Beoordeling van de vermeende anticryptokokkeneigenschappen van ruwe en geklaarde extracten van weekdieren

Dit protocol maakt de isolatie van verbindingen uit weekdieren met anti-cryptokokkeneigenschappen mogelijk. Deze techniek biedt een onbevooroordeelde benadering om verbindingen uit weekdieren met potentiële eigenschappen te identificeren en te isoleren, waaronder het doden van de menselijke schimmelpathogenen. Er zijn andere verbindingen, zoals HIV-proteaseremmers, die worden gebruikt om HIV-patiënten te behandelen.

Uitbreiding naar andere pathogenen, evenals het onderzoeken van natuurlijke bronnen, vertegenwoordigt echter nieuwe wegen van ontdekking. De laatste stap is de moeilijkste stap, omdat de monsters mogelijk niet worden gefilterd. Als gevolg hiervan moeten monsters mogelijk worden verdund voor filtering.

Begin met het verzamelen van weekdieren zoals Cipangopaludina chinensis uit een aangewezen en goedgekeurd natuurgebied. Selecteer inheemse en invasieve soorten om een breed scala aan potentiële antischimmeleffecten te beoordelen. Breek voorzichtig de schaal van de C.chinensis met een stamper en vijzel en verwijder de vaste stukken met een pincet.

Over het algemeen worden 10 weekdieren samengevoegd voor het protocol. Verzamel en weeg ongeveer 15 tot 20 gram van het monster en gebruik een schaar om de organen in kleine stukjes van ongeveer 0,5 tot een centimeter groot te knippen. Bevries de ontleedde en gesneden orgaanmonsters met vloeibare stikstof voordat u de orgaanmonsters tot een fijn poeder maalt met behulp van een stamper en vijzel.

Voeg als u klaar bent ongeveer 15 gram van het orgaanmonsterpoeder toe aan 30 milliliter koud gedestilleerd water om een verhouding van één tot twee te bereiken. Giet twee milliliter van het monster in high impact twee milliliter buizen en voeg ongeveer 500 microgram van drie millimeter roestvrijstalen kralen toe aan elke buis. Homogeniseer gedurende drie minuten bij 1.200 RPM in vier graden Celsius met behulp van een kogelblender of kralenklopper.

Centrifugeer de buis op 12.000 G gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius. Verzamel het supernatant in een verse buis van 50 milliliter en gooi de pellet weg. Filter steriliseer het supernatant met behulp van een membraan van 0,22 micrometer en bewaar de monsters op ijs voordat u het extract klaarmaakt.

Plaats het supernatantmonster gedurende 30 minuten in een thermaal bad bij 60 graden Celsius en koel het onmiddellijk af door het monster gedurende 20 minuten over te brengen in een emmer gevuld met ijs. Centrifugeer de koude monsters bij 15.000 G gedurende 45 minuten bij vier graden Celsius. Verzamel het supernatant in een verse buis van 50 milliliter en gooi de pellet weg.

Filter steriliseer de monsters met behulp van een membraanfilter van 0,22 micron en bewaar ze vervolgens op ijs. Als u klaar bent, bepaalt u de eiwitconcentratie in de ruwe en de geklaarde extracten met behulp van een kwantificeringstest. Het optimale eiwitconcentratiebereik is vier tot acht microgram per milliliter.

Incubeer de monsters op ijs gedurende maximaal een uur of bevries ze in vloeibare stikstof voordat ze bij min 20 graden Celsius worden bewaard totdat ze nodig zijn. Incubeer in een 96-well vlakke bodemplaat 10 microliter van vier milligram per milliliter ruw of geklaard weekdiereiwitextract, 10 microliter subtilisine A, met een concentratie binnen het gemeten lineaire bereik, en 220 microliter 100 millimolar tris hydrochloride van 8,6 pH gedurende 10 minuten bij 25 graden Celsius. Voeg vervolgens 10 microliter N-succinyl-alanine, alanine, proline, fenolanine, p-nitroaniline, het substraat voor subtilisine A, toe in een eindconcentratie van één KM voor een eindreactievolume van 250 microliter.

Als u klaar bent, meet u de enzymatische activiteit door de optische dichtheid elke 15 seconden gedurende drie minuten op 405 nanometer te controleren. Zorg ervoor dat de putjes zonder extracten een rechte curve produceren tijdens het aflezen. Om de resterende enzymatische activiteit te bepalen, berekent u de verhouding tussen enzymatische activiteit in aanwezigheid van weekdierextract en die in afwezigheid van het extract.

Als remmende activiteit wordt waargenomen, meet dan de remmende concentratie 50 of IC50-waarde met behulp van een reeks concentraties van de extracten. Introduceer een enkele kolonie C.neoformans H99 wild type in vijf milliliter gistextract, pepton, dextrose of YEPD-medium met behulp van een pipetpunt van 10 microliter en incubeer gedurende 16 tot 18 uur bij 30 graden Celsius en 200 RPM. Verzamel 500 microliter van de cultuur in een cuvette en meet de groei door de optische dichtheid op 600 nanometer af te lezen.

Verdun de cultuur met giststikstofbase of YNB-medium tot een uiteindelijke optische dichtheid van 0,02. Co-cultuur C.neoformans cellen met verschillende concentraties van ruwe en geklaarde extracten door het mengen van 10 microliter van de extracten met 190 microliter van de verdunde C.neoformans cultuur in een 96-well plaat. Meet de groei door de optische dichtheid op 600 nanometer af te lezen met behulp van een plaatlezer elke 15 minuten tot een uur gedurende 72 uur bij 200 RPM en 37 graden Celsius.

De extracten van C.chinensis waren in staat om de proteolytische activiteit van subtilisine A te remmen, die gerelateerd is aan virulentie in Cryptococcus neoformans met een IC50-waarde van 5,3 microgram per milliliter in ruwe extracten en 4,53 microgram per milliliter in geklaarde extracten. De beoordeling van de C.chinensis-extracten tegen processen geassocieerd met de virulentiefactorproductie van C.Neoformans, inclusief schimmelgroei, toonde aan dat er een significante vermindering van de schimmelgroei was bij 37 graden Celsius in aanwezigheid van de ruwe en geklaarde C.chinensis-extracten. De beoordeling van de extracten tegen capsule, melanineproductie en de vorming van biofilms toonde aan dat er geen veranderingen waren in de productie van capsules of melanine in de aanwezigheid van ruwe of geklaarde C.chinensis-extracten.

Er werd echter een significante vermindering van 70 tot 80% in biofilmvorming waargenomen bij hoge concentraties van de ruwe en geklaarde extracten ten opzichte van de onbehandelde controle. Het succes van het protocol hangt af van de juiste extractieprocedure, inclusief malen, de toevoeging van de juiste hoeveelheid enzym en gewoon lezen na de toevoeging van het substraat. De techniek richt zich op thermische tolerantie als een belangrijke cryptokokkenvirulentiefactor.

Andere virulentiefactoren kunnen echter worden beoordeeld, zoals melanine- en capsuleproductie, evenals biofilmvorming. Deze resultaten openen nieuwe wegen die nieuwe benaderingen vormen voor antischimmelstrategieën met behulp van natuurlijke verbindingen die meer stabiliteit en specificiteit bieden en minder vatbaar zijn voor resistentie. Het doel op lange termijn is om nieuwe methoden te vinden tegen deze schimmelpathogenen en resistentiemechanismen te minimaliseren.