Ecotoxicologische methodologieën om biomarkers op verschillende schalen te evalueren bij neotropische anura's

Hoewel de technieken voor het evalueren van biochemische biomarkers op grote schaal worden gebruikt, biedt dit protocol cruciale details voor het standaardiseren en repliceren van de methodologie bij neotropische anura's. Het belangrijkste voordeel van deze techniek zijn de lage kosten, reproduceerbaarheid en de toepassing ervan. Deze techniek kan worden toegepast om kwantitatieve gegevens te verkrijgen om veranderingen in de interne melanine te evalueren.

De komeettest is een gevoelige, veelzijdige en eenvoudige techniek waarmee genotoxische effecten kunnen worden bepaald die door een specifieke verbinding worden veroorzaakt. Het kan worden toegepast op elk type eukaryote cellen om DNA-schade en DNA-herstel te controleren en de antioxidantstatus van cellen te beoordelen. Open om te beginnen de software Image-Pro Plus 6.0 en selecteer menu en werkbalk als biologisch.

Om het gebied dat door melanine wordt ingenomen te kwantificeren, selecteert u meten en selecteert u vervolgens de ruimtelijke kalibratie van de vergroting die wordt gebruikt om de fotomicrofoto's te maken. Nadat u de histologische afbeelding hebt geopend, selecteert u het aantal gereedschappen en meet u vervolgens objecten. Markeer de kleur die in de afbeelding moet worden gemeten met behulp van het gereedschap Kleuren selecteren en druppelaar en sluit vervolgens het venster.

Visualiseer de resultaten door te klikken op aantal, weergave en statistieken. Incubeer een mengsel van PBS, waterstofperoxide en een monster in een kwartscuvet van drie milliliter met een weglengte van één centimeter. Verwijder vervolgens het monster dat in een centrifugebuis van 500 microliter wordt bewaard en voeg het toe aan de kwartscuvet.

Lees de catalasekinetiek op 240 nanometer gedurende twee minuten af in een UV-spectrofotometer en bereken de enzymactiviteit met behulp van de vergelijking die op het scherm wordt weergegeven. Verdun het afgenomen bloedmonster met één milliliter PBS. Centrifugeer het gedurende negen minuten bij 381 G en resuspendeer de pellet met 50 milliliter PBS.

Meng 30 microliter van het bloedmonster in 70 microliter agarose met een laag smeltpunt of LMPA met een concentratie van 0,5% agarose om laag twee te vormen. Plaats 50 microliter van laag twee op een objectglaasje dat eerder is bedekt met laag één met 100 microliter agarose met een normaal smeltpunt van 0,5%. Dek de dia af met een dekglaasje en leg deze 10 minuten in de kou bij vier graden Celsius om laag twee te laten stollen.

Verwijder na het stollen het dekglaasje. Vorm de derde laag door 100 microliter 0,5% LMPA neer te leggen en bedek de dia opnieuw. Nadat de derde laag is gestold, verwijdert u het dekglaasje en dompelt u elk glaasje onder in een copilin-pot van 100 milliliter met de lysisoplossing die op dezelfde dag is bereid.

Zet de coplin potjes een uur in een koud bad bij vier graden Celsius in het donker om lysis te laten optreden. Verwijder aan het einde van de lysis de objectglaasjes en dompel ze 15 minuten onder in de elektroforesebufferoplossing in de elektroforesetank bij vier graden Celsius om het DNA te laten afwikkelen. Voer na het afwikkelen van nucleair DNA elektroforese uit op dezelfde buffer bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten bij 25 volt en 250 milliampère.

Aan het einde van de elektroforese neutraliseert u de monsters in de objectglaasjes door driemaal gedurende vijf minuten twee milliliter tris-zoutoplossing toe te voegen. Plaats de monsters in 100 milliliter copilin potten met 95% alcohol bij vier graden Celsius om de monsters te dehydrateren. Kleur de monsters door 10 microliter DAPI toe te voegen aan het midden van het objectglaasje.

Verdeel vervolgens de kleurstof over de monsters met een dekglaasje. Bestudeer de objectglaasjes onder een fluorescentiefotomicroscoop met een NU-filter. Kwantificeer de DNA-schade door de lengte van de DNA-migratie van de nucleoïde te evalueren.

Bepaal het in dit geval visueel op 100 willekeurig geselecteerde cellen zonder overlapping. Classificeer vervolgens de DNA-schade in vier klassen, waarbij nul tot één staat voor geen schade, twee voor minimale schade, drie voor gemiddelde schade en vier voor maximale schade. Druk de gegevens uit als het gemiddelde aantal beschadigde cellen en de gemiddelde komeetscore voor elke behandelingsgroep.

Bereken ten slotte op basis van deze gegevens de genetische schade-index of GDI voor elk testorganisme met behulp van de vergelijking die op het scherm wordt weergegeven. De geschaalde massa-index van Boana pulchella en Leptodactylus luctator volwassenen wordt weergegeven in deze figuur. Voor de analyse van de geschaalde massa-index werd een niet-lineaire regressieanalyse uitgevoerd die de machtsfunctierelatie tussen de SVL en de lichaamsgewicht voor de soort aantoont om de schalingsexponent te bepalen.

De geschaalde massa-index is handig voor het vergelijken van groepen volwassen dieren of juvenielen van dezelfde soort. De histologische secties van de lever van Boana raniceps worden hier gepresenteerd. Uit deze secties kunnen een grotere hoeveelheid c en grotere afmetingen van de hepatocyt en de kern van de hepatocyten worden waargenomen.

Verschillende en complementaire responsen van cytogenetische biomarkers in blootstelling aan een herbicidescenario in Boana pulchella worden weergegeven in deze figuur. Hier geven de zwarte balken 48 uur aan en de grijze balken 96 uur. Het tijdstip van blootstelling en de concentratie moeten hier altijd als een factor worden beschouwd, aangezien een bepaalde tijd of concentratie mogelijk niet voldoende is om schade te veroorzaken.

De representatieve afbeelding beschrijft hoe de biomarkers zich verhouden tot de biomarker responsindex. Hier geeft het blauw de controlegroep aan, terwijl de oranje, gele en groene kleuren de blootstellingsscenario's aan BDE 209 aangeven. Deze gegevens geven aan dat catalase een effectieve biomarker is voor stresssituaties waarin de stressor in de hoogste concentraties aanwezig is.

Maak bij het berekenen van de body condition index consequent foto's vanaf dezelfde afstand. Meet bij kikkervisjes de SVL-lichaamslengte tot aan de cloacabuis, exclusief de kraagvin. Deze benadering richt zich op een veilige manier op de fysiologie van amfibieën en de impact van de veranderingen in het milieu.

Hoewel er alternatieve potentieel invasieve biomarkers bestaan, bieden deze methoden inzicht in oxidatieve stress, toxicodynamica en toxicogenetica. Aanvullende enzymmetingen met betrekking tot oxidatieve stress kunnen dienen als alternatieve methodologieën. De techniek voor de analyse van kleurverschillen evalueert weefselreacties in microfoto's op basis van kleurverschillen.

Zorg er voor het pigmentsysteem voor dat de kalibratie van het programma is uitgelijnd met de microfoto. Deze geavanceerde techniek is van groot belang bij het onderzoeken of xenobiotica rechtstreeks van invloed zijn op DNA in verschillende celtypen, het beantwoorden van vragen over oxidatieve schade aan genetisch materiaal en herstelprocessen die andere cytogenetische technieken niet kunnen aanpakken.