Name: Deeltjesfractie regelen in microporeuze gegloeide deeltjessteigers voor 3D-celcultuur (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-28T14:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Leer hoe je deeltjesfractie regelt in MAP-scaffolds voor 3D-celcultuur. Deze methode zorgt voor reproduceerbare materiaaleigenschappen en verbetert celinfiltratie in weefselengineeringtoepassingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen de National Institutes of Health, de National Institutes of Neurological Disorders and Stroke (1R01NS112940, 1R01NS079691, R01NS094599) en het National Institute of Allergy and Infectious Disease (1R01AI152568) bedanken. Dit werk werd gedeeltelijk uitgevoerd in de Duke University Shared Materials Instrumentation Facility (SMIF), een lid van het North Carolina Research Triangle Nanotechnology Network (RTNN), dat wordt ondersteund door de National Science Foundation (awardnummer ECCS-2025064) als onderdeel van de National Nanotechnology Coordinated Infrastructure (NNCI). De auteurs willen de voormalige postdoc van het lab, Dr. Lucas Schirmer, evenals Ethan Nicklow bedanken voor hun hulp bij het genereren van het 3D-geprinte apparaat voor celkweekexperimenten.

<ol><li>Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+wound+healing+by+injectable+microporous+gel+scaffolds+assembled+from+annealed+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks.</a> Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).</li>
<li>Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel+microparticles+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Materials%22%5BJournal%5D)">Hydrogel microparticles for biomedical applications.</a> Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).</li>
<li>Darling, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+by+click+Microporous+Annealed+Particle+%28MAP%29+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Click by click Microporous Annealed Particle (MAP) scaffolds.</a> Advanced Healthcare Materials. 9 (10), 1901391(2020).</li>
<li>Truong, N. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microporous+annealed+particle+hydrogel+stiffness%2C+void+space+size%2C+and+adhesion+properties+impact+cell+proliferation%2C+cell+spreading%2C+and+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Microporous annealed particle hydrogel stiffness, void space size, and adhesion properties impact cell proliferation, cell spreading, and gene transfer.</a> Acta Biomaterialia. 94, 160-172 (2020).</li>
<li>Pfaff, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+and+improved+photoannealing+of+Microporous+Annealed+Particle+%28MAP%29+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">Selective and improved photoannealing of Microporous Annealed Particle (MAP) scaffolds.</a> ACS Biomaterials Science & Engineering. 7 (2), 422-427 (2021).</li>
<li>Sideris, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+hydrogels+based+on+hyaluronic+acid+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">Particle hydrogels based on hyaluronic acid building blocks.</a> ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (11), 2034-2041 (2016).</li>
<li>Caldwell, A. S., Campbell, G. T., Shekiro, K. M. T., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clickable+microgel+scaffolds+as+platforms+for+3D+cell+encapsulation%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Clickable microgel scaffolds as platforms for 3D cell encapsulation.</a> Advanced Healthcare Materials. 6 (15), 1700254(2017).</li>
<li>Qazi, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anisotropic+rod-shaped+particles+influence+injectable+granular+hydrogel+properties+and+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion.</a> Advanced Materials. 34 (12), 2109194(2022).</li>
<li>Wilson, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometric+post+modification+of+hydrogel+microparticles+dictates+neural+stem+cell+fate+in+microporous+annealed+particle+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Stoichiometric post modification of hydrogel microparticles dictates neural stem cell fate in microporous annealed particle scaffolds.</a> Advanced Materials. 34 (33), 2201921(2022).</li>
<li>Muir, V. G., Qazi, T. H., Shan, J., Groll, J., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+microgel+fabrication+technique+on+granular+hydrogel+properties%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">Influence of microgel fabrication technique on granular hydrogel properties.</a> ACS Biomaterials Science & Engineering. 7 (9), 4269-4281 (2021).</li>
<li>Highley, C. B., Song, K. H., Daly, A. C., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jammed+microgel+inks+for+3D+printing+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Science%22%5BJournal%5D)">Jammed microgel inks for 3D printing applications.</a> Advanced Science. 6 (1), 1801076(2018).</li>
<li>Anderson, A. R., Nicklow, E., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+fraction+as+a+bioactive+cue+in+granular+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Particle fraction as a bioactive cue in granular scaffolds.</a> Acta Biomaterialia. 150, 111-127 (2022).</li>
