Name: Een verrijkingsmethode voor kleine extracellulaire blaasjes afgeleid van leverkankerweefsel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-03T12:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Leer een geoptimaliseerde differentiële ultracentrifugatiemethode voor het verrijken van kleine extracellulaire blaasjes uit leverkankerweefsel. Deze techniek verbetert de zuiverheid van geïsoleerde vesikels voor oncologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs bedanken het First Affiliated Hospital van Gannan Medical University voor het ondersteunen van dit werk. Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (subsidienummers 82260422).

Menselijk leverkankerweefsel werd verzameld van patiënten met de diagnose levermaligniteit in het First Affiliated Hospital van de Gannan Medical University. Alle patiënten ondertekenden een geïnformeerd toestemmingsformulier en de verzameling van menselijke weefselmonsters werd goedgekeurd door de ethische commissie van het First Affiliated Hospital van de Gannan Medical University. Zie de Materiaaltabel voor meer informatie over alle materialen, apparatuur en software die in dit protocol worden gebruikt.
1. Voorbereiding
<ol><li>Plaats de transference decoloring shaker in de incubator en stel de temperatuur in op 37 °C. Zie figuur 1 voor alle andere benodigde apparatuur.</li>
	<li>Reinig het scalpel en de tang door ze in te spuiten met 75% alcohol.</li>
	<li>Bereid de spijsverteringsoplossing door 6 mg collagenase D (4 mg / ml) en 24 μl DNase Ι (80 U / ml) te meten en toe te voegen aan 1,5 ml RPMI-1640 basisch medium. Meng door zachte inversie totdat de additieven volledig zijn opgelost.</li>
	<li>Bevochtig vooraf 70 μm en 0,22 μm celzeven met 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS).</li>
	<li>Plaats een 100 mm steriele celkweekschaal op de ijskast om de leverweefsels na het ontdooien vast te houden.</li>
	<li>Spoel binnen 15 minuten na weefselisolatie van hepatocellulair carcinoom het bloed op het oppervlak van het weefselblok af met PBS, breng het weefsel over in een steriele bevroren buis en bewaar het bij −80 °C tot het experiment gedurende niet meer dan 2 weken.</li>
</ol>2. Weefseldissociatie
<ol><li>Haal het weefselmonster uit de vriezer van −80 °C en plaats ongeveer 400 mg van het weefsel - gesneden in fragmenten van 2 mm x 2 mm x 2 mm - in de celkweekschaal van 10 cm op de ijskast.</li>
	<li>Verplaats het weefsel in een 6-well plaat met 1,5 ml van de spijsverteringsoplossing; plaats vervolgens de plaat op de transference decoloring shaker (20 rpm/min) om gedurende 20 min bij 37 °C te incuberen voor volledige dissociatie van het leverkankerweefsel en afgifte van de sEV's.</li>
	<li>Verwijder de 6-puts plaat uit de incubator en plaats deze op de ijskast. Voeg 80 μL fosfataseremmer en 200 μL complete proteaseremmeroplossing toe om de spijsvertering te stoppen.</li>
	<li>Breng de spijsverteringsoplossing over in de 70 μm celzeef en filter deze langzaam om grote weefselresten te verwijderen. Verzamel het filtraat en plaats het in een centrifugebuis van 2 ml.</li>
</ol>3. Differentiële ultracentrifugatie
OPMERKING: Voer alle centrifugeerstappen uit bij 4 °C.
<ol><li>Centrifugeer het filtraat gedurende 10 minuten op 500 × g en vang het supernatant op in een nieuwe centrifugebuis van 2 ml. Het grootste deel van het kleine weefselafval kan dan worden verwijderd.</li>
	<li>Centrifugeer het supernatant gedurende 20 minuten bij 3.000 × g om celresten te verwijderen. Breng het supernatant voorzichtig over in een nieuwe centrifugebuis totdat de punt van de pipet op het punt staat de witte substantie op het oppervlak te raken.</li>
	<li>Centrifugeer de resterende vloeistof bij 3.000 × g gedurende 3 minuten; Zuig vervolgens het supernatant op om het verzamelen van blaasjes te vergemakkelijken. Om de zuiverheid van de sEV's te garanderen, moet u ervoor zorgen dat de witte substantie niet wordt aangezogen.</li>
	<li>Centrifugeer het verzamelde supernatant gedurende 20 minuten op 12.000 × g en breng 900 μL van het supernatant over in een ultracentrifugebuis van 4,7 ml. Centrifugeer de resterende vloeistof gedurende 3 minuten bij 12.000 × g en verzamel en meng vervolgens beide supernatanten in dezelfde ultracentrifugebuis. Vul de tube volledig met PBS.</li>
	<li>Centrifugeer de supernatanten gedurende 60 minuten op 100.000 × g . Gooi het supernatant weg en resuspendeer de pellet door de ultracentrifugebuis te vullen met PBS en opnieuw te centrifugeren bij 100.000 × g gedurende 60 minuten. Resuspensie van de pellet met 50 μL PBS.</li>
	<li>Zuig de sEV-suspensie op met een steriele spuit van 1 ml en filter deze door een membraanfilter van 0,22 μm. Verzamel het filtraat in een centrifugebuis van 600 μl en bewaar het bij −80 °C voor verdere analyse.</li>
</ol>4. Evaluatie van de verrijkingskwaliteit
<ol><li>Observeer de morfologie van de sEV's onder een transmissie-elektronenmicroscoop.<ol><li>Laat vervolgens 10 μL van het sEV-monster op een koperen net vallen, incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en reinig het met steriel gedestilleerd water, met absorberend papier om overtollige vloeistof te verwijderen.</li>
		<li>Laat 10 μL 2% uranylacetaat op het koperen net vallen voor negatieve kleuring gedurende 1 minuut. Gebruik filtreerpapier om de vloeistof op het oppervlak van het koperen net te absorberen en droog het gedurende 2 minuten onder een gloeilamp.</li>
		<li>Observeer het kopergaas onder een transmissie-elektronenmicroscoop en beeld bij 80 kV.</li>
	</ol></li>
