breng 200 μL van de beenmergcelsuspensie (2 x 105 cellen) over op een 96-well, ronde bodemplaat. Op ijs bewaren tot gebruik. OPMERKING: Platen met ronde bodem worden aanbevolen voor eenvoudige celverzameling.</li>
</ol>6. Hoxb5pos of Hoxb5neg pHSC sortering
<ol><li>Gating instellen<ol><li>Breng 400 μL van het in stap 4.5 bereide monster over in een polystyreenreageerbuis met ronde bodem met een 35 μm celzeefdop. Bereid dode celkleuringsreagens voor en voeg het vóór de analyse toe aan het monster volgens de instructies van de fabrikant.</li>
		<li>Schakel een flowcytometer in en start de analysesoftware volgens de instructies van de fabrikant. Druk vervolgens op Laden en haal de gegevens op. OPMERKING: Een flowcytometer uitgerust met vijf lasers en een mondstuk van 70 μm wordt aanbevolen om de zuiverheid van de gesorteerde cellen te verbeteren.</li>
		<li>Na het uitsluiten van doubletten, dode cellen en afstammingspositieve cellen, gaat u naar de Lineage-c-Kit+Sca-1+ fractie. Sluit vervolgens de Flk2+ fractie af. Vervolgens gate Hoxb5pos of Hoxb5neg pHSCs in de CD150+CD34−/lage fractie (Figuur 2). Voer compensatie uit voor de spectrale overlap in het eerste experiment. OPMERKING: Hoxb5-positieve cellen vertegenwoordigen naar verwachting 20% -25% van de Lineage-c-Kit + Sca-1 + CD150 + CD34 − / lageFlk2-fractie.</li>
	</ol></li>
	<li>Hoxb5pos of Hoxb5neg pHSC sortering<ol><li>Bereid een 1,5 ml eiwitarme bindingsbuis met 600 μL Ca 2+- en Mg2+ -vrije PBS aangevuld met 10% warmte-geïnactiveerde FBS.</li>
		<li>Stel de 1,5 ml lage eiwitbindingsbuis in op een sorteerapparaat en sorteer de Hoxb5pos of Hoxb5neg pHSCs in de buis van 1,5 ml met behulp van de gatingstrategie die is ingesteld in stap 6.1.3. Gebruik bij de eerste sortering de opbrengst van de sorteerprecisiemodus.</li>
		<li>Plaats de 96-putplaat met de ondersteunende cellen voorbereid in stap 5.5 op de automatische celdepositie-eenheid (ACDU) -fase. Zet de in stap 6.2.2 bereide 1,5 ml lage eiwitbindingsbuis op de laadpoort van een flowcytometer.</li>
		<li>Sorteer de Hoxb5pos of Hoxb5neg pHSCs in een 96-well plaat met de ondersteunende cellen met behulp van de gating-strategie die is ingesteld in stap 6.1.3. Sorteer 10 Hoxb5pos of Hoxb5neg pHSCs om hun zelfvernieuwingscapaciteiten te testen. OPMERKING: Dubbelsorteren wordt aanbevolen om de zuiverheid te verbeteren. Gebruik bij de tweede sortering zuiverheid als de aanbevolen sorteernauwkeurigheidsmodus.</li>
		<li>Doorgaans worden 500-1.000 Hoxb5pos pHSC's en 1.500-4.000 Hoxb5neg pHSCs geoogst na dubbele sortering. Ga zo snel mogelijk na de HSC-sortering verder met de transplantatieprocedures om de levensvatbaarheid van de cel te verbeteren (idealiter binnen 1-2 uur).</li>
	</ol></li>
</ol>7. Transplantatie
<ol><li>Plaats de in stap 6.2.4 voorbereide HSC-gesorteerde plaat met 96 putten op ijs. Behandel de HSC-gesorteerde, 96-well plaat in steriele omstandigheden, idealiter in een celkap.</li>
	<li>Verdoof een ontvangende muis met 2% isofluraan in een gasanesthesie-inductiekamer. Zodra het dier volledig is verdoofd, verwijdert u het en plaatst u het op zijn zij. Om voldoende anesthesie te garanderen, bevestigt u geen beweging als reactie op een schadelijke stimulus.</li>
	<li>Na de bevestiging van de juiste anesthesie, voer zo snel mogelijk een retro-orbitale injectie uit om te voorkomen dat de muis weer bij bewustzijn komt. De retro-orbitale injectie duurt minder dan 30 s. OPMERKING: Omdat de injectietijd kort is, voltooien we de procedure zonder oogzalf in de ogen aan te brengen. Als de procedure echter langer duurt, raden we het gebruik van oogzalf aan.</li>
	<li>Pipetteer de cellen voorzichtig in de HSC-gesorteerde 96-well plaat om ze te mengen. Verzamel de donorcellen in de sorteerplaat met behulp van een insulinespuit van 30 G en injecteer ze in de retroorbitale veneuze plexus van de ontvangende muizen. Het aanbevolen injecteerbare volume is ≤200 μL.</li>
	<li>Observeer totdat de muizen bij bewustzijn zijn en zich verplaatsen in een schone kooi. Breng ze terug naar hun kooien nadat ze hun herstel hebben bevestigd.</li>
</ol>8. Perifere bloedanalyse
<ol><li>Verzamel 50 μL perifeer bloed uit de staartader en resuspensie met 100 μL Ca 2+- en Mg2+-vrije PBS met 2 mM EDTA. Breng alle monsters over op een plaat met 96 putten. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 400 x g en 4 °C en gooi het supernatant weg.</li>
	<li>Voeg 200 μL rode bloedcellysisbuffer toe en incubeer gedurende 3 minuten op ijs. Centrifugeer de monsters gedurende 5 minuten bij 400 x g en 4 °C en gooi het supernatant weg. Herhaal dit nog een keer.</li>
	<li>Voeg 200 μL celkleuringsbuffer toe. Centrifugeer de monsters gedurende 5 minuten bij 400 x g en 4 °C en gooi het supernatant weg.</li>
	<li>Bereid antilichaammastermix volgens tabel 2. Voeg 50 μL antilichaammastermix toe en incubeer gedurende 30 minuten op ijs.</li>
	<li>Voeg 150 μL celkleuringsbuffer toe. Centrifugeer de monsters gedurende 5 minuten bij 400 x g en 4 °C en gooi het supernatant weg.</li>
	<li>Voeg 200 μL celkleuringsbuffer toe. Centrifugeer de monsters gedurende 5 minuten bij 400 x g en 4 °C en gooi het supernatant weg. Resuspendeer in 200 μL celkleuringsbuffer en voeg dode celkleuringsreagens toe vóór de analyse volgens de instructies van de fabrikant.</li>
	<li>Analyseer perifeer bloed chimerisme met behulp van een flowcytometer zoals eerder beschreven16. Verzamel bloed na 4 weken, 8 weken, 12 weken en 16 weken na transplantatie om multi-lineage reconstitutie te volgen. Representatieve flowcytometrieplots zijn weergegeven in figuur 3.</li>
</ol>

