Teken kunstmatige membraanvoeding voor Ixodes scapularis

Hoewel kunstmatige membraanvoeding al eerder is gedaan, is ons protocol eenvoudiger in te stellen en aan te passen aan andere tekensoorten met enkele aanpassingen. Het belangrijkste voordeel van kunstmatige membraanvoeding is dat het blootstelling aan ziekteverwekkers en behandelingen mogelijk maakt die mogelijk niet haalbaar zijn via diervoeding. Dit kunstmatige membraanvoedingssysteem kan worden toegepast op andere geleedpotige soorten met enkele tests voor ideale fagostimulantia en modificaties op ideale membraandikte.

Het produceren van de juiste membraandikte vereist enige oefening. Zorg ervoor dat u een micrometer gebruikt om de dikte op verschillende locaties op het membraan te meten. Benjamin Cull, een postdoc in ons laboratorium, zal me helpen om de procedure te demonstreren.

Veeg om te beginnen een plat, niet-poreus oppervlak af, zoals een ruit van glas of keramisch gecoate metalen basis van een armstandaard met 70% ethanol en bedek het vervolgens met een enkele laag plasticfolie. Zorg ervoor dat de plasticfolie plat is en zonder bubbels of rimpels. Plak 100% rayon lensreinigingspapier vast op het voorbereide oppervlak.

Zorg ervoor dat het plat en enigszins strak is met tape over alle vier de zijden van het papier. Bereid het 0010 hardheid siliconenmengsel door vijf milliliter van elk deel van de siliconenkit in een wegwerpcontainer te meten. Meng de twee vloeistoffen lichtjes en voeg 1,5 milliliter hexaan toe.

Blijf mengen totdat het mengsel homogeen en grondig gemengd is. Gebruik een kleine wisser om het siliconenmengsel over het lenspapier te verdelen en laat het een minuut staan om ervoor te zorgen dat de siliconen in het lenspapier zijn gedrenkt. Schraap gestaag de overtollige siliconen naar de zijkant met de wisser met behulp van een kleine hoeveelheid neerwaartse druk.

Voer een tweede pass uit met de wisser zonder de neerwaartse druk uit te oefenen om eventuele lijnen siliconen te verwijderen en een gladde laag te produceren. Alleen voor larven dompelt u de bovenkant van de voedingskamer meerdere keren in Fluon fluorpolymeerhars, zodat deze tussen de toepassingen kan drogen om een consistente laag te produceren. Laat het membraan minstens 24 uur uitharden in een stofvrije omgeving zoals een gesloten chemische of bioveiligheidskast.

Meng vervolgens gelijke delen siliconenmengsel A en B om het siliconenmengsel met 30 hardheid te bereiden om de kamers aan het membraan te bevestigen. Dompel de polycarbonaatkamers ongeveer een kwart centimeter in het siliconenmengsel en plaats ze vervolgens op het membraanvel, waarbij u ervoor zorgt dat geen van de tapes wordt overlapt. Laat de hechtende siliconen minstens 24 uur uitharden.

Snijd met behulp van een scalpel voorzichtig het membraan rond elk van de bevestigde kamers en snijd de randen af zodat het soepel in een put van de zes putplaat past zonder veel schrapen aan de zijkanten. Laat voldoende materiaal buiten de kamer om de toevoeging van het membraan te maximaliseren. Snijd een klein stukje van het overgebleven membraan uit elke hoek en het midden van het membraanvel.

Verwijder de plasticfolie van elk stuk en meet de stukken met een micrometer om de gemiddelde membraandikte te bepalen. Plaats de voedingskamers samen met één O-ring per kamer in een glazen bekerglas dat gedurende ten minste 20 minuten bij 121 graden Celsius moet worden geautoclaveerd om te steriliseren. Laat de kamers afkoelen voordat u ze gebruikt.

Nadat u de vooraf bereide, geautoclaveerde membraankamers hebt verwijderd en de O-ring eromheen hebt geplaatst, vult u elke kamer met voldoende 70% ethanol om het membraan te bedekken. Laat het vijf minuten in een zesputtenplaat zitten en zoek dan naar eventuele lekken tussen de kamer en het membraan en in het membraan zelf. Leeg de ethanol uit de kamers en laat het vervolgens aan de lucht drogen in een bioveiligheidskast of laminaire stromingskap.

