Real-time dynamische verzameling van hippocampale extracellulaire vloeistof van bewuste ratten met behulp van een microdialysesysteem
21 oktober 2022
Het protocol hier biedt een gedetailleerde real-time dynamische bemonstering van extracellulaire vloeistof uit de hippocampus van wakkere ratten met behulp van een microdialysesysteem.
Hippocampale extracellulaire vloeistof en crowd by brain microdialyse techniek draagt bij aan het monitoren van de ziekte specifieke micro van centrale zenuwstelsel ziekten. Hersenmicrodialyse technisch bereikt dynamische en de continue inquisitie van interstitiële hersenvloeistof in specifieke hersengebieden van niet-verdoofde ratten. Begin met het fixeren van de verdoofde rat op een stereotaxische hersenzoeker en veeg het geschoren chirurgische gebied drie keer voor de operatie af met een povidonjodium en ethanoldoekje.
Maak vervolgens een schedelinsnijding van 1,5 centimeter in het midden met een chirurgische schaar en verwijder het periosteum met een chirurgische schaar en oogheelkundige tang. Gezien de bregma als de basale positie, doorboort u met behulp van een schedelboor het endocranium om een opening van twee millimeter te boren in het hippocampale CA1-gebied. Bevestig nu de katheterstilette op de grijper van een stereotaxische hersenzoeker en pas de positie van het microdialyseomhulsel aan op de anteroposterieure, mediolaterale en dorsale ventrale posities.
Pas de dorsoventrale klep van de hersenstereolocator aan en implanteer de microdialysebehuizing in het CA1-gebied op een diepte van 3,5 millimeter. Boor nog drie diafragma's met een diameter van twee millimeter, zodat de drie diafragma's een driehoek vormen waarin de sondeopening centraal is geplaatst. Implantaat schroeft in de openingen op een diepte van één millimeter en bevestigt de sondekatheter met tandcement.
Gebruik dan een 4-O chirurgische hechting om de huid te sluiten. Sluit de microspuit van de microdialysepomp aan op het ACSF-wekactiviteitsapparaat en de cryogene monstercollector volgens de instructies van de fabrikant. Om vervolgens de lucht in de pijpleiding af te voeren, stelt u de microdialysepomp in op een snelheid van één microliter per minuut.
Sluit vervolgens de pijplijn en de microdialysesonde van de hersenen aan en bedien de microdialysepomp met een snelheid van één microliter per minuut om ACSF in de sonde te injecteren totdat het oppervlak van de sonde licht vochtig is. Dompel de sonde onder in een heparinenatriuminjectieoplossing voor later gebruik. Om de HECF van de wakkere rat te verzamelen, plaatst u de hersenmicrodialysesonde in de sondekatheter en plaatst u de rat in een kamer met vulling om ervoor te zorgen dat de ratten vrij kunnen bewegen.
Schakel de meerkanaals draairegelaar in om te voorkomen dat de microdialysepijpleidingen tijdens de vrije beweging van de rat met elkaar verweven raken. Zet vervolgens de microsyringpomp aan en pomp de ACSF met een snelheid van één microliter per minuut. Na een equilibratie van 60 minuten van het microdialyse HECF-verzamelsysteem, verzamelt u HECF periodiek.
Neem na het beëindigen van de bemonstering de microdialysesonde van de hersenen uit de sondekatheter. Dompel de sonde gedurende 12 uur onder in gedeïoniseerd water en spoel met gedeïoniseerd water om gestrande zoutafzettingen uit de pijpleiding en de sonde te verwijderen. Verwijder de sonde en plaats deze in een 0,05% tripsin-oplossing bij vier graden Celsius.
Hippocampale extracellulaire vloeistof verkregen door de microdialysetechniek van de hersenen is waterachtig, kleurloos en transparant bij de ingestelde bemonsteringssnelheid. De belangrijkste procedures zijn het zorgvuldig implanteren van de microdialyse in het CA1-gebied en het inbrengen van de sonde in de popkatheter. De microdialyse-techniek maakt het mogelijk om de dynamische verandering van ziektemarkers in specifieke hersengebieden, de substantie van de werkzaamheid van het geneesmiddel en het weefselkatabolisme van medicijncomponenten te ondersteunen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor real-time dynamische bemonstering van de extracellulaire vloeistof in de hippocampus (HECF) van wakkeren ratten met behulp van een hersenmicrodialysetechniek. Dit proces stelt onderzoekers in staat om ziekte-specifieke markers bij centrale zenuwstelselaandoeningen te monitoren door continue bemonstering uit specifieke hersengebieden te verkrijgen zonder de proefpersonen te anesthetiseren.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Neurodegeneratieve ziekten
- Microdialysetechnieken
Achtergrond
- Het begrijpen van de dynamiek van extracellulaire vloeistoffen is essentieel voor het bestuderen van neuronale mechanismen en plasticiteit.
- Huidige methoden maken doorgaans gebruik van invasieve technieken die de biologische context kunnen beïnvloeden.
- Microdialyse maakt het mogelijk om interstitiële vloeistof te verzamelen terwijl het subject wakker is, wat relevantere gegevens oplevert.
- Dit protocol speelt in op de behoefte aan continue monitoring van de samenstelling van hersenvloeistof in levende modellen.
Doel van de studie
- Om de monitoring van ziekte markers in de hippocampus te verbeteren door de implementatie van een niet-invasieve bemonsteringsmethode.
- Om een gedetailleerd methodologisch kader te bieden waarmee onderzoekers de procedure kunnen repliceren.