	<li>Gebruik een nanodeeltjesstroomcytometer om de grootteverdeling en zuiverheid van de sEV's te bepalen.<ol><li>Voordat de machine wordt gestart, bereidt u buizen voor met 200 μL kwaliteitscontrole, 200 μL silica-nanosferen, 2 x 200 μL ultrapuur water, 2 x 200 μL reinigingsoplossing en 200 μL PBS. OPMERKING: Alvorens de sEV-monsters te testen, moet de kwaliteitscontrole op het instrument worden uitgevoerd en moet de deeltjesgroottenorm worden getest (de grootteverdeling moet worden berekend met behulp van standaardcurven die worden gegenereerd met verschillende nanomicrosferen van verschillende diameters [68-155 nm] onder dezelfde detectieconditie). QC-kralen en silica-nanosferen werden 100x verdund met ultrapuur water in een totaal volume van 200 μL.</li>
		<li>Controleer het volume van de reinigingsoplossing (>10 ml) en noteer het verschil tussen de niveaus van de mantelvloeistof en de afvalvloeistof (20-30 cm).</li>
		<li>Schakel de hoofdvoeding van het instrument uit; Schakel na 20 S de computer in en wacht op de pieptonen die aangeven dat het instrument correct is aangesloten om de software uit te voeren.</li>
		<li>Klik op Opstarten om de camera, laser en luchtpomp in te schakelen.</li>
		<li>Klik op Sheath Flow-Start Up en plaats ultrapuur water op het laadplatform. Klik na 4 minuten (aftellen van het instrument) op Sample-Boosting | Monster-lossen.</li>
		<li>Plaats na 30 s de lege buis op het laadplatform en klik op Sample-Boosting | Monster-lossen. Plaats vervolgens de buis met het ultrazuivere water op het laadplatform en klik tegelijkertijd op Sample-Boosting | Schede Flow-Purge.</li>
		<li>Klik op Handmatige bediening en plaats de deeltjesconcentratiebuis op het laadplatform. Klik vervolgens gedurende 1 minuut op Sample-Boosting en selecteer tegelijkertijd 250 nm Std FL SiNPs kwaliteitscontrole in "SAMP. Inf."</li>
		<li>Klik op Sample-Sampling en schakel de detector in door op SPCM te klikken. OPMERKING: Op dit punt is de real-time signaalgolfvorm te zien.</li>
		<li>Klik op Auto Sampling en voer 1.0 in Sampling SET in om de druk op 1 KPa te zetten. Klik op de werkbalk en selecteer Groot signaal.</li>
		<li>Pas de horizontale positie van de laser aan en stel de laser in op 2 μm; klik vervolgens op L of R om ervoor te zorgen dat het signaal sterk en uniform is.</li>
		<li>Klik op Time to Record om de gegevens te verzamelen, die automatisch naar Buffer springen wanneer u klaar bent. Sla vervolgens de gegevens op in een Naf-bestand en klik op Sample-Unload.</li>
		<li>Plaats de buis van de reinigingsoplossing op het laadplatform, klik op Sample-Boosting en klik na 1 minuut op Sample-Unload. Gebruik ultrapuur water om de resterende reinigingsoplossing van de capillaire punt te verwijderen.</li>
		<li>Plaats de standaardbuis van de deeltjesgrootte op het laadplatform en klik gedurende 1 minuut op Sample-Boosting .</li>
		<li>Selecteer 68-155 nm Std FL SiNPs kwaliteitscontrole in "SAMP. Inf" en klik op Sample-Sampling. Klik vervolgens op de werkbalk en selecteer Klein signaal.</li>
		<li>Klik op Time to Record om de gegevens te verzamelen, die automatisch naar Buffer springen wanneer u klaar bent. Sla vervolgens de gegevens op in een Naf-bestand en klik op Sample-Unload.</li>
		<li>Plaats de buis van de reinigingsoplossing op het laadplatform, klik op Sample-Boosting en klik na 1 minuut op Sample-Unload . Gebruik ultrapuur water om de resterende reinigingsoplossing van de capillaire punt te verwijderen.</li>
		<li>Plaats de PBS-buis op het laadplatform; klik op Sample-Boosting gedurende 1 min.</li>
		<li>Selecteer 68-155 nm Std FL SiNPs kwaliteitscontrole in "SAMP. Inf" en klik op Sample-Sampling. Klik vervolgens op de werkbalk en selecteer Klein signaal.</li>
		<li>Klik op Time to Record om gegevens te verzamelen, die automatisch naar Buffer springen wanneer u klaar bent. Sla de gegevens op in een Naf-bestand en klik op Sample-Unload.</li>
		<li>Plaats de buis van de reinigingsoplossing op het laadplatform, klik na 1 minuut op Sample-Boosting en Sample-Unload. Gebruik ultrapuur water om de resterende reinigingsoplossing van de capillaire punt te verwijderen.</li>
		<li>Controleer de voorbeeldinformatie zoals eerder beschreven in de stappen 4.2.17-4.2.20; wijzig de PBS (stap 4.2.17) in het sEV-voorbeeld en analyseer de gegevens.</li>
	</ol></li>
	<li>Identificeer de sEV's verder door western blot.<ol><li>Bepaal de eiwitconcentraties van de sEV's en weefsels met behulp van de BCA-eiwitkwantificeringskit volgens de instructies van de fabrikant.</li>
		<li>Bereken het laadvolume van sEV's (bijvoorbeeld voor 5 μg eiwit per put) op basis van deze kwantitatieve resultaten. Voeg laadbuffer toe in een verhouding van 1:4 en vortex het mengsel.</li>
		<li>Na denaturatie in een metaalbad van 100 °C (droge thermostaat) gedurende 10 minuten, scheidt u het eiwit op een 12% polyacrylamidegel bij 60 V gedurende 80 minuten.</li>
		<li>Breng de gel over op een 0,22 μm polyvinylideendifluoridemembraan bij 220 mA gedurende 2 uur met behulp van transferbuffer (25 mM Tris, 192 mM glycine, 20% methanol).</li>
		<li>Blokkeer het membraan met 5% magere droge melk in Tris-gebufferde zoutoplossing Tween (TBST) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en incubeer met primair antilichaam (konijn monoklonaal anti-humaan CD9-antilichaam, konijn monoklonaal anti-humaan CD63-antilichaam, konijn monoklonaal anti-humaan TSG101-antilichaam, muis monoklonaal anti-humaan GM130-antilichaam) 's nachts bij 4 °C. Verdun de primaire antilichamen in 5% magere melk bij 1:1.000.</li>
		<li>Na drie wasbeurten met TBST, incubeer het membraan met mierikswortelperoxidase (HRP)-geconjugeerd secundair antilichaam bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.</li>
		<li>Detecteer het HRP-gekoppelde antilichaam met behulp van ECL-blottingsubstraat en verzamel en analyseer vervolgens de afbeeldingen.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Isaac, R., Reis, F. C. G., Ying, W., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+as+mediators+of+intercellular+crosstalk+in+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Exosomes as mediators of intercellular crosstalk in metabolism.</a> Cell Metabolism. 33 (9), 1744-1762 (2021).</li>
