Detectie van horizontale genoverdracht gemedieerd door natuurlijke conjugatieve plasmiden in E. coli

Bacteriën zoals E.coli dragen antibioticaresistente genen in conjugatieve plasmiden. Deze bacterie is te vinden in ziekenhuizen, leeft als commensalen in dieren en in aquatische omgevingen. Natuurlijke conjugatieve plasmiden horizontale overdracht van genen tussen verschillende bacteriële afstammingslijnen.

We presenteren metalen voor de detectie van conjugatieve plasmiden en formatieconjugatie-efficiëntie. Deze techniek is eenvoudig en gevoelig. Het is gevoelig omdat het markers gebruikt voor het plasmide, de donor en de ontvanger.

Deze markers zijn selecteerbaar, wat betekent dat ze afzonderlijke gebeurtenissen in zeer grote populaties kunnen identificeren. De protocollen die we presenteren zijn nuttig om de evolutie van antibioticaresistentie te bestuderen en voor epidemiologische surveillance, dat wil zeggen om de stroom van resistente genen te monitoren. Caison Warner, een promovendus uit mijn laboratorium, en Pepper St.Clair, een niet-gegradueerde student van CAMS lab, zullen de procedure demonstreren.

Op de eerste dag streep je de donoren en de ontvanger afzonderlijk van glycerolvoorraden op media C, MacConkey-agar zonder antibiotica en incuber je 's nachts bij 37 graden Celsius. Label op dag twee een kweekbuis van 14 milliliter voor elke donor en ontvanger. Selecteer een enkele kolonie van elke donor en ontvanger en kweek ze in twee milliliter Mueller Hinton Bouillon bij 200 RPM gedurende 18 uur bij 37 graden Celsius.

Meet op dag drie de optische dichtheid van 10 keer zoutoplossing verdunde 's nachts gekweekte cultuur op 600 nanometer zonder vortexing. Gebruik indien nodig een gesteriliseerde zoutoplossing om de optische dichtheid op twee aan te passen. Label een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter als een paringsbuis, met vermelding van de donor- en ontvangerstammen.

Breng 500 microliter van de aangepaste suspensie van elke donor en ontvanger over in de paringsbuis en meng de suspensie voorzichtig door inversie. Centrifugeer de paringsbuis bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten bij 500 G.Pipetteer 800 microliter supernatant uit de paringsbuis zonder de pellet te verstoren, waardoor 200 microliter in de buis achterblijft. Incubeer de paringsbuis gedurende 18 uur bij 37 graden Celsius.

Verder, als een negatieve controle, streep de nachtelijke cultuur van donoren op media B en ontvangers op media A en incuber de platen 's nachts bij 37 graden Celsius. Voeg na incubatie, op dag vier, 800 microliter zoutoplossing toe aan de paringsbuis en resuspensie door vortexing. Maak seriële verdunningen van de paringssuspensie en voeg 100 microliter van elke verdunning toe aan mediaplaten.

Zodra de platen zijn gedroogd, incubeer ze gedurende 18 uur bij 37 graden Celsius en bereken de frequentie van conjugatie per donor of per ontvanger zoals beschreven in het manuscript. Na het extraheren van DNA uit de bacteriële celwanden met behulp van een eenvoudige kookvoorbereidingsextractiemethode, labelt u een buis van 1,5 milliliter als een pool in de vereiste PCR-buizen met de naam van het gen en het monster. Voeg in de buis met het label pool steriel water, PCR-mastermix, primers en polymerase toe.

Meng voorzichtig door minstens 10 keer op en neer te pipetteren in een gekoelde omgeving. Voeg het sjabloon-DNA toe aan de bijbehorende buis en zet de PCR-buizen vast met doppen. Plaats de PCR-buizen in de thermocycler en start het programma voor resistentiegenen en replicons zoals beschreven in het manuscript.

Bereid voor ampliconbevestiging een 1% agarose-gel door agarose en TAE-buffer toe te voegen in een kolf van 250 milliliter en smelt de agarose met behulp van een magnetron. Zodra de agarose-oplossing is afgekoeld tot ongeveer 55 graden Celsius, voeg je onder een zuurkast zes microliter SYBR Green toe en meng je. Giet de gel in een met plakband afgesloten bakje om morsen te voorkomen en laat de gel 15 tot 25 minuten opstijven totdat troebelheid verschijnt.

Na het verwijderen van de plakband, plaatst u de gel in de elektroforesekamer en voegt u TAE-buffer toe om de gel te bedekken. Meng vijf microliter van zes keer DNA-gelladingskleurstof met 25 microliter van elke reactie door minstens 10 keer op en neer te pipetteren. Laad het mengsel vervolgens in putten door bubbels te vermijden.

Na het toevoegen van vier microliter van een kilobasepaar DNA-ladder in de eerste put, sluit u het kamerdeksel en laat u de gel gedurende 60 minuten op 120 volt en 400 milliamperes lopen. Visualiseer de gel onder UV-licht en neem het beeld op. MacConkey-agar onderscheidde de lactosepositieve donoren die grote roze kolonies produceerden van de ontvanger en transconjuganten, die lactosenegatief waren en kleinere lichtgele kolonies produceerden.

De vijf conjugatie-efficiënties van een donorstam SSW4955 lagen allemaal binnen dezelfde orde van grootte, wat aangeeft dat de mobilisatie van conjugatief plasmide kan worden gedetecteerd, ongeacht de selectie die wordt gebruikt voor transconjugante identificatie. Terwijl de donorstam SSW7037 een conjugatie-efficiëntie vertoonde die drie keer lager was, wat de vergelijking van conjugatie-efficiënties van verschillende donoren en plasmidetypen met dezelfde ontvangers mogelijk maakt. De gel-elektroforese van PCR-producten bevestigde de aanwezigheid van verwachte repliconen in transconjuganten.

Deze test is volledig afhankelijk van selecteerbare markers. Er moeten controles aanwezig zijn om te bevestigen dat elke selectie werkt en transconjuganten moeten colorimetrisch of met PCR worden bevestigd. De hier gepresenteerde protocollen kunnen worden aangepast voor de studie van conjugatie in vivo of biofilmmodellen, en voor een studie van variabelen die de conjugatie-efficiëntie moduleren.

Dit protocol voor het detecteren van mobiliseerbare plasmiden op schaal zal een grote bijdrage leveren aan ons begrip van de stroom van genen door de omgeving en aan het bestuderen van de variabelen die de efficiëntie van conjugatie beïnvloeden.