- Om een betrouwbaar systeem op te zetten voor het observeren van drugseffecten en metabole veranderingen over tijd.
Gebruikte methoden
- De studie maakt gebruik van een microdialysesysteem dat is geïmplanteerd in de CA1-regio van de hippocampus.
- Wakkere, niet-gesedeerde ratten dienen als biologisch model voor het bemonsteren van HECF.
- De microdialysetechniek meet vloeistof met een snelheid van 1 µL per minuut.
- Kritieke stappen omvatten nauwkeurige implantatie van de katheter, equilibratie en regelmatige bemonsteringsintervallen.
- Na de bemonstering wordt de microdialyseprobe gereinigd om de integriteit van de gegevens te waarborgen.
Belangrijkste resultaten
- De verzamelde HECF is helder en kleurloos, wat de analyse van ziekte markers mogelijk maakt.
- Een diepgaande methodologie maakt experimenten mogelijk naar de dynamische veranderingen in neuronale omgevingen.
- Informatie verkregen uit deze methode kan helpen bij het beoordelen van de werkzaamheid van geneesmiddelen en het begrijpen van weefselkatabolisme.
Conclusies
- Deze studie demonstreert het potentieel van microdialyse bij het verbeteren van ons begrip van de vloeistofdynamica in de hersenen en ziekteprocessen.
- De mogelijkheid tot continue monitoring maakt het mogelijk om real-time veranderingen in drugwerking en metabole toestanden te beoordelen.
- Deze inzichten zijn cruciaal voor het verbeteren van strategieën om neurologische ziekten aan te pakken.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Real-time dynamische collectie van hippocampale extracellulaire vloeistof (HECF) bij bewuste ratten maakt directe monitoring mogelijk van neurochemische veranderingen die relevant zijn voor de progressie van CNS-ziekten en de effectiviteit van geneesmiddelen. Deze mogelijkheid vergroot het voorspellend vertrouwen in translationele neurowetenschappen door kwantitatieve, tijdsonderkende biomarkergegevens te leveren uit ziekte-relevante hersenregio's. De aanpak ondersteunt vroege ontdekking en mechanische risicoreductie voor neurotherapeutische portfolio's die zich richten op hippocampale pathways.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Target Validatie
- Maakt onderzoek mogelijk naar de neurochemische dynamiek die ten grond ligt aan mechanismen van CNS-ziekten in vivo.
- Ondersteunt functionele targetvalidatie door de effecten van geneesmiddelen en metabolieten in de hippocampus te kwantificeren.
- Faciliteert mechanische risicoreductie door directe meting van ziekterelevante extracellulaire markers.
Screening & Assayontwikkeling
- Biedt gevalideerde, kwantitatieve bemonstering van de extracellulaire vloeistof in de hersenen voor downstream screening van verbindingen.
- Maakt reproduceerbare, gestandaardiseerde verzameling van neurochemische gegevens in waakdier-modellen mogelijk.
- Ondersteunt de ontwikkeling van assays voor het evalueren van farmacodynamische responsen op CNS-actieve verbindingen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Rijgt preklinische biomarkermetingen uit met ziekte-relevante eindpunten in de translationele neurowetenschappen.
- Maakt continuïteit mogelijk van ontdekking tot preklinische validatie door dynamische drug-effecten in vivo te volgen.
- Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen over voortgang op basis van neurochemische read-outs in real-time.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze microdialysemethode integreert in het continuüm van ontdekking naar preklinisch onderzoek door real-time, kwantitatieve analyse van de extracellulaire vloeistof in de hippocampus van bewuste ratten mogelijk te maken.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking voor CNS-doelen door dynamische biomarkerwijzigingen te monitoren.
- Screening: Levert assay-ready, reproduceerbare neurochemische gegevens voor de evaluatie van verbindingen.
- Analytics: Levert kwantitatieve output voor het vergelijken van drugseffecten en ziektestatus over verschillende experimentele condities.
- Translationeel Onderzoek: Slaat een brug tussen preklinische en translationele studies door biomarkermetingen af te stemmen op klinische eindpunten.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een herbruikbaar platform voor CNS-drugdiscovery en workflows voor biomarkervalidatie.
Operationele en organisatorische impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij de validatie van CNS-doelwitwitjes.
- Operationele waarde: Standaardiseert neurochemische bemonstering en verbetert de reproduceerbaarheid tussen studies.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen en kapitaalefficiëntie door het leveren van bruikbare biomarkergegevens.
- Impact op portfolio: Maakt risicogebaseerde prioritering van neurotherapeutische kandidaten mogelijk op basis van dynamisch in vivo bewijs.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in stereotaxische chirurgie en implantatie van microdialyseprobes.
- Vereist gespecialiseerde instrumentatie voor microdialysebemonstering en kwantitatieve analyse.
- Vereist standaardisatie van bemonsteringssnelheden en analytische protocollen over teams heen.
- Aanpassing aan verschillende hersenregio's of ziektemodellen kan protocoloptimalisatie vereisen.
- Bemonstering is beperkt tot analyten onder de 20 kDa vanwege de cutoff-specificaties van de probe.
Veelgestelde vragen over biopharma
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:44
Brain Microdialysis Probe Implantation Surgery
2:24
Microdialysis System Connection and Probe Check
3:15
Collection of Hippocampal Extracellular Fluid (HECF) from the Awake Rat
4:02
Maintenance of the Microdialysis System and Devices After Sampling
4:36
Results: Analysis of HECF Collected Using the Microdialysis Sampling Equipment
4:54
Conclusion