<li>Hou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+exosome+isolation+methods+and+their+applications+in+proteomic+analysis+of+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Advances in exosome isolation methods and their applications in proteomic analysis of biological samples.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (21), 5351-5361 (2019).</li>
<li>Zhang, L., Yu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+in+cancer+development%2C+metastasis%2C+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Reviews+on+Cancer%22%5BJournal%5D)">Exosomes in cancer development, metastasis, and immunity.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Reviews on Cancer. 1871 (2), 455-468 (2019).</li>
<li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((and+perspective+on+exosome+isolation+-+Efforts+for+efficient+exosome-based+theranostics%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">and perspective on exosome isolation - Efforts for efficient exosome-based theranostics.</a> Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).</li>
<li>Crescitelli, R., Lässer, C., Lötvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicle+subpopulations+from+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of extracellular vesicle subpopulations from tissues.</a> Nature Protocols. 16 (3), 1548-1580 (2021).</li>
<li>Crescitelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subpopulations+of+extracellular+vesicles+from+human+metastatic+melanoma+tissue+identified+by+quantitative+proteomics+after+optimized+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Subpopulations of extracellular vesicles from human metastatic melanoma tissue identified by quantitative proteomics after optimized isolation.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1722433(2020).</li>
<li>Jang, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+protein+enriched+extracellular+vesicles+discovered+in+human+melanoma+tissues+can+be+detected+in+patient+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial protein enriched extracellular vesicles discovered in human melanoma tissues can be detected in patient plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1635420(2019).</li>
<li>Muralidharan-Chari, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARF6-regulated+shedding+of+tumor+cell-derived+plasma+membrane+microvesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">ARF6-regulated shedding of tumor cell-derived plasma membrane microvesicles.</a> Current Biology. 19 (22), 1875-1885 (2009).</li>
<li>Matejovič, A., Wakao, S., Kitada, M., Kushida, Y., Dezawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+separation+methods+for+tissue-derived+extracellular+vesicles+in+the+liver%2C+heart%2C+and+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Open+Bio%22%5BJournal%5D)">Comparison of separation methods for tissue-derived extracellular vesicles in the liver, heart, and skeletal muscle.</a> FEBS Open Bio. 11 (2), 482-493 (2021).</li>
<li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brown+adipose+tissue-derived+exosomes+mitigate+the+metabolic+syndrome+in+high+fat+diet+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Brown adipose tissue-derived exosomes mitigate the metabolic syndrome in high fat diet mice.</a> Theranostics. 10 (18), 8197-8210 (2020).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+variability+of+small+extracellular+vesicles+derived+from+human+liver+cancer+tissues+and+cultured+from+the+tissue+explants+based+on+a+simple+enrichment+method%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Comparison of the variability of small extracellular vesicles derived from human liver cancer tissues and cultured from the tissue explants based on a simple enrichment method.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 18 (3), 1067-1077 (2022).</li>
<li>Fang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-derived+exosomal+miR-1247-3p+induces+cancer-associated+fibroblast+activation+to+foster+lung+metastasis+of+liver+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Tumor-derived exosomal miR-1247-3p induces cancer-associated fibroblast activation to foster lung metastasis of liver cancer.</a> Nature Communications. 9 (1), 1247-1243 (2018).</li>
<li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+sequencing+of+plasma+exosomes+revealed+novel+functional+long+noncoding+RNAs+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">RNA sequencing of plasma exosomes revealed novel functional long noncoding RNAs in hepatocellular carcinoma.</a> Cancer Science. 111 (9), 3338-3349 (2020).</li>
<li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HCC-derived+exosomes+elicit+HCC+progression+and+recurrence+by+epithelial-mesenchymal+transition+through+MAPK%2FERK+signalling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">HCC-derived exosomes elicit HCC progression and recurrence by epithelial-mesenchymal transition through MAPK/ERK signalling pathway.</a> Cell Death & Disease. 9 (5), 513(2018).</li>
<li>Jingushi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+isolated+from+human+renal+cell+carcinoma+tissues+disrupt+vascular+endothelial+cell+morphology+via+azurocidin%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles isolated from human renal cell carcinoma tissues disrupt vascular endothelial cell morphology via azurocidin.</a> International Journal of Cancer. 142 (3), 607-617 (2018).</li>
<li>Camino, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+adipose+tissue+extracellular+vesicles+protein+cargo+and+its+role+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Deciphering adipose tissue extracellular vesicles protein cargo and its role in obesity.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9366(2020).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.

