Bepaling van de S-faseduur met behulp van 5-ethynyl-2'-deoxyuridine-opname in Saccharomyces cerevisiae

Dit protocol maakt een nauwkeurige bepaling van de S-faseduur in gesynchroniseerde ontluikende gistcellen mogelijk. Het is een snelle, eenvoudige en reproduceerbare methode. Bovendien is het gevoelig genoeg om milde synthesedefecten te detecteren die onopgemerkt zijn door klassieke protocollen.

Deze methode zal nuttig zijn voor veel onderzoekers die werken aan celcyclusregulatie in ontluikende gist. Dit protocol wordt gedemonstreerd door Nicolas Talarek, een senior onderzoeker, en Juan De Dios Barba Tena, een promovendus in het lab. Ent Saccharomyces cerevisiae cellen in 10 milliliter SC-medium bij een lage celconcentratie voor een nachtkweek bij 30 graden Celsius met orbitale agitatie bij 130 rotaties per minuut.

Verdun de volgende dag de cellen in 20 milliliter vers SC-medium in een eindconcentratie van twee tot drie keer 10 tot de zes cellen per milliliter. Bij 40 microliter van één milligram per milliliter alfafactor verdund in water. Kweek vervolgens de cellen op 30 graden Celsius, met orbitale agitatie met 130 rotaties per minuut gedurende een uur.

Herhaal deze stap eenmaal. Visualiseer de cellen onder een lichtmicroscoop om de G1-arrestatie te controleren. Ga verder als meer dan 90% van de cellen een shmoo vertoont en de andere afgeronde niet-gebutste cellen zijn.

Centrifugeer de monsters gedurende drie minuten op 1.500 G.Gooi het supernatant vervolgens weg met de vacuümpipet en resuspenseer de cellen in 20 milliliter SC-medium. Herhaal deze stap eenmaal. Verzamel twee keer per vijf minuten een milliliter cellen en ga verder met EDU-labeling.

Voeg 400 microliter van de alfafactor 30 minuten na het loslaten toe. Breng een milliliter van de celcultuur over naar een microfugebuis van twee milliliter met één microliter van 10 millimol EDU, goed gemengd door inversie. Om de EDU-positieve cellen te onderscheiden van de EDU-negatieve cellen op een Pi EDU-bivariante feiten, brengt u nog een milliliter celkweek over naar een microfugebuis van twee milliliter die één microliter DMSO bevat.

Incubeer gedurende drie tot vijf minuten bij 30 graden Celsius onder agitatie in een schuddend waterbad. Stop de reactie door 100 microliter 100% ethanol toe te voegen. Pelleteer de cellen gedurende twee minuten op 10.000 G in een microfuge.

Verwijder het supernatant met een vacuümpipet. Resuspendeer de celpellet in 500 microliter 70% ethanol en meng goed door vortexing. Laat de monsters gedurende ten minste één uur bij kamertemperatuur met 20 kantelen per minuut op een rocker met variabele snelheid om de cellen te doordringen.

Pelleteer de cellen gedurende twee minuten op 10.000 G in een microcentrifuge en gooi het supernatant weg met een vacuümpipet. Was de cellen twee keer met 500 microliter 10%ethanol en PBS. Pelleteer de cellen gedurende twee minuten op 10.000 G in een microfuge en gooi het supernatant weg met een vacuümpipet.

Resuspendeer de pellet in 200 microliter PBS met RNase A en Proteinase K.Incubateer van één tot twee uur bij 50 graden Celsius met af en toe schudden, of 's nachts bij 37 graden Celsius. Pelleteer de cellen gedurende twee minuten op 10.000 G in een microcentrifuge en gooi het supernatant weg met een vacuümpipet. Was de cellen met 500 microliter PBS.

Pelleteer vervolgens de cellen en gooi het supernatant weg zoals eerder aangetoond. Resuspendeer de celpellet in 200 microliter PBS met 1%BSA. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.