<li>Pruett, L., Ellis, R., McDermott, M., Roosa, C., Griffin, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+heterogeneous+epidermal+growth+factor+release+from+microporous+annealed+particle+%28MAP%29+hydrogel+for+improved+wound+closure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Spatially heterogeneous epidermal growth factor release from microporous annealed particle (MAP) hydrogel for improved wound closure.</a> Journal of Materials Chemistry B. 9 (35), 7132-7139 (2021).</li>
<li>Sheikhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microengineered+emulsion-to-powder+technology+for+the+high-fidelity+preservation+of+molecular%2C+colloidal%2C+and+bulk+properties+of+hydrogel+suspensions%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Polymer+Materials%22%5BJournal%5D)">Microengineered emulsion-to-powder technology for the high-fidelity preservation of molecular, colloidal, and bulk properties of hydrogel suspensions.</a> ACS Applied Polymer Materials. 1 (8), 1935-1941 (2019).</li>
<li>Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-step+variable+height+photolithography+for+valved+multilayer+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Multi-step variable height photolithography for valved multilayer microfluidic devices.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), e55276(2017).</li>
<li>JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+Magnetic+Resonance+%28NMR%29+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+Science+Education+Database.+Organic+Chemistry.+JoVE%22%5BJournal%5D)">Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy.</a> JoVE Science Education Database. Organic Chemistry. JoVE. , Cambridge, MA. (2022).</li>
<li>Roosa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+synthesis+of+microgel+building+blocks+for+microporous+annealed+particle+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microfluidic synthesis of microgel building blocks for microporous annealed particle scaffold.</a> Journal of Visualized Experiments. (184), e64119(2022).</li>
<li>Zhang, H., Dicker, K. T., Xu, X., Jia, X., Fox, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interfacial+bioorthogonal+crosslinking%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Macro+Letters%22%5BJournal%5D)">Interfacial bioorthogonal crosslinking.</a> ACS Macro Letters. 3 (8), 727-731 (2014).</li>
<li>Welzel, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryogel+micromechanics+unraveled+by+atomic+force+microscopy-based+nanoindentation%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Cryogel micromechanics unraveled by atomic force microscopy-based nanoindentation.</a> Advanced Healthcare Materials. 3 (11), 1849-1853 (2014).</li>
<li>Plieva, F., Huiting, X., Galaev, I. Y., Bergenståhl, B., Mattiasson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macroporous+elastic+polyacrylamide+gels+prepared+at+subzero+temperatures%3A+control+of+porous+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Macroporous elastic polyacrylamide gels prepared at subzero temperatures: control of porous structure.</a> Journal of Materials Chemistry. 16 (41), 4065-4073 (2006).</li>
<li>Rommel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionalized+microgel+rods+interlinked+into+soft+macroporous+structures+for+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Science%22%5BJournal%5D)">Functionalized microgel rods interlinked into soft macroporous structures for 3D cell culture.</a> Advanced Science. 9 (10), 2103554(2022).</li>
<li>Kurt, E., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+delivery+from+granular+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid delivery from granular hydrogels.</a> Advanced Healthcare Materials. 11 (3), 2101867(2021).</li>
<li>Isaac, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microporous+bio-orthogonally+annealed+particle+hydrogels+for+tissue+engineering+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">Microporous bio-orthogonally annealed particle hydrogels for tissue engineering and regenerative medicine.</a> ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (12), 6395-6404 (2019).</li>
<li>Truong, N. F., Lesher-Pérez, S. C., Kurt, E., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+governing+polyethylenimine+polyplex+transfection+in+Microporous+Annealed+Particle+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Pathways governing polyethylenimine polyplex transfection in Microporous Annealed Particle scaffolds.</a> Bioconjugate Chemistry. 30 (2), 476-486 (2019).</li>
<li>Koh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+in+vivo+delivery+of+stem+cells+using+microporous+annealed+particle+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Enhanced in vivo delivery of stem cells using microporous annealed particle scaffolds.</a> Small. 15 (39), 1903147(2019).</li>
<li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cartilage+tissue+formation+through+assembly+of+microgels+containing+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Cartilage tissue formation through assembly of microgels containing mesenchymal stem cells.</a> Acta Biomaterialia. 77, 48-62 (2018).</li>
</ol>

ARA en TS hebben een voorlopig patent aangevraagd op deze technologie.