Dit protocol beschrijft een herhaalbare methode voor het extraheren van sEV's uit leverkankerweefsel. Hoogwaardige sEV's worden verkregen door scherpe weefselisolatie, behandeling met spijsverteringsenzymen, differentiële ultracentrifugatie en 0,22 μm filtermembraanfiltratie en -zuivering. Voor downstream-analyse is het uiterst belangrijk om de hoge zuiverheid van de sEV's te waarborgen. Tijdens het proces van differentiële centrifugatie verschijnt een laag witte stoffen (onbekende samenstelling) op het oppervlak van het...

Kleine extracellulaire blaasjes (sEV's) hebben een diameter van ongeveer 30 nm tot 150 nm en worden uitgescheiden door verschillende cellen1. Ze kunnen communiceren met weefselcellen en de lokale of verre micro-omgeving reguleren door belangrijke biologische moleculen zoals lipiden, eiwitten, DNA en RNA naar verschillende organen, weefsels, cellen en intracellulaire delen te transporteren. Zo kunnen ze ook het gedrag van ontvangende cellen veranderen 2,3. De isolatie en zuivering van specifieke sEV's is een essentiële voorwaarde voor het bestuderen van hun biologische gedrag tijdens de ontwikkeling en het verloop van de ziekte. Differentiële ultracentrifugatie - beschouwd als de gouden standaard - wordt vaak gebruikt om sEV's te scheiden van de weefsels waarin ze zich normaal bevinden4. Weefselresten, celresten, grote blaasjes en apoptotische lichamen kunnen met deze techniek worden verwijderd, waardoor alleen de sEV's overblijven.
Van collagenase D en DNase I is aangetoond dat ze de moleculaire kenmerken van cellen of blaasjes niet beïnvloeden, waarbij de eigenschappen van beide enzymen bijdragen aan de afgifte van blaasjes in de extracellulaire matrix 5. Deze enzymen zijn gebruikt om sEV's te extraheren uit menselijk gemetastaseerd melanoomweefsel, darmkankerweefsel en darmslijmvliesweefsel 5,6,7. De concentratie en verteringstijd van collagenase D en DNase I in deze methoden verschillen echter, wat leidt tot inconsistente conclusies. Om de coprecipitatie van andere subtypen van sEV's te voorkomen, hebben onderzoekers grotere extracellulaire blaasjes (0,1 μm of 0,2 μm in diameter) verwijderd door filtratie en / of differentiële centrifugatie8. Afhankelijk van het bronweefsel kunnen verschillende methoden van isolatie en zuivering nodig zijn 9,10.
Het gebruik van de traditionele differentiële ultracentrifugatiemethode om sEV's uit leverweefsel te extraheren, resulteert in een laag witte stof op het oppervlak van het supernatant, zonder enige manier om de eigenschappen ervan te bepalen. In een eerdere studie11 bleek deze laag witte stof de zuiverheid van de sEV's te beïnvloeden. Hoewel het aantal deeltjes en de eiwitconcentratie van monsters die met de traditionele methode werden geïsoleerd hoger waren dan die van de huidige methode, was de variatiecoëfficiënt groot, mogelijk omdat veel verontreinigende stoffen kunnen leiden tot een slechte herhaalbaarheid van de resultaten. Dat wil zeggen, met behulp van detergent (d.w.z. het detecteren van de oplosbaarheid van deeltjes in 1% Triton X-100), vonden we dat de zuiverheid van sEV's verkregen door deze methode groter was. Daarom gebruiken we deze methode om sEV's afgeleid van colorectaal kankerweefsel te isoleren en te zuiveren voor proteomisch onderzoek.
Op dit moment is het onderzoek naar sEV's bij leverkanker voornamelijk gericht op serum, plasma en het supernatant van de celcultuur12,13,14. SEV's afgeleid van leverkankerweefsel kunnen echter nauwkeuriger de fysiologische pathologie en de omliggende micro-omgeving van leverkanker weerspiegelen en effectief de afbraak en vervuiling van andere EV's voorkomen15,16. Met het gebruik van differentiële ultracentrifugatie kan deze methode de opbrengst verrijken en hoogwaardige sEV's verkrijgen, wat een belangrijke basis vormt voor de verdere studie van leverkanker. Deze methode maakt het mogelijk om het leverkankerweefsel te scheiden door scherpe scheiding en te worden gedissocieerd door collagenase D en DNase I. Vervolgens worden het cellulaire puin, grote blaasjes en apoptotische lichamen verder verwijderd door filtratie en differentiële ultracentrifugatie. Ten slotte worden de sEV's geïsoleerd en gezuiverd voor latere studies.

