Een verrijkingsmethode voor kleine extracellulaire blaasjes afgeleid van leverkankerweefsel

Deze methode maakt de isolatie mogelijk van leverkankerweefsel afgeleide kleine extracellulaire blaasjes met een zuiverheid die hoger is dan die bereikt door klassieke, differentiële ultracentrifugatie. Deze technologie is eenvoudig, handig en gemakkelijk te bedienen, wat methodologische ondersteuning kan bieden voor de studie van kleine extracellulaire blaasjes. Verwijder om te beginnen het weefselmonster uit de vriezer van 80 graden Celsius.

Plaats ongeveer 400 milligram van het weefsel in een celkweekschaal van 10 centimeter op de ijskist en hak het weefsel fijn met een scalpel. Breng het weefsel over naar een plaat met zes putten met 1,5 milliliter van de spijsverteringsoplossing. Plaats vervolgens de plaat op de transferieontkleuringsschudder en incubeer gedurende 20 minuten bij 37 graden Celsius voor volledige dissociatie van het leverkankerweefsel en afgifte van de kleine extracellulaire blaasjes of sEV's.

Plaats na de incubatie de plaat met zes putten op de ijskist. Voeg 80 microliter fosfataseremmer en 200 microliter complete proteaseremmeroplossing toe om de spijsvertering te stoppen. Breng vervolgens de spijsverteringsoplossing over naar een 70-micrometer celzeef op een centrifugebuis van twee milliliter en filter deze langzaam om grote weefselresten te verwijderen.

Centrifugeer het filtraat gedurende 10 minuten op 500 g om het kleine weefselresten te verwijderen en verzamel het supernatant in een nieuwe centrifugebuis van twee milliliter. Centrifugeer het supernatant op 3.000 g gedurende 20 minuten om het celafval te verwijderen. Breng het supernatant voorzichtig over in een nieuwe centrifugebuis totdat de punt van de pipet op het punt staat het witte vuil aan de onderkant te raken.

Na het herhalen van de centrifugatie van de resterende vloeistof, poolt u het supernatant in de buis zonder het vuil te verstoren. Centrifugeer het verzamelde supernatant op 12.000 g gedurende 20 minuten en breng 900 microliter van het supernatant over in een ultracentrifugebuis van 4,7 millimeter. Herhaal de centrifugatie van de resterende vloeistof en verzamel en meng vervolgens beide supernatanten in dezelfde ultracentrifugebuis.

Vul de tube volledig met PBS. Centrifugeer het supernatant op 100.000 g gedurende 60 minuten. Nadat u het supernatant hebt weggegooid, resuspendeert u de pellet door de ultracentrifugebuis te vullen met PBS.

Na het herhalen van de centrifugatie bij 100.000 g gedurende 60 minuten, resuspensie de pellet met 50 microliter PBS. Zuig de sEV-suspensie op met een steriele spuit van één milliliter en filter deze door een membraanfilter van 0,22 micrometer in een centrifugebuis van 600 microliter. Bewaar het filtraat bij 80 graden Celsius voor verdere analyse.

Gebruik een nanodeeltjesstroomcytometer om de grootteverdeling en zuiverheid van de sEV's te bepalen. Controleer het volume van de reinigingsoplossing. Let vervolgens op het verschil tussen de niveaus van de schede en de afvalvloeistof.

Na 20 seconden de hoofdvoeding van het instrument in te schakelen, schakelt u de computer in. Wacht tot de pieptonen aangeven dat het instrument correct is aangesloten om de software uit te voeren. Klik op Opstarten om de camera, laser en luchtpomp in te schakelen.

Klik vervolgens op Sheath Flow en selecteer Start Up.Plaats ultrapuur water op het laadplatform. Klik na vier minuten op Sample and Boosting en selecteer vervolgens Unload in Sample. Plaats na 30 seconden de lege buis op het laadplatform.

Klik op Voorbeeld, selecteer Boosten en selecteer vervolgens Verwijderen in Voorbeeld. Plaats vervolgens de buis met het ultrazuivere water op het laadplatform. Klik tegelijkertijd op Sample en Boosting, gevolgd door Sheath Flow en Purge.

Klik op Handmatige bediening en plaats de deeltjesconcentratiebuis op het laadplatform. Klik vervolgens op Voorbeeld, selecteer Boosting gedurende één minuut en selecteer tegelijkertijd 250 nanometer Standard Fluorescent Silica Nanospheres kwaliteitscontrole in Sample Information. Selecteer Bemonstering uit monster en schakel de detector in door op SPCM te klikken.

Klik vervolgens op Auto Sampling en voer 1.0 in Sampling Set in om de druk op één kilopascal vast te stellen. Klik op de werkbalk en selecteer Groot signaal. Pas de horizontale positie van de laser aan en stel de laser in op twee micrometer.

Klik vervolgens continu op L en R om ervoor te zorgen dat het signaal sterk en uniform is. Klik op Tijd om op te nemen om de gegevens te verzamelen, die automatisch naar Buffer springt wanneer u klaar bent. Sla vervolgens de gegevens op in Nfa-bestand en klik op Voorbeeld om Verwijderen te selecteren.

Plaats de buis van de reinigingsoplossing op het laadplatform. Klik op Sample, selecteer Boosting en klik na één minuut op Sample and Unload. Gebruik ultrapuur water om de resterende reinigingsoplossing van de capillaire punt te verwijderen.

Plaats de standaardbuis voor deeltjesgrootte op het laadplatform en klik gedurende één minuut op Sample Boosting. Selecteer 68 tot 155 S16M-Exo kwaliteitscontrole in Voorbeeldinformatie en klik op Voorbeeld en vervolgens op Bemonstering. Klik vervolgens op de werkbalk en selecteer Klein signaal.

Klik op Tijd om op te nemen om de gegevens te verzamelen, die automatisch naar Buffer springt wanneer u klaar bent. Sla vervolgens de gegevens op in een Nfa-bestand en klik op Voorbeeld om Verwijderen te selecteren. Nadat u de residuen met de reinigingsoplossing hebt verwijderd, plaatst u de PBS-buis op het laadplatform en voert u de stappen uit die zijn gedemonstreerd voor de standaardbuis voor deeltjesgrootte.

Reinig vervolgens de capillaire punt zoals eerder gedemonstreerd en laad het sEV-monster om de eerder beschreven gegevens voor de standaardbuis voor deeltjesgrootte te analyseren. De gezuiverde sEV's werden onderzocht onder een transmissie-elektronenmicroscoop, die de aanwezigheid van sEV's met een bekervormige morfologie onthulde. Flowcytometrie voor de sEV's werd uitgevoerd.

De deeltjesgrootte varieerde van 40 tot 200 nanometer, en de gemiddelde deeltjesgrootte was 89 nanometer. De zuiverheid van de verrijkte sEV's bleek 68,32% te zijn: De eiwitmarkers van sEV's zoals CD63, CD9 en TSG101 werden gedetecteerd door western blot. GM130 werd gebruikt als de negatieve controlemarker van sEV's, die werd aangetroffen in weefselcellen, maar niet in de sEV's.

Het is cruciaal om de stappen van enzymatische spijsvertering, differentiële ultracentrifugatie en membraanfiltratie met de grootste zorg uit te voeren om de zuiverheid van kleine extracellulaire blaasjes te garanderen.