<ol><li>Weissman, I. L., Shizuru, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origins+of+the+identification+and+isolation+of+hematopoietic+stem+cells%2C+and+their+capability+to+induce+donor-specific+transplantation+tolerance+and+treat+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The origins of the identification and isolation of hematopoietic stem cells, and their capability to induce donor-specific transplantation tolerance and treat autoimmune diseases.</a> Blood. 112 (9), 3543-3553 (2008).</li>
<li>Majeti, R., Park, C. Y., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+hierarchy+of+multipotent+hematopoietic+progenitors+in+human+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of a hierarchy of multipotent hematopoietic progenitors in human cord blood.</a> Cell Stem Cell. 1 (6), 635-645 (2007).</li>
<li>Spangrude, G. J., Heimfeld, S., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+mouse+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of mouse hematopoietic stem cells.</a> Science. 241 (4861), 58-62 (1988).</li>
<li>Ogawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+function+of+c-kit+in+hemopoietic+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Expression and function of c-kit in hemopoietic progenitor cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 174 (1), 63-71 (1991).</li>
<li>Ikuta, K., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+hematopoietic+stem+cells+express+mouse+c-kit+but+do+not+depend+on+steel+factor+for+their+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Evidence that hematopoietic stem cells express mouse c-kit but do not depend on steel factor for their generation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (4), 1502-1506 (1992).</li>
<li>Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+lymphohematopoietic+reconstitution+by+a+single+CD34-low%2Fnegative+hematopoietic+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell.</a> Science. 273 (5272), 242-245 (1996).</li>
<li>Christensen, J. L., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flk-2+is+a+marker+in+hematopoietic+stem+cell+differentiation%3A+A+simple+method+to+isolate+long-term+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Flk-2 is a marker in hematopoietic stem cell differentiation: A simple method to isolate long-term stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (25), 14541-14546 (2001).</li>
<li>Kiel, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLAM+family+receptors+distinguish+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+and+reveal+endothelial+niches+for+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells.</a> Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).</li>
<li>Morrison, S. J., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+long-term+repopulating+subset+of+hematopoietic+stem+cells+is+deterministic+and+isolatable+by+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The long-term repopulating subset of hematopoietic stem cells is deterministic and isolatable by phenotype.</a> Immunity. 1 (8), 661-673 (1994).</li>
<li>Spangrude, G. J., Brooks, D. M., Tumas, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+repopulation+of+irradiated+mice+with+limiting+numbers+of+purified+hematopoietic+stem+cells%3A+In+vivo+expansion+of+stem+cell+phenotype+but+not+function%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Long-term repopulation of irradiated mice with limiting numbers of purified hematopoietic stem cells: In vivo expansion of stem cell phenotype but not function.</a> Blood. 85 (4), 1006-1016 (1995).</li>
<li>Dykstra, B., Olthof, S., Schreuder, J., Ritsema, M., de Haan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+analysis+reveals+multiple+functional+defects+of+aged+murine+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Clonal analysis reveals multiple functional defects of aged murine hematopoietic stem cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 208 (13), 2691-2703 (2011).</li>
<li>Grover, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+reveals+molecular+and+functional+platelet+bias+of+aged+haematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing reveals molecular and functional platelet bias of aged haematopoietic stem cells.</a> Nature Communications. 7, 11075(2016).</li>
<li>Kataoka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evi1+is+essential+for+hematopoietic+stem+cell+self-renewal%2C+and+its+expression+marks+hematopoietic+cells+with+long-term+multilineage+repopulating+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Evi1 is essential for hematopoietic stem cell self-renewal, and its expression marks hematopoietic cells with long-term multilineage repopulating activity.</a> Journal of Experimental Medicine. 208 (12), 2403-2416 (2011).</li>