<table><tbody><tr><td>0.22 &micro;m Membrane Filter Unit</td><td>Millex</td><td>SLGPR33RB</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Sterile syringe</td><td>Hubei Xianming Medical Instrument Company</td><td>YL01329</td><td></td></tr><tr><td>2% Uranyl Acetate</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>22400-2</td><td></td></tr><tr><td>4.7 mL Centrifuge Tube</td><td>Beckman Coulter</td><td>361621</td><td></td></tr><tr><td>6-well Cell cuture plate</td><td>LABSELECT</td><td>11110</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Beaker</td><td>Tianjin Kangyiheng Experimental Instrument Sales Company</td><td>CF2100800</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro;m Cell strainer</td><td>Biosharp</td><td>BS-70-XBS</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Cell culture dish</td><td>CELL TER</td><td>CS016-0128</td><td></td></tr><tr><td>600 &micro;L Centrifuge tube</td><td>Axygen</td><td>MCT060C</td><td></td></tr><tr><td>BCA protein quantification kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>RJ240544</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Coulter Optima-Max-TL</td><td>Beckman&nbsp;</td><td>A95761</td><td></td></tr><tr><td>BioRad Mini trans-blot</td><td>Bio-Rad</td><td>1703930</td><td></td></tr><tr><td>BioRad Mini-Protean</td><td>Bio-Rad</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>CD63 Antibody</td><td>Abcam</td><td>ab134045</td><td></td></tr><tr><td>CD9 Antibody</td><td>Abcam</td><td>ab263019</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5430R</td><td>Eppendorf</td><td>5428HQ527333</td><td></td></tr><tr><td>Cleaning Solution</td><td>NanoFCM</td><td>C1801</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase D</td><td>Roche</td><td>11088866001</td><td></td></tr><tr><td>Copper net</td><td>Henan Zhongjingkeyi Technology Company</td><td>DJZCM-15-N1</td><td></td></tr><tr><td>Dry Thermostat</td><td>Hangzhou allsheng instruments company</td><td>AS-01030-00</td><td></td></tr><tr><td>FITC Anti Human CD9 Antibody</td><td>Elabscience</td><td>E-AB-F1086C</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Solarbio</td><td>G8200</td><td></td></tr><tr><td>Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-mouse antibody&nbsp;</td><td>Proteintech</td><td>SA00001-1</td><td></td></tr><tr><td>Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-rabbit antibody&nbsp;</td><td>Proteintech</td><td>SA00001-2</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Shanghai Zhenxing Chemical Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanoparticle flow cytometer</td><td>NanoFCM INC</td><td>FNAN30E20112368</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatase inhibitors(PhosSTOP)</td><td>Roche</td><td>4906845001</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline(PBS)</td><td>Servicebio</td><td>G4202</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylidene Difluoride Membrane</td><td>Solarbio</td><td>ISEQ00010</td><td></td></tr><tr><td>QC Beads</td><td>NanoFCM</td><td>QS2502</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 basic medium</td><td>Biological Industries&nbsp;</td><td>C11875500BT</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Guangzhou Kehua Trading Company</td><td>NN-0623-1</td><td></td></tr><tr><td>Silica Nanospheres</td><td>NanoFCM</td><td>S16M-Exo</td><td></td></tr><tr><td>Transference Decoloring Shaker TS-8</td><td>Kylin-Bell</td><td>E0018</td><td></td></tr><tr><td>Transmission Electron Microscope</td><td>Thermo Scientific</td><td>Talos L120C</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Solarbio</td><td>T8060</td><td></td></tr><tr><td>TSG101 Antibody</td><td>Proteintech</td><td>28283-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>Tweezer</td><td>Guangzhou Lige Technology Company</td><td>LG01-105-4X</td><td></td></tr></tbody></table>

