Populatie- en eencellige analyse van antibioticapersistentie in Escherichia coli

Het hier beschreven protocol biedt een integratieve methode die klassieke microbiologische assays combineert met single-cell live imaging om Escherichia coli persistercellen te karakteriseren na behandeling met een hoog ofloxacinegehalte. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is het analyseren van persistentiefenomeen op populatie- en eencellig niveau. Het combineren van populatie- en eencellige analyse maakt de moleculaire en cellulaire karakterisering van het persistentiefenotype mogelijk.

Om te beginnen, streep de bacteriestam van belang van een bevroren glycerolvoorraad op een LB-agarplaat en incuber 's nachts bij 37 graden Celsius gedurende een periode van 15 tot 19 uur om enkele kolonies te verkrijgen. Ent een geïsoleerde kolonie in een glazen buis met vijf milliliter MOPS-groeimedium aangevuld met 0,4% glucose en voeg, indien nodig, een selectief antibioticum toe aan het medium. Plaats de buis in een schuddende incubator bij 37 graden Celsius en 180 tpm 's nachts.

Centrifugeer de volgende dag een milliliter cultuur van 2.300 g gedurende drie minuten om de cellen te pelleteren en resuspensie van de pellet voorzichtig met hetzelfde volume PBS. Meet de OD op 600 nanometer en bereken het volume dat nodig is voor een initiële OD600 van 0,01 in een eindvolume van twee milliliter. Voeg vervolgens twee milliliter MOPS-glycerol 0,4% medium toe aan een put met een transparante bodem, 24-putplaat en ent met het berekende nachtelijke kweekvolume.

Plaats de 24-putplaat in een geautomatiseerde microplaatlezer om de OD600 gedurende 24 uur te bewaken. Stel de microplaatlezer in om de OD600 elke 15 minuten te meten bij een temperatuur van 37 graden Celsius en met een hoge omlooprotatie van 140 tpm. Smelt 100 milliliter LB-agar en bewaar de kolf op 55 graden Celsius om stolling te voorkomen.

Bereid zes kleine glazen kolven en pipetteer vijf milliliter vloeibaar LB-agarmedium in elke kolf met behulp van een steriele pipet. Neem 10 microliter van de vijf milligram per milliliter loxacine stockoplossing en verdun in 90 microliter ultrapuur water. Voeg toenemende volumes van de verdunde ofloxacine toe aan elk van de zes glazen kolven met LB-agarmedium om een eindconcentratie van nul tot 0,1 microgram per milliliter ofloxacine te krijgen.

Meng de oplossing door de kolven meerdere keren te draaien en giet de met antibiotica toegevoegde LB-agarmedia in een kweekplaat met zes putten. Laat de agar afkoelen tot het stolt en droog de plaat voor gebruik. Verdun een nachtelijke bacteriecultuur tot een uiteindelijke celdichtheid van één maal 10 tot de zevende CFU per milliliter met PBS.

Spot twee microliter verdund cultuur op elk putje van de gedroogde zesputplaat. Laat de vlekken drogen voordat je de plaat een nacht in een couveuse bij 37 graden Celsius plaatst. Controleer de volgende dag bij welke ofloxacineconcentratie de groei van bacteriekolonies wordt geremd.

Giet ongeveer 25 milliliter van de bereide LB-agar in een petrischaal. Voeg vervolgens vijf tot acht steriele glaskralen toe aan elke gestolde en gedroogde plaat. Keer de platen om en label ze.

Bereid vervolgens tienvoudige seriële verdunningsglasbuizen voor die 900 microliter 0,01-molaire magnesiumsulfaatoplossing bevatten. Verdun in een glazen buis een nachtcultuur in vers en temperatuuraangepast medium tot een uiteindelijke OD600 van ongeveer 0,001 en laat de cultuur 's nachts in een incubator groeien. De volgende dag, wanneer de OD600 0,3 bereikt, brengt u 100 microliter van de cultuur over voor verdunning volgens de spottestgegevens.

Voer een tienvoudige seriële verdunning van de bacteriecultuur uit. Plaat vervolgens 100 microliter van de verdunde cultuur op de bereide LB-agarplaten. Voeg de gewenste concentratie ofloxacine toe aan de bacteriecultuur en blijf tijdens het schudden incuberen bij 37 graden Celsius.

Trek op relevante tijdstippen 100 microliter van de cultuur op en verdun de cultuur dienovereenkomstig met de spottestgegevens. Plaat 100 microliter van de verdunde cultuur op de LB agar platen. Tel de volgende dag de kolonies van de 's nachts geïncubeerde platen bij de twee hoogste verdunningen waarvoor kolonies kunnen worden gedetecteerd.

Bereken de overlevingsratio door de CFU per milliliter op elk tijdstip op de CFU per milliliter bij T0 te normaliseren en plot de log base 10 genormaliseerde waarde als functie van de tijd. Verwijder de conserveringsoplossing uit elk putje van de microfluïdische plaat en vervang deze door vers kweekmedium. Sluit de microfluïdische plaat af met het spruitstuksysteem door op de sealknop te klikken of via de microfluïdische software.