Pelleteer vervolgens de cellen, gooi het supernatant weg zoals eerder aangetoond en resuspenseer de pellet in 300 microliter PBS met 1% BSA. Verdeel de cellen in twee microcentrifugebuizen van 1,5 milliliter. De eerste moet bestaan uit 200 microliter celkweek voor de Click-reactie en de tweede buis moet 100 microliter celkweek bevatten voor de sytoxgroene kleuring.

Pelleteer vervolgens de cellen en gooi het supernatant weg zoals eerder aangetoond. Voor sytoxgroene kleuring resuspendeert u de celpellet in 100 microliter PBS. Breng vervolgens, afhankelijk van de celconcentratie, 10 tot 30 microliter over naar een flowcytometerbuis met 300 microliter sytoxgroen mengsel.

Soniceer de monsters tweemaal gedurende twee seconden bij een amplitude van 40 tot 50% Laat in het donker totdat de monsters op een flowcytometer worden verwerkt. Voor de Click-reactie resuspendeert u de celpellet met 40 microliter vers bereide Azide-kleurstofbuffer. Incubeer bij kamertemperatuur in het donker gedurende 60 minuten.

Pelleteer de cellen en gooi het supernatant weg zoals eerder aangetoond. Was de cellen vervolgens drie keer met 300 microliter 10% ethanol in PBS. Resuspendeer vervolgens de cellen in 100 microliter van 50 microgram per milliliter propidiumjodide in PBS en laat 10 minuten in het donker staan.

Breng, afhankelijk van de celconcentratie, 10 tot 30 microliter van de celsuspensie over naar een flowcytometerbuis met 300 microliter tris HCl, pH 7,5. Soniceer twee keer gedurende twee seconden bij een amplitude van 40 tot 50. Laat de monsters in het donker totdat ze op een cytometer worden verwerkt.

Lees de sytoxgroene monsters met behulp van een excitatieblauwe laser op 488 nanometer en een 530 bij 30 band pass filter. Lees de Bavaria Pi EDU-monsters op een dot plot met behulp van een excitatieblauwe laser op 488 nanometer en een 615 bij 20-band passfilter voor de Pi X-as, en een rode excitatielaser op 640 nanometer, een 660 bij 20 band pass filter voor de Y-as. Drie populaties van cellen werden waargenomen in de bivariante EDU Pi cytometer analyse.

Bij 25 graden Celsius bevond ongeveer 27% van de celpopulatie zich in de G1-fase, 29% in de S-fase en ongeveer 44% in de G2 plus M-fase. In gesynchroniseerde cellen kan de duur van de S-fase ongeveer 25 minuten zijn op basis van de tijd waarop het DNA-gehalte veranderde van één C naar twee C op het sytox groene flowcytometerprofiel. EDU-pulsetikettering bepaalde nauwkeurig de duur van de S-fase.

15 minuten na de release werd een fractie edu-positieve cellen gedetecteerd, wat het begin van de S-fase aangeeft. De progressie door de S-fase werd gezien door de celwolk die omhoog en rechts bewoog in de Bavaria Pi EDU-grafiek. Ten slotte, op 35 minuten na de release, was een fractie van de cellen EDU-negatief, maar met tweemaal de hoeveelheid DNA die aangeeft dat de S-fase eindigde en de cellen zich in de G2 plus M-fase bevonden.

Ondanks de waargenomen hoge synchronie, voltooiden sommige cellen de S-fase 60 minuten na de release en de S-fase was ongeveer 65 minuten na de release voltooid voor de hele populatie. Het is cruciaal om een perfecte synchronisatie te hebben en te voorkomen dat cellen de tweede S-fase ingaan. Cellen kunnen worden afgebeeld met een microscoop waar nucleaire DNA-replicatie vooruitziende blik kan worden gevolgd en gekwantificeerd.

Deze techniek zal helpen om mutanten te identificeren die milde S-fasedefecten hebben, evenals defecten in de celcyclusduur.