een verrijkingsmethode voor kleine extracellulaire blaasjes afgeleid van leverkankerweefsel

An Enrichment Method for Small Extracellular Vesicles Derived from Liver Cancer Tissue

Kleine extracellulaire blaasjes (sEV's) afgeleid van weefsel kunnen de functionele status van de broncellen en de kenmerken van de interstitiële ruimte van het weefsel weerspiegelen. De efficiënte verrijking van deze sEV's is een belangrijke voorwaarde voor de studie van hun biologische functie en een sleutel tot de ontwikkeling van klinische detectietechnieken en therapeutische dragertechnologie. Het is moeilijk om sEV's uit weefsel te isoleren omdat ze meestal zwaar verontreinigd zijn. Deze studie biedt een methode voor de snelle verrijking van hoogwaardige sEV's uit leverkankerweefsel. De methode omvat een proces in vier stappen: de incubatie van spijsverteringsenzymen (collagenase D en DNase Ι) met weefsel, filtratie door een 70 μm celzeef, differentiële ultracentrifugatie en filtratie door een membraanfilter van 0,22 μm. Door de optimalisatie van de differentiële ultracentrifugatiestap en de toevoeging van een filtratiestap is de zuiverheid van de sEV's die met deze methode worden verkregen hoger dan die van klassieke differentiële ultracentrifugatie. Het biedt een belangrijke methodologie en ondersteunende gegevens voor de studie van weefsel-afgeleide sEV's.

sEV's uit menselijke leverkankerweefsels hebben een cruciale rol gespeeld bij de diagnose, behandeling en prognose van patiënten met leverkanker. Deze methode maakte gebruik van gemeenschappelijke laboratoriuminstrumenten om sEV's afkomstig van leverkankerweefsels te isoleren en te zuiveren; dit kan methodologische ondersteuning bieden voor de studie van sEV's. Figuur 2 illustreert het algemene proces van het verrijken van sEV's uit leverkankerweefsels. sEV's in de intercellulaire ruimtes va...

Hier beschrijven we de verrijking van kleine extracellulaire blaasjes afgeleid van leverkankerweefsel door middel van een geoptimaliseerde differentiële ultracentrifugatiemethode.

Een verrijkingsmethode voor kleine extracellulaire blaasjes afgeleid van leverkankerweefsel

Small extracellular vesicles (sEVs) derived from tissue can reflect the functional status of the source cells and the characteristics of the tissue's ...