<li>Gazit, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fgd5+identifies+hematopoietic+stem+cells+in+the+murine+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Fgd5 identifies hematopoietic stem cells in the murine bone marrow.</a> Journal of Experimental Medicine. 211 (7), 1315-1331 (2014).</li>
<li>Acar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+imaging+of+bone+marrow+shows+non-dividing+stem+cells+are+mainly+perisinusoidal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Deep imaging of bone marrow shows non-dividing stem cells are mainly perisinusoidal.</a> Nature. 526 (7571), 126-130 (2015).</li>
<li>Chen, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hoxb5+marks+long-term+haematopoietic+stem+cells+and+reveals+a+homogenous+perivascular+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hoxb5 marks long-term haematopoietic stem cells and reveals a homogenous perivascular niche.</a> Nature. 530 (7589), 223-227 (2016).</li>
<li>Ema, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+self-renewal+capacity+in+single+hematopoietic+stem+cells+from+normal+and+Lnk-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Quantification of self-renewal capacity in single hematopoietic stem cells from normal and Lnk-deficient mice.</a> Developmental Cell. 8 (6), 907-914 (2005).</li>
<li>Morita, Y., Ema, H., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+and+hierarchy+within+the+most+primitive+hematopoietic+stem+cell+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity and hierarchy within the most primitive hematopoietic stem cell compartment.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (6), 1173-1182 (2010).</li>
<li>Yamamoto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+analysis+unveils+self-renewing+lineage-restricted+progenitors+generated+directly+from+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Clonal analysis unveils self-renewing lineage-restricted progenitors generated directly from hematopoietic stem cells.</a> Cell. 154 (5), 1112-1126 (2013).</li>
<li>Fathman, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upregulation+of+CD11A+on+hematopoietic+stem+cells+denotes+the+loss+of+long-term+reconstitution+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Upregulation of CD11A on hematopoietic stem cells denotes the loss of long-term reconstitution potential.</a> Stem Cell Reports. 3 (5), 707-715 (2014).</li>
<li>Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLAM+family+markers+resolve+functionally+distinct+subpopulations+of+hematopoietic+stem+cells+and+multipotent+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors.</a> Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).</li>
<li>Haas, S., Trumpp, A., Milsom, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causes+and+consequences+of+hematopoietic+stem+cell+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Causes and consequences of hematopoietic stem cell heterogeneity.</a> Cell Stem Cell. 22 (5), 627-638 (2018).</li>
<li>Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+heterogeneity%3A+Subtypes%2C+not+unpredictable+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell heterogeneity: Subtypes, not unpredictable behavior.</a> Cell Stem Cell. 6 (3), 203-207 (2010).</li>
<li>Muller-Sieburg, C. E., Sieburg, H. B., Bernitz, J. M., Cattarossi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+heterogeneity%3A+Implications+for+aging+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Stem cell heterogeneity: Implications for aging and regenerative medicine.</a> Blood. 119 (17), 3900-3907 (2012).</li>
<li>Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+bone+marrow+transplantation+%28BMT%29%3A+Providing+optimal+veterinary+and+husbandry+care+to+irradiated+mice+in+BMT+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Principles of bone marrow transplantation (BMT): Providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48 (1), 11-22 (2009).</li>
<li>Nishi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+minimum+requirements+for+successful+haematopoietic+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">Identification of the minimum requirements for successful haematopoietic stem cell transplantation.</a> British Journal of Haematology. 196 (3), 711-723 (2022).</li>
<li>Sakamaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hoxb5+defines+the+heterogeneity+of+self-renewal+capacity+in+the+hematopoietic+stem+cell+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Hoxb5 defines the heterogeneity of self-renewal capacity in the hematopoietic stem cell compartment.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 539, 34-41 (2021).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflicten in verband met deze studie.

