Autofluorescentie beeldvorming om de fysiologie van rode algen te evalueren

Dit confocale microscopische protocol zal de interpretatie van het ecologische gedrag en de aanpassingen van microalgen uit extreme omgevingen met langzame groei in het laboratorium mogelijk maken met behulp van autofluorescentie van hun pigmenten. Deze techniek is niet invasief en minimaliseert artefacten omdat chemische verbindingen niet worden gebruikt. Het kennen van de prestaties van pigmenten van autotrofen en de bijbehorende groei zal het ontwerpen van de controlemethoden mogelijk maken die het grootste belang hebben voor toeristische grotten en architecturale monumenten.

Begin met het bereiden van het entmateriaal van Chroothece mobilis door het over te brengen van de agarcultuur naar het zeewatermedium of swes vloeibaar medium. Houd alle culturen gedurende twee weken met een 16 tot 8 licht donkere fotoperiode bij 20 graden Celsius onder een lage witte lichtintensiteit en zonder schudden totdat de gewenste celdichtheid is verkregen. Gebruik één milliliter van de exponentiële fasecultuur met vijf keer 10 tot de derde cellen per milliliter celdichtheid om te enten in een 24-putplaat voor verschillende experimenten.

Om het monochromatische lichteffect te reproduceren, gebruikt u het groene filter dat groen licht doorlaat van 470 tot 570 nanometer met een piek op de golflengte van 506 nanometer en rood licht aangepast met behulp van een filter tussen 590 en 720 nanometer en piekt op 678 nanometer. Stel de celculturen gedurende twee weken bloot aan dit licht. Schakel alle componenten van de omgekeerde confocale laserscanmicroscoop in, inclusief de laser.

Monteer de cellen in het SWES-groeimedium van elke experimentele put van de 24-putplaat op een glazen bodemschaal van 35 millimeter voor beeldvorming. Kies het 63X of 1.30 numerieke diafragma of NA glycerol onderdompelingsobjectief en plaats glycerol over de lens. Plaats vervolgens de putplaat op het microscooppodium en zorg ervoor dat het monster niet beweegt tijdens de beeldacquisitie.

Centreer het monster in het lichtpad en focus op het midden van de cel door het vlak met de hoogste fluorescentie-intensiteit te selecteren. Als u klaar bent, opent u de beeldacquisitiesoftware en kiest u XY lambda in de vervolgkeuzelijst in de acquisitiemodus. Selecteer de excitatielijn van de laser 561 nanometer, acht bits dynamisch bereik en 1024 bij 1024 pixels.

Verzamel de fluorescentie-emissiespectra in de bandbreedte van 10 nanometer en de lambdastapgrootte van vier nanometer binnen het bereik van 570 tot 760 nanometer. Zet het gaatje op één luchtunit en voer de lambdascan uit. Nadat u dit proces in verschillende gezichtsvelden en onder de verschillende omstandigheden van rode en groene lichten hebt herhaald, slaat u alle gegevens op.

Zodra de lambdascan is verkregen, klikt u op het kwantificeervenster bovenaan de software om de verzamelde fluorescentie-emissiespectra te evalueren. Ga naar het geopende projectvenster en selecteer één XY lambda-bestand. Selecteer gestapelde profielanalyse in de beeldvormingssoftware en definieer een interessegebied van vier micrometer vierkant in het midden van een cel om de gemiddelde fluorescentie-intensiteit te analyseren.

Exporteer de gegevens en het CSV-bestand voordat u het proces herhaalt met verschillende cellen onder verschillende omstandigheden. Open vervolgens de CSV-bestanden om de verschillende fluorescentie-emissiepieken van alle gemeten interessegebieden te selecteren door de maximale fluorescentiegegevens van respectievelijk fycoerythrin phycocyanobilin, C.phycocyanine, allophycocyanine en chlorofyl A in het CSV-bestand te selecteren. Als u klaar bent, maakt u een nieuwe tabel met alle maximale fluorescentiewaarden die zijn verkregen uit elke fycobiliproteïne- en chlorofylpiek en plot u de gegevens in een grafiek.

Er werden significante verschillen in gemiddelde fluorescentie-intensiteit waargenomen. De gemiddelde fluorescentie-intensiteit van phycoerythrin phycocyanobilin nam aanzienlijk af wanneer de cellen werden blootgesteld aan monochroom groen licht. Daarentegen werd geen verschil waargenomen in rood licht in vergelijking met de controle.

Het groene licht had het tegenovergestelde effect op allophycocyanine en chlorofyl A, waarbij de gemiddelde fluorescentie-intensiteit aanzienlijk toenam als gevolg van de aanpassing van antennecomplexen als gevolg van een verhoogde hoeveelheid of verbeterde connectiviteit van onder andere de antennecomplexen. Het rode licht produceerde een niet-significante toename van allophycocyanine en chlorofylfluorescentie. Om het effect van verschillende groeiomstandigheden op cellen in cultuur te bestuderen, is het cruciaal om de metingen uit te voeren met precies dezelfde microscoopinstellingen.

Het is mogelijk om andere omgevingsparameters te analyseren die relevant zijn voor de cultuur van autofluorescentie-organismen, evenals het fluorescentiesignaal binnen het zichtbare spectrum. Deze techniek is een zeer krachtige benadering van een studie van levensorganismen met verschillende autofluorescentiepigmenten.