Voer vervolgens op de microfluïdische software-interface een eerste priming-sequentie uit door op Run Liquid Priming Sequence te klikken. Incubeer de plaat in een thermostatisch geregelde kast van de microscoop bij 37 graden Celsius gedurende minimaal twee uur voordat u begint met de microscopie. Start vervolgens een tweede Run Liquid Priming Sequence voordat u met het experiment begint.

Sluit de microfluïdische plaat af door op Unseal Plate op de microfluïdische software-interface te klikken. Vervang het medium in de putjes door 200 microliter vers medium, antibioticum bevattend vers medium en 0,01 OD verdund cultuurmonster in het verse medium. Na het afdichten van de microfluïdische plaat zoals eerder gedemonstreerd, plaatst u de plaat op het microscoopobjectief in de microscoopkast.

Klik in de microfluïdische software op de Run Cell Loading Sequence om het laden van de cellen in de microfluïdische plaat mogelijk te maken. Stel een optimale focus in met behulp van de doorgelaten lichtmodus en selecteer verschillende interessante gebieden waar een geschikt celaantal van maximaal 300 cellen per veld kan worden waargenomen. Bewerk in de microfluïdische software de Run a Custom Sequence om de injectie van vers medium bij 6,9 kilopascal gedurende zes uur te programmeren naar putjes één en twee, gevolgd door het medium met antibioticum bij 6,9 kilopascal of zes uur naar goed drie, en ten slotte het verse medium met 6,9 kilopascal gedurende 24 uur naar putjes vier en vijf.

Voer microscopiebeelden uit in time-lapse-modus met één frame om de 15 minuten met behulp van doorgelaten licht en de excitatielichtbron voor de fluorescerende reporter en start het microfluïdische programma. Open de ImageJ- of Fiji-software op de computer en sleep de hyperstack time-lapse-microscopieafbeeldingen naar de Fiji-laadbalk. Gebruik Afbeelding, gevolgd door Kleur en vervolgens Samengesteld maken om de verschillende kanalen van de hyperstack samen te voegen.

Gebruik Afbeelding, Kleur en vervolgens Kanalen rangschikken als de kanalen niet overeenkomen met de gewenste kleur. Open de MicrobeJ-plug-in en detecteer de bacteriële cellen met behulp van de handmatige bewerkingsinterface. Verwijder de automatisch gedetecteerde cellen en schets de persistercellen handmatig frame voor frame.

Gebruik na detectie het pictogram Resultaat in de handmatige bewerkingsinterface van MicrobeJ om een ResultJ-tabel te genereren. Gebruik de tabel ResultJ om inzicht te krijgen in de verschillende parameters van de eencellige analyse en sla het ResultJ-bestand op. De MIC van ofloxacine voor beide stammen werd vastgesteld op 0,06 microgram per milliliter, wat aangeeft dat de hupA-mCherry-fusie de gevoeligheid van ofloxacine niet beïnvloedde in vergelijking met de isogene wild-type stam.

De spottest toonde geïsoleerde klonen met geschikte verdunningen in de loop van de tijd, bijvoorbeeld 10 tot de negatieve vijfde verdunning op tijdstip nul. In de time-kill assay werd een typische bifasische curve waargenomen waarbij de eerste helling de snelle dood van de niet-persisterende populatie weerspiegelt. De tweede fase toonde een langzamer dodingspercentage, wat de aanwezigheid van drugstolerante persistercellen onthulde.

Met name de time-kill curve laat zien dat het hupA-mCherry fusie-eiwit de time-kill kinetiek niet beïnvloedde. In het microfluïdische experiment geeft de eerste groeifase aan dat cellen levensvatbaar waren en zich deelden vóór de behandeling met ofloxacine. Na deze eerste groeifase werd de celdeling geblokkeerd zodra het antibioticum de cellen bereikte.

Na behandeling met ofloxacine, na perfusie met vers medium, was de overgrote meerderheid van de cellen niet in staat om de groei te hervatten. Daarentegen kan een kleine subpopulatie uitrekken en filamenteuze cellen genereren, die worden gedefinieerd als de persistercellen. Het delende persisterfilament genereerde meerdere dochtercellen, waarvan de meeste op dezelfde manier begonnen te groeien en delen als onbehandelde cellen.

De toename van de cellengte correleerde met een toename van de totale mCherry-fluorescentie-intensiteit, die de replicatieherstart en een toename van de nucleoïde-abundantie weerspiegelt. Bij het gebruik van een stam met een intracellulaire reporter om persistentie te bestuderen, is het imperend dat de aanwezigheid van de reporter de groei, MIC en het doden niet verstoort in vergelijking met een wildtype stam. De hier beschreven procedure kan worden toegepast op andere aandoeningen en bacteriesoorten om cellulaire reacties op veranderende omgevingen of stress te controleren.

Door andere fluorescerende reporters in een identieke opstelling te gebruiken, kunnen nieuwe inzichten in de fysiologie van persistercellen worden onderzocht.