Morfologische en compositorische analyse van neutrofiele extracellulaire vallen geïnduceerd door microbiële en chemische stimuli

Dit protocol toont de heterogeniteit in samenstelling, structuur en morfologie van neutrofiele extracellulaire vallen, afhankelijk van hun inducerende stimulus onder vergelijkbare in vitro omstandigheden bij menselijke neutrofielen van gezonde individuen. Hoge neutrofiele zuiverheid en levensvatbaarheid worden verkregen. Dat maakt het mogelijk om de concentratie dna, LL-37 en enzymactiviteit van myeloperoxidase, elastase en cathepsine G, vrijgegeven door neutrofiele extracellulaire vallen, te vergelijken.

Dit protocol maakte het mogelijk om het effect van oplosbare factoren of cellulair contact of mogelijke therapieën of mechanismen voor het sluiten van de productie van NET's bij auto-immuunziekten te analyseren. Deze methoden kunnen helpen bij het onderzoek naar auto-immuunziekten. Vanwege de ongecontroleerde celreproductie van NET's en de duur van de aligneren van hun componenten, die worden beschouwd als biomarkers van de ziekte.

Fluorescentiemicroscopie maakt het mogelijk om een beeld te maken van NET's die de dispersie van DNA laten zien in associatie met eiwitten zoals LL37, die samen met micro-organismen zijn gelokaliseerd en helpen begrijpen hoe ze verschijnen. Voer om te beginnen vena-punctie uit om 10 milliliter perifeer bloed te verzamelen in buizen die dipotassium EDTA als antistollingsmiddel bevatten. Voer vervolgens standaard bloedbiometrie en C-reactieve proteïnetest uit om infectie of ontsteking uit te sluiten om de kwaliteit van het monster te waarborgen.

Centrifugeer het perifere bloedmonster om het bloedplaatjesrijke plasma te verwijderen, gevolgd door een tweede centrifugatie en gooi het resterende plasma weg. Verdun het resulterende erytrocyten- en leukocytenpakket in één-op-één volumeverhouding met één 1X DPBS. Vervolgens, in een steriele glazen buis van 10 milliliter, eerst één milliliter van 1,08 gram per milliliter dichtheidsoplossing afgezet, gevolgd door één milliliter van 1,079 gram per milliliter dichtheidsoplossing.

Voeg vervolgens vier milliliter van het verdunde erytrocyten- en leukocytenpakket toe door over de wanden te gieten. Centrifugeer zonder versnelling of vertraging om te voorkomen dat de helling wordt verstoord. Aspirateer de fase die overeenkomt met granulocyten en breng over naar een andere steriele glazen buis van 10 milliliter.

Was met vier milliliter 1X DPBS op 300 G gedurende 10 minuten op vier graden Celsius en gooi het supernatant weg. Om de resterende erytrocyten te verwijderen, behandelt u de cellen met osmotische shock door vier milliliter 0,2% zoutoplossing toe te voegen. Incubeer gedurende twee minuten bij vier graden Celsius en centrifugeer.

Gooi het supernatant weg en voeg vier milliliter 0,65% zoutoplossing toe. Incubeer gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius om de membraanintegriteit te herstellen en de centrifugatie te herhalen. Verwijder het supernatant en suspensieer de cellen opnieuw in vier milliliter 1X DPBS om cellulair afval te verwijderen.

Nogmaals, centrifugeer en suspensie de celpellet opnieuw in twee milliliter koude HBSS-buffer. Om een trypan blue exclusietest uit te voeren, verdunt u vijf microliter van de celsuspensie in 20 microliter van 0,4% trypan blue. Tel de cellen in een nieuwe bowerkamer en bepaal de levensvatbaarheid van de cel met behulp van een uitsluitingstest.

Monteer vervolgens 5 microliter van de celophanging op een dia en bevlek gedurende 15 seconden met de vlek van Wright. Bevestig het monster onmiddellijk, was met gedestilleerd water en observeer de morfologie onder een optische microscoop. Voeg vervolgens een keer 10 toe aan de vijfde cellen aan flowcytometriebuizen en kleur met één microliter 7AAD in 100 microliter FACS-buffer gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius in het donker.

Was met 500 microliter FACS-buffer op 300 G gedurende 10 minuten. Fixeer de cellen met 500 microliter 2% paraformaldehyde en bewaar bij vier graden Celsius tot flowcytometrie-analyse. Voor een dode celcontrole fixeert u de cellen gedurende 30 minuten met 200 microliter 4% paraformaldehyde en wast u met 500 microliter 1XPBS op 300 G gedurende 10 minuten op vier graden Celsius.

Gooi het supernatant weg en voeg 200 microliter van 0,1% Triton X-100 toe. Incubeer gedurende een uur bij vier graden Celsius. Wassen met 500 microliter 1X PBS en beitsen met 7AAD.

Analyseer de vastgelegde gegevens in de flowcytometersoftware. Laad de bestanden en dubbelklik op het niet-gekleurde neutrofiele bestand. Kies forward scatter of FSC op de X-as en side scatter of SSC op de Y-as om de celpopulatie weer te geven die overeenkomt met neutrofielen.

Selecteer vervolgens het kanaal B3-A:PerCP vio 700-A op de X-as om de autofluorescentie van de cellen te de-limiteren en kies histogram op de Y-as. Open vervolgens het gebeitste neutrofielenbestand. Kies FSC op de X-as en SSC op de Y-as om de celpopulatie weer te geven die overeenkomt met neutrofielen.