Traditioneel zijn celoppervlakmarker-gedefinieerde HSC's voorbereid om de functies van HSC's te bestuderen, zoals zelfvernieuwingscapaciteit en multi-potentie 19,20,21. De immunofenotypisch gedefinieerde (Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−) HSC-fractie bevat echter twee discrete HSC-populaties: LT-HSCs en ST-HSCs 9,10</...

Hematopoietische stamcellen (HSC's), die zelfvernieuwingsvermogen en multipotentie bezitten, bevinden zich aan de top van de hematopoietische hiërarchie 1,2. In 1988 toonden Weissman en collega's voor het eerst aan dat de isolatie van HSC's van muizen kon worden bereikt met behulp van flowcytometrie3. Vervolgens werd gemeld dat een fractie gedefinieerd door een combinatie van celoppervlakmarkers, Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−, alle HSC's in muizen 4,5,6,7,8 bevatte.
Immunofenotypisch gedefinieerde (Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−) HSC's (hierna pHSC's) werden voorheen als functioneel homogeen beschouwd. Recente eencellige analyses hebben echter aangetoond dat pHSC's nog steeds heterogeniteit vertonen met betrekking tot hun zelfvernieuwingscapaciteit9,10 en multipotentie11,12. In het bijzonder lijken er twee populaties te bestaan in de pHSC-fractie met betrekking tot hun zelfvernieuwingscapaciteit: hematopoëtische stamcellen op lange termijn (LT-HSC's), die een continu zelfvernieuwingsvermogen hebben, en kortdurende hematopoëtische stamcellen (ST-HSC's), die een tijdelijk zelfvernieuwingsvermogen hebben 9,10.
Tot op heden blijven de moleculaire mechanismen van zelfvernieuwingscapaciteit die LT-HSC's en ST-HSC's onderscheiden slecht begrepen. Het is cruciaal om beide celpopulaties te isoleren op basis van hun zelfvernieuwingscapaciteiten en om onderliggende moleculaire mechanismen te ontdekken. Er zijn ook verschillende reportersystemen geïntroduceerd om LT-HSC's13,14,15 te zuiveren; de LT-HSC-zuiverheid die door elk reportersysteem wordt gedefinieerd, is echter variabel en exclusieve LT-HSC-zuivering is tot op heden niet bereikt.
Daarom zal de ontwikkeling van een isolatiesysteem voor LT-HSC's en ST-HSC's het onderzoek naar zelfvernieuwingscapaciteit in de pHSC-fractie versnellen. In de isolatie van LT-HSC's en ST-HSC's identificeerde een studie met behulp van meerstaps, onbevooroordeelde screening een enkel gen, Hoxb5, dat heterogeen tot expressie komt in de pHSC-fractie16. Bovendien bleek uit beenmerganalyse van de Hoxb5-reportermuizen dat ongeveer 20% -25% van de pHSC-fractie bestaat uit Hoxb5-pos-cellen. Een competitieve transplantatietest met Hoxb5pos pHSCs en Hoxb5 neg pHSCs toonde aan dat alleen Hoxb5pos pHSCs over zelfvernieuwingscapaciteit op lange termijn beschikken, terwijl Hoxb5neg pHSCs hun zelfvernieuwingscapaciteit binnen een korte periode verliezen, wat aangeeft dat Hoxb5 LT-HSC's identificeert in de pHSC-fractie16. 
Hier demonstreren we een stapsgewijs protocol om LT-HSC's en ST-HSC's te isoleren met behulp van het Hoxb5-reportersysteem . Daarnaast presenteren we een competitieve transplantatietest om de zelfvernieuwingscapaciteit van Hoxb5pos/neg pHSCs te beoordelen (figuur 1). Dit Hoxb5 reporter systeem stelt ons in staat om LT-HSC's en ST-HSCs prospectief te isoleren en draagt bij aan het begrip van LT-HSC-specifieke kenmerken.