Om het complement in het bloed te verwarmen en te activeren, verwarmt u het gedurende 40 minuten op 56 graden Celsius en vult u mechanisch gedefibrilleerd runderbloed aan met twee gram per liter glucose. Zodra het membraan droog is, brengt u ongeveer 20 microliter phagostimulant aan op de binnenkant van de kamer en kantelt u de kamer om deze over het oppervlak te verspreiden. Wanneer de fagostimulant droog is, voegt u de teken snel toe aan de kamer met een borstel of een tang.

Sluit de bovenkant af met parafilm omdat de warmte van het waterbad ervoor kan zorgen dat deze scheurt. Voeg vervolgens vijf milliliter van de warmte en geactiveerd bloed per put of kamer toe aan een conische buis en plaats het in het waterbad dat is ingesteld op 36 graden Celsius. Voeg vijf microliter drie millimolaire ATP en 50 microliter 100X voorraad penicilline streptomycine fungizone per vijf milliliter bloed toe aan de buis en breng 4,5 milliliter van het bloed over in een put van een zes putplaat.

Plaats de kamer voorzichtig in de put en pas de O-ringhoogte op de kamer aan, zodat het membraan in het bloed zit, maar de bloedspiegel rond de zijkant niet over de put heen komt. Plaats vervolgens de put in het bloed onder een hoek om luchtbelvorming tussen het bloed en het membraan te voorkomen. Plaats het deksel van de zes putplaat op de voerkamers.

Doe de zes putjesplaat met kamers in het voorbereide waterbad van 34 graden Celsius en het deksel. Voeg vijf microliter drie millimolaire ATP en 50 microliter 100X voorraad penicilline streptomycine fungizone per put toe aan de bloedbuis en breng 4,5 milliliter bloed over in een put van een verse zes putplaat zoals eerder getoond. Haal de zes putplaat met de tekenkamer uit het waterbad en haal de kamer uit de put.

Spoel de buitenkant van de kamer en het membraan met 10 milliliter gesteriliseerde 1X PBS om het bloed te verwijderen. Gebruik geautoclaveerd filterpapier en dep het membraan en de kamer voorzichtig om het overtollige PBS te verwijderen. Als er veel condensatie in de kamer is, dep dan de natte plekken droog met geautoclaveerd filterpapier voordat u het afdicht met verse parafilm.

Vervang vervolgens de parafilm aan de bovenkant van de kamer. Plaats de tekenkamer in de nieuwe zes putjesplaat met vers bloed en pas indien nodig de O-ringhoogte aan. Herhaal deze stappen voor elke kamer op de plaat.

Plaats ten slotte het deksel van de zes putplaat over de bovenkant van de kamers en verplaats de nieuwe zes putplaat terug in het waterbad van 34 graden Celsius. Een doorlopende voeding met gedeeltelijk gezwollen ixodes scapularis nimfen wordt hier getoond. De zwarte of bruine stippen rond de aanhechtingsplaatsen zijn de vorst die tijdens en na het voer kan worden opgevangen om de phagostimulant te maken.

Gedeeltelijk gezwollen ixodes scapularis nimfen worden gezien bevestigd aan het membraan. Een schil van de opgezwollen larvenschimmel is hier ook te zien. De tekenomgiftenummers en het gewicht van de eimassa worden in deze tabel weergegeven.

Larvale en nymphale stuwkracht experimentele omstandigheden hadden hertenorgaanhomogenaat toegevoegd aan het bloed naast de supplementen die in deze techniek werden gebruikt. Hier werd succesvolle stuwing gedefinieerd als ofwel gezwollen teken die met succes vervellen naar de volgende levende fase of gezwollen vrouwtjes die met succes eieren legden. Het vergt oefening om een acceptabele dikte te krijgen bij het aanbrengen van siliconen op het lenspapier, dus het is altijd belangrijk om de dikte van het membraan te meten voor gebruik.

Membraanvoeding kan teken blootstellen aan ziekteverwekkers of antibiotica. De effecten hiervan op aspecten van de tekenbiologie zoals ruissucces, het leggen van eieren en overleving kunnen na het voer worden beoordeeld.