Deze methode maakt de isolatie mogelijk van leverkankerweefsel afgeleide kleine extracellulaire blaasjes met een zuiverheid die hoger is dan die bereikt door klassieke, differentiële ultracentrifugatie. Deze technologie is eenvoudig, handig en gemakkelijk te bedienen, wat methodologische ondersteuning kan bieden voor de studie van kleine extracellulaire blaasjes. Verwijder om te beginnen het weefselmonster uit de vriezer van 80 graden Celsius.Plaats ongeveer 400 milligram van het weefsel in een celkweekschaal van 10 centimeter op de ijskist en hak het weefsel fijn met een scalpel. Breng het weefsel over naar een plaat met zes putten met 1,5 milliliter van de spijsverteringsoplossing. Plaats vervolgens de plaat op de transferieontkleuringsschudder en incubeer gedurende 20 minuten bij 37 graden Celsius voor volledige dissociatie van het leverkankerweefsel en afgifte van de kleine extracellulaire blaasjes of sEV's.Plaats na de incubatie de plaat met zes putten op de ijskist. Voeg 80 microliter fosfataseremmer en 200 microliter complete proteaseremmeroplossing toe om de spijsvertering te stoppen. Breng vervolgens de spijsverteringsoplossing over naar een 70-micrometer celzeef op een centrifugebuis van twee milliliter en filter deze langzaam om grote weefselresten te verwijderen.Centrifugeer het filtraat gedurende 10 minuten op 500 g om het kleine weefselresten te verwijderen en verzamel het supernatant in een nieuwe centrifugebuis van twee milliliter. Centrifugeer het supernatant op 3.000 g gedurende 20 minuten om het celafval te verwijderen. Breng het supernatant voorzichtig over in een nieuwe centrifugebuis totdat de punt van de pipet op het punt staat het witte vuil aan de onderkant te raken.Na het herhalen van de centrifugatie van de resterende vloeistof, poolt u het supernatant in de buis zonder het vuil te verstoren. Centrifugeer het verzamelde supernatant op 12.000 g gedurende 20 minuten en breng 900 microliter van het supernatant over in een ultracentrifugebuis van 4,7 millimeter. Herhaal de centrifugatie van de resterende vloeistof en verzamel en meng vervolgens beide supernatanten in dezelfde ultracentrifugebuis.Vul de tube volledig met PBS. Centrifugeer het supernatant op 100.000 g gedurende 60 minuten. Nadat u het supernatant hebt weggegooid, resuspendeert u de pellet door de ultracentrifugebuis te vullen met PBS.Na het herhalen van de centrifugatie bij 100.000 g gedurende 60 minuten, resuspensie de pellet met 50 microliter PBS. Zuig de sEV-suspensie op met een steriele spuit van één milliliter en filter deze door een membraanfilter van 0,22 micrometer in een centrifugebuis van 600 microliter. Bewaar het filtraat bij 80 graden Celsius voor verdere analyse.Gebruik een nanodeeltjesstroomcytometer om de grootteverdeling en zuiverheid van de sEV's te bepalen. Controleer het volume van de reinigingsoplossing. Let vervolgens op het verschil tussen de niveaus van de schede en de afvalvloeistof.Na 20 seconden de hoofdvoeding van het instrument in te schakelen, schakelt u de computer in. Wacht tot de pieptonen aangeven dat het instrument correct is aangesloten om de software uit te voeren. Klik op Opstarten om de camera, laser en luchtpomp in te schakelen.Klik vervolgens op Sheath Flow en selecteer Start Up.Plaats ultrapuur water op het laadplatform. Klik na vier minuten op Sample and Boosting en selecteer vervolgens Unload in Sample. Plaats na 30 seconden de lege buis op het laadplatform.Klik op Voorbeeld, selecteer Boosten en selecteer vervolgens Verwijderen in Voorbeeld. Plaats vervolgens de buis met het ultrazuivere water op het laadplatform. Klik tegelijkertijd op Sample en Boosting, gevolgd door Sheath Flow en Purge.Klik op Handmatige bediening en plaats de deeltjesconcentratiebuis op het laadplatform. Klik vervolgens op Voorbeeld, selecteer Boosting gedurende één minuut en selecteer tegelijkertijd 250 nanometer Standard Fluorescent Silica Nanospheres kwaliteitscontrole in Sample Information. Selecteer Bemonstering uit monster en schakel de detector in door op SPCM te klikken.Klik vervolgens op Auto Sampling en voer 1.0 in Sampling Set in om de druk op één kilopascal vast te stellen. Klik op de werkbalk en selecteer Groot signaal. Pas de horizontale positie van de laser aan en stel de laser in op twee micrometer.Klik vervolgens continu op L en R om ervoor te zorgen dat het signaal sterk en uniform is. Klik op Tijd om op te nemen om de gegevens te verzamelen, die automatisch naar Buffer springt wanneer u klaar bent. Sla vervolgens de gegevens op in Nfa-bestand en klik op Voorbeeld om Verwijderen te selecteren.Plaats de buis van de reinigingsoplossing op het laadplatform. Klik op Sample, selecteer Boosting en klik na één minuut op Sample and Unload. Gebruik ultrapuur water om de resterende reinigingsoplossing van de capillaire punt te verwijderen.Plaats de standaardbuis voor deeltjesgrootte op het laadplatform en klik gedurende één minuut op Sample Boosting. Selecteer 68 tot 155 S16M-Exo kwaliteitscontrole in Voorbeeldinformatie en klik op Voorbeeld en vervolgens op Bemonstering. Klik vervolgens op de werkbalk en selecteer Klein signaal.Klik op Tijd om op te nemen om de gegevens te verzamelen, die automatisch naar Buffer springt wanneer u klaar bent. Sla vervolgens de gegevens op in een Nfa-bestand en klik op Voorbeeld om Verwijderen te selecteren. Nadat u de residuen met de reinigingsoplossing hebt verwijderd, plaatst u de PBS-buis op het laadplatform en voert u de stappen uit die zijn gedemonstreerd voor de standaardbuis voor deeltjesgrootte.Reinig vervolgens de capillaire punt zoals eerder gedemonstreerd en laad het sEV-monster om de eerder beschreven gegevens voor de standaardbuis voor deeltjesgrootte te analyseren. De gezuiverde sEV's werden onderzocht onder een transmissie-elektronenmicroscoop, die de aanwezigheid van sEV's met een bekervormige morfologie onthulde. Flowcytometrie voor de sEV's werd uitgevoerd.De deeltjesgrootte varieerde van 40 tot 200 nanometer, en de gemiddelde deeltjesgrootte was 89 nanometer. De zuiverheid van de verrijkte sEV's bleek 68,32% te zijn: De eiwitmarkers van sEV's zoals CD63, CD9 en TSG101 werden gedetecteerd door western blot. GM130 werd gebruikt als de negatieve controlemarker van sEV's, die werd aangetroffen in weefselcellen, maar niet in de sEV's.Het is cruciaal om de stappen van enzymatische spijsvertering, differentiële ultracentrifugatie en membraanfiltratie met de grootste zorg uit te voeren om de zuiverheid van kleine extracellulaire blaasjes te garanderen.