<table><tbody><tr><td>0.2 mL Strip of 8 Tubes, Dome Cap</td><td>SSIbio</td><td>3230-00</td><td></td></tr><tr><td>0.5M EDTA pH 8.0</td><td>Iinvtrogen</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>100 &micro;m Cell Strainer</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>30G insulin syringe</td><td>BD</td><td>326668</td><td></td></tr><tr><td>40 &micro;m Cell Strainer</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap</td><td>FALCON</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD Viability Staining Solution</td><td>BioLegend</td><td>420404</td><td></td></tr><tr><td>96 well U-Bottom</td><td>FALCON</td><td>351177</td><td></td></tr><tr><td>Anti-APC-MicroBeads</td><td>Milteny biotec</td><td>130-090-855</td><td></td></tr><tr><td>Aspirator with trap flask</td><td>Biosan</td><td>FTA-1</td><td></td></tr><tr><td>B220-Alexa Fluor 700 (RA3-6B2)</td><td>BioLegend</td><td>103232</td><td></td></tr><tr><td>B220-Biotin (RA3-6B2)</td><td>BioLegend</td><td>103204</td><td></td></tr><tr><td>B220-BV786 (RA3-6B2)</td><td>BD Biosciences</td><td>563894</td><td></td></tr><tr><td>B6.CD45.1 congenic mice&nbsp;</td><td>Sankyo Labo Service</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Baytril 10%</td><td>BAYER</td><td>341106546</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS Aria II special order system&nbsp;</td><td>BD</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant stain buffer</td><td>BD</td><td>566349</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-Alexa Fluor 700 (M1/70)</td><td>BioLegend</td><td>101222</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-Biotin (M1/70)</td><td>BioLegend</td><td>101204</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-BUV395 (M1/70)</td><td>BD Biosciences</td><td>563553</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-BV711 (M1/70)</td><td>BD Biosciences</td><td>563168</td><td></td></tr><tr><td>CD127-Alexa Fluor 700 (A7R34)</td><td>Invitrogen</td><td>56-1271-82</td><td></td></tr><tr><td>CD150-BV421 (TC15-12F12.2)</td><td>BioLegend</td><td>115943</td><td></td></tr><tr><td>CD16/CD32-Alexa Fluor 700 (93)</td><td>Invitrogen</td><td>56-0161-82</td><td></td></tr><tr><td>CD34-Alexa Fluor 647 (RAM34)</td><td>BD Biosciences</td><td>560230</td><td></td></tr><tr><td>CD34-FITC (RAM34)</td><td>Invitrogen</td><td>11034185</td><td></td></tr><tr><td>CD3-Alexa Fluor 700 (17A2)</td><td>BioLegend</td><td>100216</td><td></td></tr><tr><td>CD3&epsilon; -Biotin (145-2C11)</td><td>BioLegend</td><td>100304</td><td></td></tr><tr><td>CD3&epsilon; -BV421 (145-2C11)</td><td>BioLegend</td><td>100341</td><td></td></tr><tr><td>CD45.1/CD45.2 congenic mice</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Gekweekt in ons laboratorium</td></tr><tr><td>CD45.1-FITC (A20)</td><td>BD Biosciences</td><td>553775</td><td></td></tr><tr><td>CD45.2-PE (104)</td><td>BD Biosciences</td><td>560695</td><td></td></tr><tr><td>CD4-Alexa Fluor 700 (GK1.5)</td><td>BioLegend</td><td>100430</td><td></td></tr><tr><td>CD4-Biotin (GK1.5)</td><td>BioLegend</td><td>100404</td><td></td></tr><tr><td>CD8a-Alexa Fluor 700 (53-6.7)</td><td>BioLegend</td><td>100730</td><td></td></tr><tr><td>CD8a-Biotin (53-6.7)</td><td>BioLegend</td><td>100704</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge Tube 15ml</td><td>NICHIRYO</td><td>00-ETS-CT-15</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge Tube 50ml</td><td>NICHIRYO</td><td>00-ETS-CT-50</td><td></td></tr><tr><td>c-Kit-APC-eFluor780 (2B8)</td><td>Invitrogen</td><td>47117182</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (-) without Ca and Mg, liquid&nbsp;</td><td>Nacalai</td><td>14249-24</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Thermo Fisher</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Flk2-PerCP-eFluor710 (A2F10)</td><td>eBioscience</td><td>46135182</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo version 10</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td>https://www.flowjo.com/solutions/flowjo</td><td></td></tr><tr><td>Gmmacell 40 Exactor</td><td>Best theratronics</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Gr-1-Alexa Fluor 700 (RB6-8C5)</td><td>BioLegend</td><td>108422</td><td></td></tr><tr><td>Gr-1-Biotin (RB6-8C5)</td><td>BioLegend</td><td>108404</td><td></td></tr><tr><td>Hoxb5-tri-mCherry mice (C57BL/6J background)&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Gekweekt in ons laboratorium</td></tr><tr><td>IgG from rat serum, technical grade, >=80% (SDS-PAGE), buffered aqueous solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8015-100MG</td><td></td></tr><tr><td>isoflurane</td><td>Pfizer</td><td>4987-114-13340-3&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes S200</td><td>NIPPON PAPER CRECIA&nbsp;</td><td>6-6689-01</td><td></td></tr><tr><td>LS Columns</td><td>Milteny biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Lysis buffer&nbsp;</td><td>BD</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>MACS&nbsp; MultiStand</td><td>Milteny biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Microplate for Tissue Culture (For Adhesion Cell) 6Well</td><td>IWAKI</td><td>3810-006</td><td></td></tr><tr><td>MidiMACS Separator</td><td>Milteny biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Pie Cages</td><td>Natsume Seisakusho</td><td>KN-331</td><td></td></tr><tr><td>Multipurpose refrigerated Centrifuge</td><td>TOMY</td><td>EX-125</td><td></td></tr><tr><td>NARCOBIT-E (II)</td><td>Natsume Seisakusho</td><td>KN-1071-I</td><td></td></tr><tr><td>NK-1.1-PerCP-Cy5.5 (PK136)</td><td>BioLegend</td><td>108728</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin Mixed Solution</td><td>nacalai</td><td>26253-84</td><td></td></tr><tr><td>Porcelain Mortar &phi;120mm with Pestle</td><td>Asone</td><td>6-549-03</td><td></td></tr><tr><td>Protein LoBind Tube 1.5 mL&