Selecteer nogmaals het kanaal B3-A: PerCP vio 700-A om de populatie neutrofielen af te bakenen die positief zijn voor de kleurstof 7AAD. Genereer het uiteindelijke histogram door met de rechtermuisknop op het venster te klikken en copy to layout editor te selecteren. Voeg bacteriële of schimmel pseudohyphae toe in microbuisjes van 1,5 milliliter.

Voeg 200 microliter toe, dus vijf micromolaire CFSC in 1X PBS. Meng en incubeer bij 37 graden Celsius gedurende 10 minuten in het donker. Stop de reactie door 500 microliter gedecomplementeerd plasma en centrifuge toe te voegen.

Gooi het supernatant weg en was de pellet met één milliliter 1XPBS met centrifugatie. Vervolgens suspensie de micro-organismen opnieuw in 250 microliter 1X PBS. Bereid 50 microliter aliquots in 1,5 milliliter microbuisjes met twee keer 10 tot de zevende bacterie of twee keer 10 tot de vijfde pseudohyphae voor NET-inductie.

Plaats 10 bij 10 millimeter steriele glazen afdekkingsslips in een 24-wells plaat. Dek af met 10 microliter 0,001% poly l-lysine gedurende één uur bij kamertemperatuur en was tweemaal met 100 microliter 1X PBS. Droog aan de lucht en bestraal met UV-licht gedurende 15 minuten.

Vervang vervolgens hbss-oplossing van de neutrofielenususpensie die eerder is bereid met RPMI 1640 medium aangevuld met 10% warmte gedecomplementeerd autoloog plasma. Voeg 350 microliter van deze celsuspensie toe aan de 24-wellsplaat voor een uiteindelijke concentratie van twee keer 10 tot de vijfde neutrofielen per put. Incubeer de plaat gedurende 20 minuten bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide om de cellen aan de bodem van de putten te laten hechten.

Om nettovorming te induceren, voegt u de bacterieprikkels MOI100 en pseudohyphae toe aan MOI1. Voeg ook de biochemische stimuli toe en bereid een controle voor zonder een stimulus door 50 microliter HBSS toe te voegen. Verkrijg een eindvolume van 400 microliter per put en meng op een platenschudder bij 140 RPM gedurende 30 seconden.

Incubeer vervolgens vier uur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Verwijder na de netto-inductie het supernatant uit de putten door voorzichtig te pipetteren en fixeer de cellen gedurende 30 minuten met 300 microliter 4% paraformaldehyde. Was de cellen met 200 microliter 1X PBS zonder centrifugeren en voeg gedurende 30 minuten 200 microliter blokkeerbuffer toe.

Voor LL37-kleuring, permeabilize de cellen met 200 microliter van 0,2% Triton X-100 in 1X PBS gedurende 10 minuten en was tweemaal met 1X PBS. Monteer de afdekselglijders op glazen glijbanen. DNA kleurt de cellen met twee microliter DAPI en slaat op bij min 20 graden Celsius tot analyse door confocale fluorescentiemicroscopie.

De dynamische cellulaire fasen werden gevisualiseerd na een gradiëntzuivering met dubbele dichtheid. De typische neutrofiele morfologie werd bevestigd door rechterkleuring. De cellen vertoonden ook optimale levensvatbaarheid waargenomen door trypan blue uitsluiting zonder membraanverstoring.

Analyse van SSC versus FSC door flowcytometrie bevestigde een populatie die overeenkomt met PMN met een hoge celzuiverheid. PMN dot plots voor niet-gekleurde cellen versus 7AAD-kleurcellen en hun respectieve histogrammen wezen op een hoge levensvatbaarheid van cellen in de vers geïsoleerde neutrofielen in vergelijking met de permeabiliseerde controlecellen. Na het stimuleren van de neutrofielen met chemische en microbiële stimulerende middelen, werden NET's gevisualiseerd door fluorescentiemicroscopie met behulp van DNA DPI en anti-LL37.

De micro-organismen waren vooraf gekleurd met CVSE. PMA-geïnduceerde suïcidale nettovorming aangegeven door co-lokalisatie met LL37. Terwijl NET's gevormd met HOCI een kleine DNA-dispersie in de extracellulaire ruimte vertoonden die overeenkwam met vitale NET-vorming.

NET geïnduceerd door schimmel pseudohyphae toonde lage concentraties DNA vrijgegeven in de extracellulaire ruimte met filamenteuze structuren die kenmerkend zijn voor de vitale NET-vorming. S.aureus vertoonde vitale NET-vorming, terwijl P.aeruginosa de afgifte van grote concentraties DNA veroorzaakte met een troebele morfologie die samen met LL37 wees op zelfmoord NET-vorming. Het uitvoeren van een gradiëntmethodologie met dubbele dichtheid stelt ons in staat om een hoge zuiverheid en levensvatbaarheid van neutrofielen te verkrijgen.

En we verhogen de wassingen, we voorkomen dat de structuur ervan wordt beschadigd. Volgens deze methode kunnen we het effect van stoffen of cellen in NET-productie analyseren en of ze betrokken zijn bij een mechanisme of hun gebruik als therapieën bij auto-immuunziekten.