Gene digitale circuits op basis van CRISPR-Cas-systemen en anti-CRISPR-eiwitten

Ons protocol legt uit hoe digitale gistgencircuits kunnen worden ontworpen, gebouwd en geanalyseerd die gebruikmaken van type twee en type vijf CRISPR dCas-systemen en de bijbehorende anti-CRISPR-eiwitten. Het blijft assembleren omdat het nul standaardprocedures verzamelt om synthetische transcriptionele netwerken in services samen te stellen en te testen. Bereid om te beginnen een reactiemengsel voor met 20 tot 40 nanogram DNA-sjabloon, één microliter voorwaartse primer, één microliter omgekeerde primer, vijf microliter DNTP-mix, 0,5 microliter DNA-polymerase, 10 microliter 5x DNA-polymerasereactiebuffer en dubbel gedestilleerd water tot een totaal volume van 50 microliter.

Amplificeer de DNA-sequenties met behulp van het touchdown PCR-programma op een thermocycler zoals beschreven in het manuscript. Isoleer de PCR-producten via gel-elektroforese en verdun de DNA-sequenties uit de agarosegel via een DNA-gelextractiekit. Gebruik de Gibson-assemblagemethode om de gezuiverde PCR-producten in de opengesneden shuttlevector te plaatsen door het equimolaire DNA-mengsel gedurende een uur bij 50 graden Celsius binnen te laten.

Construeer de dCas12a accepter vector via touchdown PCR en de Gibson assemblagemethode zoals eerder gedemonstreerd. Breng de voor gistcodon geoptimaliseerde dCas12a-eiwitten in de twee nieuw geconstrueerde acceptorvectoren in via vertering met BamH1 en Xhol1 en ligatie met T4 DNA-ligase. Construeer op dezelfde manier de plasmiden op basis van de pRS2403-shuttlevector om de anti-CRISPR-eiwitten tot expressie te brengen via touchdown PCR en de Gibson-assemblagemethode.

Om microscopieceldetectie uit te voeren, plaatst u twee microliter van de celoplossing op een glazen dia en bedekt u deze met een afdekslip. Observeer de cellen onder een fluorescentiemicroscoop door de fluorescerende lichtbron, microscoop en computer in te schakelen. Nadat u het nummer van de fluorescerende lichtbron hebt genoteerd, opent u de microscoopsoftware op de computer.

Plaats de dia op het microscooppodium en kies de 40x objectieflens terwijl u de cellen onder het groene licht observeert. Beweeg de scherpstelknop totdat de contour van gistcellen verschijnt en de fijne scherpstelknop om de cellen scherp te stellen. Om de cellen te detecteren, schakelt u na het sluiten van het gezichtsveld van de microscoop naar het computerscherm en klikt u op live.

Wacht drie tot vijf seconden. Klik op vastleggen om een foto te maken en de foto op te slaan. Schakel vervolgens de computer, microscoop en fluorescerende lichtbron uit.

Schakel de FACS-machine 20 minuten voor de metingen in om de laser op te warmen en meng 20 microliter van de celcultuur met 300 microliter dubbel gedestilleerd water. Voer de FACS-software uit op de computer die is aangesloten op de FACS-machine en maak een nieuw experiment. Stel vervolgens de meetparameters in.

Selecteer vervolgens het filter op basis van de excitatie- en emissiegolflengten van de monsters en stel het acquisitiecelnummer in op 10.000. Pas de FITC-filterspanning aan door de intensiteit van fluorescerende kralen te meten, waarbij u ervoor zorgt dat het relatieve verschil in de intensiteit van de kralen tussen twee opeenvolgende experimenten niet groter is dan 5% Was de machine een paar seconden met dubbel gedestilleerd water om eventuele overtollige kralen te verwijderen. Meet de fluorescentie-intensiteit van het monster en klik op voorbeeld terwijl u drie tot vijf seconden wacht op de stabiliteit van de monsterinjectie.

Klik ten slotte op verwerven. Meet de kralen opnieuw aan het einde van het experiment. Nadat u hebt gecontroleerd of het relatieve verschil tussen de twee kralenmetingen groter is dan 5%Exporteer de FACS-gegevens als FCS-bestanden.

Open R studio en laad het script BDverse_analysis. R om de FCS-bestanden te analyseren. Stel de experimentnaam in als ename, het mappad waar de FCS-bestanden worden opgeslagen als dir_d en de resultaatbestanden worden gemaakt als dir_r.

Stel vervolgens het fluorescentiekanaal in. Stel het aantal monsters in dat is gemeten. De afmetingen van puntplots en de maximale lengte van de x- en y-as voor staafplots en boxplots.

Kies de beoordelingsmethode door de hashtag van de bijbehorende regels te verwijderen. Selecteer het object flowSet gated dat overeenkomt met de gekozen gatingmethode en de dot plot-resolutie, die ten minste gelijk moet zijn aan 256. Verwijder het commentaar op de twee filterinstructies om metingen te verwijderen waar fluorescentie negatief is en om uitschieters te verwijderen als gevolg van andere experimenten zoals beschreven in het manuscript.

Druk op source en voer het script uit. Alle bestanden met de resultaten van de analyse worden in dir_r gemaakt. De beste activeringsefficiëntie van dSpCas9-VP64 werd bereikt wanneer er zes lexOp-doelsites op de synthetische promotor waren.

Terwijl voor dCas12a-VPR de hoogste activeringsefficiëntie wanneer drie exemplaren van lexOp in de synthetische promotor werden geplaatst. De activering door CRISPR-RNA en single guide RNA op een integratief plasmide was 1,4 tot 2,4 en 1,1 tot 1,5 keer hoger dan wanneer het op een episomaal plasmide werd geplaatst. RT-qPCR-resultaten toonden aan dat een episomale vector een veel hoger niveau van single guide RNA CRISPR RNA produceerde dan de integratieve vector, ongeacht het expressiesysteem.

De activeringsefficiëntie van de complexe dSpCas9 en scaffold RNA rekrutering MCP-VP64 werd getest. Het scaffold RNA met een enkel wild type en F6MS2 haarspeld gaf respectievelijk een 5,27 en een 4,3 voudige activatie. De combinatie van de twee haarspeldbochten resulteerde echter in een 7,54-voudige met de hoogste activeringsefficiëntie.

Vier verschillende promotors werden gebruikt om de expressie van drie soorten type twee anti-CRISPR aan te sturen, waaruit bleek dat ze op een dosisafhankelijke manier werkten. Een sterke promotor verlaagde het fluorescentieniveau tot respectievelijk 0,21, 0,11 en 0,13 van de waarde. De titratiecurve laat zien dat het circuit zich gedraagt als een knoopgang met een aan/uit-verhouding van bijna 2,3.

Het type vijf anti-CRISPR A vermindert de fluorescentie-expressie van zowel denAS-Cas12a als dLB-Cas12a als activatoren van 19% tot 71%De relatie tussen activatoren en repressoren werd bestudeerd waarbij de Acr-VA grote fluctuaties in zijn prestaties vertoonde wanneer geproduceerd door pGAL1 onder pTEF1 en genetische CYC1t-pCYC1noTata type vijf anti-CRISPR-A1 vertoonde enige repressie op de kale dLB Cas12a alleen. De FACS-machine is kwetsbaar en moet daarom zorgvuldig worden behandeld. De celoplossing mag nooit te dicht zijn en de machine moet schoon worden gehouden.