isolatiemethode voor hematopoëtische stamcellen op lange en korte termijn

Isolation Method for Long-Term and Short-Term Hematopoietic Stem Cells

Zelfvernieuwingscapaciteit en multi-lineage differentiatiepotentiaal worden over het algemeen beschouwd als de bepalende kenmerken van hematopoietische stamcellen (HSC's). Talrijke studies hebben echter gesuggereerd dat functionele heterogeniteit bestaat in het HSC-compartiment. Recente eencellige analyses hebben HSC-klonen gemeld met verschillende celloten binnen het HSC-compartiment, die bevooroordeelde HSC-klonen worden genoemd. De mechanismen die ten grondslag liggen aan heterogene of slecht reproduceerbare resultaten zijn weinig begrepen, vooral met betrekking tot de lengte van zelfvernieuwing wanneer gezuiverde HSC-fracties worden getransplanteerd door conventionele immunostaining. Daarom is het van cruciaal belang om dit probleem op te lossen door een reproduceerbare isolatiemethode vast te stellen voor HSC's op lange termijn (LT-HSC's) en HSC's op korte termijn (ST-HSC's), gedefinieerd door de lengte van hun zelfvernieuwing. Met behulp van onbevooroordeelde meerstapsscreening identificeerden we een transcriptiefactor, Hoxb5, die een exclusieve marker van LT-HSC's in het hematopoietische systeem van de muis kan zijn. Op basis van deze bevinding hebben we een Hoxb5-reportermuislijn opgezet en met succes LT-HSC's en ST-HSC's geïsoleerd. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de isolatie van LT-HSC's en ST-HSC's met behulp van het Hoxb5-reportersysteem . Deze isolatiemethode zal onderzoekers helpen de mechanismen van zelfvernieuwing en de biologische basis voor dergelijke heterogeniteit in het HSC-compartiment beter te begrijpen.

Eerder werd de zelfvernieuwingscapaciteit gemeten met behulp van competitieve transplantatietests, waarbij wordt aangenomen dat donor-HSC's hun zelfvernieuwingscapaciteit alleen behouden als multi-lineage donorcellen in het perifere bloed van de ontvanger worden waargenomen17. Bovendien definiëren verschillende rapporten LT-HSC's als cellen die enkele maanden na de tweede beenmergtransplantatie perifere bloedcellen blijven produceren10,18....

We presenteren een stapsgewijs protocol voor de isolatie van lange termijn hematopoëtische stamcellen (LT-HSCs) en korte termijn HSC's (ST-HSCs) met behulp van het Hoxb5 reporter systeem.

Isolatiemethode voor hematopoëtische stamcellen op lange en korte termijn

Self-renewal capacity and multi-lineage differentiation potential are generally regarded as the defining characteristics of hematopoietic stem cells ...