an-enrichment-method-for-small-extracellular-vesicles-derived-from

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

The plasma-isolated exosomes can be used as a non-invasive and repeatable way for the detection and follow-up of the biomarkers for early detection and disease progression. This video describes the protocol for the separation of exosomes from the plasma samples of non-small cell lung cancer patients, which could be used for DNA and protein extractions.

Exosome Isolation: A Technique to Separate Exosomes from the Plasma of Non-small Cell Lung Cancer Patients

Dit is een protocol om weefsel extracellulaire blaasjes (EVs) te isoleren van de lever. Het protocol beschrijft een proces in twee stappen waarbij Collagenase perfusie gevolgd door differentiële ultracentrifugatie om leverweefsel EVs te isoleren.

Isolatie van weefsel extracellulaire vesicles uit de lever

Een exosome is een nieuwe generatie van drug delivery vervoerders. Wij opgericht een protocol exosome isolatie met een hoge opbrengst en zuiverheid voor siRNA levering. Wij ook ingekapseld fluorescently geëtiketteerde aspecifieke siRNA in exosomes en onderzocht de cellulaire opname van siRNA-geladen exosomes in kankercellen.

Voorbereiding van Exosomes van siRNA levering aan kankercellen

Hier bieden we een gedetailleerd protocol om te isoleren van kleine extracellulaire blaasjes (EVs) hele weefsel, met inbegrip van hersenen en tumor exemplaren. Deze methode biedt een reproduceerbare techniek om EVs extract van solide weefsel voor verder stroomafwaarts analyses.

Winning van extracellulaire blaasjes uit hele weefsel

Het huidige protocol beschrijft een methode om extracellulaire blaasjes uit het perifere bloed en vaste weefsels te extraheren met daaropvolgende profilering van oppervlakteantigenen en eiwitladingen.

Isolatie en analyse van traceerbare en gefunctionaliseerde extracellulaire blaasjes uit het plasma en vaste weefsels

Dit protocol laat zien hoe de kleine extracellulaire blaasjes (hUC-MSC-sEV's) van menselijke navelstreng-afgeleide mesenchymale stamcellen kunnen worden geïsoleerd met een eenvoudige benchtop-instelling op laboratoriumschaal. De grootteverdeling, eiwitconcentratie, sEV-markers en morfologie van geïsoleerde hUC-MSC-sEV's worden gekenmerkt door respectievelijk nanodeeltjestrackinganalyse, BCA-eiwittest, western blot en transmissie-elektronenmicroscoop.

Een eenvoudige benchtop-filtratiemethode om kleine extracellulaire blaasjes te isoleren van menselijke mesenchymale stamcellen

Dit protocol beschrijft de differentiële centrifugatie voor het isoleren en karakteriseren van representatieve EV's (exosomen en microvesicles) uit gekweekte menselijke MSC's. Verdere toepassingen van deze EV's worden in dit artikel ook toegelicht.

Isolatie, karakterisering en therapeutische toepassing van extracellulaire blaasjes uit gekweekte menselijke mesenchymale stamcellen

Het voorgestelde protocol bevat richtlijnen over hoe besmetting met endotoxine kan worden voorkomen tijdens de isolatie van extracellulaire blaasjes uit celkweeksupernatanten en hoe deze op de juiste manier kunnen worden geëvalueerd.

Isolatie van extracellulaire blaasjes met een laag endotoxinegehalte afgeleid van kankercellijnen

Hier presenteren we een protocol om van milt afgeleide exosomen van muizen te isoleren met behulp van een combinatie van vertering met collagenase type I en ultracentrifugatie.

Isolatie en karakterisering van exosomen afgeleid van miltweefsels van muizen

Dit protocol beschrijft de isolatie van kleine extracellulaire blaasjes uit muisskeletspier en beenmerg met behulp van enzymatische vertering en grootte-uitsluitingschromatografie, waardoor reproduceerbare terugwinning van vesikelverrijkte fracties uit structureel complexe, laagopbrengstweefsels mogelijk is voor downstream moleculaire analyse.

Isolatie van kleine extracellulaire blaasjes uit muisskeletspier en beenmerg door grootte-uitsluitingschromatografie

Leer een geoptimaliseerde differentiële ultracentrifugatiemethode voor het verrijken van kleine extracellulaire blaasjes uit leverkankerweefsel. Deze techniek verbetert de zuiverheid van geïsoleerde vesikels voor oncologisch onderzoek.

Een verrijkingsmethode voor kleine extracellulaire blaasjes afgeleid van leverkankerweefsel

Meer video's verkennen