De hematopoëtische stamcel- of HSC-isolatiemethode op lange en korte termijn zal onderzoekers helpen de celvernieuwingsmechanismen en biologische basis van heterogeniteit in het HSC-compartiment beter te begrijpen. Een transcriptiefactor, Hoxb5, die een exclusieve marker van HSC's op lange termijn kan zijn, werd geïdentificeerd. Op basis hiervan werd een Hoxb5-reporter muizenlijn opgezet en werden de lange termijn en de korte termijn HSC's met succes geïsoleerd.Om te beginnen met het verzamelen van de donorbeenmergcellen, steriliseer een vijzel en stamper met 70% ethanol en laat ze volledig drogen. Evenwicht die met celkleuringsbuffer bestaande uit calcium- en magnesiumvrije PBS-bevattende supplementen. Doe de botten geïsoleerd van de donormannetje Hoxb5-tri-mCherry-muis in de mortel en voeg drie milliliter van de celkleuringsbuffer toe.Borstel de botten open met de stamper, splits vervolgens de celklonten door voorzichtig pipetteren en breng de celsuspensie door een celzeef van 100 micron over in een buis van 50 milliliter. Herhaal het proces met een verse celkleuringsbuffer totdat de oplossing helder wordt. Meestal is drie keer herhalen voldoende om een duidelijke oplossing op te leveren.Na het isoleren van de dijbenen en het scheenbeen van de CD45.1.2 congene muis, knipt u beide uiteinden van de botten met een scherpe steriele schaar. Met behulp van een 23-gauge naald uitgerust met een spuit van vijf milliliter gevuld met ijskoude celsuspensiebuffer, spoelt u het beenmerg uit in een steriele celkweekschaal met celsuspensiebuffer. Splits de celklonten uit elkaar door voorzichtig pipetteren en filter vervolgens de celsuspensie door een celzeef van 40 micron met behulp van een P1000-pipet.Voor de gating-opstelling bereidt u het monster voor volgens de instructies in de tekst en brengt u 400 microliter ervan over naar een polystyreenreageerbuis met ronde bodem met een 35-micron celzeef snap cap. Bereid het dodecelpersende reagens vóór de analyse voor en voeg het toe aan het monster, volgens de instructies van de fabrikant. Schakel vervolgens de flowcytometer in en start de analysesoftware volgens de instructies van de fabrikant.Druk vervolgens op Laden om te beginnen met het ophalen van de gegevens. Na het uitsluiten van doubletten, dode cellen en afstammingspositieve cellen, gate de afstammingsnegatieve, de c-kit-positieve, Sca-1-positieve fractie. Sluit vervolgens de Flk2-positieve fractie af.Gate vervolgens Hoxb5-positieve of Hoxb5-negatieve pHSC's in de CD150-positieve, CD34-negatieve of lage fractie. Bereid vervolgens een 1,5 millimeter eiwitarme bindingsbuis met 600 microliter calcium en magnesiumvrije PBS, aangevuld met 10% warmte-geïnactiveerde FBS. Om de Hoxb5-positieve of Hoxb5-negatieve pHSC-sortering uit te voeren, stelt u de voorbereide 1,5-milliliter eiwitarme bindingsbuis in op een sorteerapparaat en sorteert u de Hoxb5-positieve of Hoxb5-negatieve pHSC's in de buis met behulp van de eerder genoemde gating-strategie.Gebruik bij de eerste sortering de opbrengst van de sorteerprecisiemodus. Plaats de 96-putplaat met de eerder voorbereide ondersteunende cellen op het stadium van de geautomatiseerde celdepositie-eenheid. Stel vervolgens de 1,5 milliliter eiwitarme bindingsbuis in op de laadpoort van de flowcytometer.Sorteer de Hoxb5-positieve of Hoxb5-negatieve pHSC's in de 96-putplaat met de ondersteunende cellen met behulp van de eerder genoemde gating-strategie. Sorteer 10 Hoxb5-positieve of Hoxb5-negatieve pHSC's om hun zelfvernieuwingscapaciteiten te testen. De flowcytometrieplots van de beenmerganalyse van de donor Hoxb5-tri-mCherry-muizen onthulden dat ongeveer 20 tot 25% van de cellen in de pHSC-fractie gedefinieerd door afstammingsnegatieve, c-kit-positieve, Sca-1-positieve, CD150-positieve, CD34-negatieve of lage, Flk2-negatieve Hoxb5-positieve pHSC's waren.Hier worden de representatieve flowcytometrieplots van de perifere bloedanalyse van de ontvangende muizen weergegeven. Verder onthulde de perifere bloedanalyse van de ontvangende muizen na primaire transplantatie dat hoewel Hoxb5-positieve en Hoxb5-negatieve pHSC's vier weken na transplantatie vergelijkbaar donorchimerisme vertoonden, continue hematopoiese werd waargenomen bij alleen de Hoxb5-positieve pHSC-ontvangers. De Hoxb5-negatieve HSC's begonnen acht weken na transplantatie het vermogen te verliezen om hematopoëtische cellen te produceren.In de secundaire transplantatieanalyse vertoonden alleen de Hoxb5-positieve pHSC-ontvangers een robuuste hematopoiese. Daarentegen werden donorcellen nauwelijks waargenomen in de Hoxb5-negatieve pHSC-ontvangende muizen, wat suggereert dat Hoxb5-negatieve pHSC's het zelfvernieuwingsvermogen verloren binnen 16 weken na primaire transplantatie. Dit protocol duurt meestal negen tot 12 uur, dus het is belangrijk om het monster zoveel mogelijk op vier graden Celsius te houden tijdens de procedures om de levensvatbaarheid van de cel te behouden.

isolation-method-for-long-term-and-short-term-hematopoietic-stem-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Isolatie en transplantatie van hematopoietische stamcellen (HSC)

Deze video laat zien hoe de dooierzak en de aorta-gonaden-mesonephros regio micro-ontleden van embryo's en het gebruik flowcytometrie om hematopoietische stamcellen te sorteren.

Isolatie van Vroege hematopoietische stamcellen van muizen dooierzak en AGM

Lentivirale-gemedieerde Knockdown Tijdens het Ex Vivo Erytropoëse van humane hematopoietische stamcellen

Hier beschrijven we de isolatie van CD133 tot expressie lever stamcellen en kanker stamcellen van muizen gehele lever, een proces dat weefsel spijsvertering, cel verrijkingscocktail en flowcytometrie isolatie vereist. Wij omvatten methoden voor geavanceerde single cell isolatie en klonale expansie.

Isolatie van CD133 + lever stamcellen voor klonale expansie

Een methode om de verdeling van beenmerg hematopoietische stamcellen in flowcytometrie en efficiënt isoleren sterk gezuiverde hematopoietische stamcellen (HSC) analyse beschreven. De isolatie procedure is in hoofdzaak gebaseerd op magnetische verrijking van c-Kit + cellen en cel sortering tot HSCs voor cellulaire en moleculaire studies te zuiveren.

Fenotypische analyse en isolatie van Murine hematopoëtische stamcellen en Lineage-geëngageerde voorouders

This video demonstrates a technique for generating human immune system (HIS) mice. CD34+ hematopoietic stem cells (HSCs) are isolated from human cord blood buffy coat cells using antibody-coated magnetic beads. The CD34+ HSCs are expanded in a growth medium enriched with cytokines and cryopreserved. Finally, the thawed HSCs are injected into an immunodeficient mouse pup to establish the HIS mouse model.

Isolating Cord Blood Hematopoietic Stem Cells to Generate Human Immune System Mice

Dit protocol maakt het mogelijk om quiescente menselijke hematopoëtische stamcellen in vitro te behouden door het micromilieu van het beenmerg na te bootsen met behulp van overvloedige vetzuren, cholesterol, lagere concentraties cytokinen en hypoxie.

Een kweekmethode om rustgevende menselijke hematopoëtische stamcellen te behouden

Deze studie heeft een stabiele en efficiënte methode vastgesteld voor de isolatie, kweek en functionele bepaling van CD34+ stamcellen in de vaatwand (CD34+ VW-SC's). Deze gemakkelijk te volgen en tijdbesparende isolatiemethode kan door andere onderzoekers worden gebruikt om de mogelijke mechanismen te bestuderen die betrokken zijn bij hart- en vaatziekten.

Immunomagnetische isolatie van de vaatwand-bewoner CD34+ stamcellen van muizen

Hier presenteren we protocollen die isolatie van stromale cellen uit muizenbot, beenmerg, thymus en menselijk thymusweefsel mogelijk maken die compatibel zijn met single-cell multiomics.

Stromale celisolatie van hematopoëtische organen

We beschrijven een protocol voor het extraheren van hoogwaardige kernen uit gecryopreserveerde geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide stromale/endotheel- en bloedceltypen ter ondersteuning van single-nucleus next-generation sequencing-analyses. Het produceren van hoogwaardige, intacte kernen is noodzakelijk voor multiomics-experimenten, maar kan voor sommige laboratoria een barrière zijn voor toegang tot het veld.

Nucleaire isolatie van gecryopreserveerde in vitro afgeleide bloedcellen

Leer een isolatiemethode voor hematopoëtische stamcellen op lange en korte termijn met behulp van een Hoxb5-reportersysteem. Dit protocol verbetert het begrip van celvernieuwingsmechanismen en stamcelheterogeniteit.

Isolatiemethode voor hematopoëtische stamcellen op lange en korte termijn

Meer video's verkennen