Van microfluïdische productie van HA-NB-microgels is aangetoond dat microgels worden gegenereerd met een smallere grootteverdeling dan emulsiebatchproductie 3,9. De microgels die in dit protocol worden beschreven, zijn geformuleerd met behulp van een MMP-splitsbare crosslinker (Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH2) om materiaaldegradatie te ondersteunen. HA-NB microgels kunnen echter ook worden verknoopt met behulp van een alternatieve di-thiol linker zoals dithiot...

Microporeuze gegloeide deeltjes (MAP) steigers zijn een subklasse van korrelige materialen waarin de microgel (μgel) bouwstenen met elkaar verbonden zijn om een bulk, poreuze steiger te vormen. Met de unieke microarchitectuur van deze korrelige steigers ondersteunt de aangeboren porositeit die wordt gegenereerd door de lege ruimte tussen onderling verbonden bolvormige microgel versnelde celinfiltratie en migratie1. De microgel bouwstenen van MAP steigers kunnen worden vervaardigd uit zowel synthetische als natuurlijke polymeren met chemische modificaties2. De hier beschreven methoden benadrukken specifiek het gebruik van microgels bestaande uit een hyaluronzuur (HA) ruggengraat gemodificeerd met functionele norborneen (NB) handgrepen. De NB functionele handgreep op het HA-polymeer ondersteunt klikchemiereacties voor het vormen van microgels en het aan elkaar koppelen om MAP-steigers 3,4 te genereren. Er zijn talloze schema's gebruikt om de microgels aan elkaar te koppelen (d.w.z. gloeien), zoals enzymatische1, op licht gebaseerde 5,6 en additiefvrije klikchemie 3,7-reacties. Additiefvrije klikchemie wordt in dit werk beschreven, met behulp van de tetrazine-norborneen inverse elektronenvraag Diels-Alder conjugatie voor het onderling verbinden van de HA-NB microgels.
Om MAP-steigers te fabriceren, genereren gebruikers eerst de microgel-bouwstenen met behulp van omgekeerde emulsies in batchsystemen of in microfluïdische apparaten, evenals met elektrohydrodynamisch spuiten, lithografie of mechanische fragmentatie2. De productie van bolvormige HA-NB microgels is goed beschreven en eerder gerapporteerd met behulp van zowel batch-emulsie2 als microfluïdische druppelgeneratietechnieken 8,9,10,11. In dit werk werden bolvormige HA-NB microgels gegenereerd op een flow-focussend microfluïdisch platform voor gecontroleerde grootte en vorm, zoals eerder beschreven 8,9,10. Na zuivering bestaan de microgels in een waterige suspensie en moeten ze worden geconcentreerd om een vastgelopen toestand te induceren. Wanneer ze vastzitten, vertonen microgels afschuifverdunnende eigenschappen, waardoor ze kunnen functioneren als injecteerbare, ruimtevullende materialen1. Een methode om een vastgelopen toestand te induceren, is om de microgels te drogen via lyofilisatie of vriesdrogen en vervolgens het gedroogde product opnieuw te hydrateren in een gecontroleerd volume12. Als alternatief kan overtollige buffer uit de microgel-slurry worden verwijderd via centrifugatie over een zeef of met handmatige verwijdering van de buffer uit de microgelpellet, hetzij door aspiratie of met behulp van een absorberend materiaal. Het gebruik van centrifugatie om de microgels te drogen kan echter een zeer variabel bereik van deeltjesfracties en lege fracties genereren bij het maken van korrelige steigers12. Technieken voor het lyofiliseren van microgels zijn beschreven met behulp van 70% IPA voor polyethyleenglycol (PEG) microgels13, gefluoreerde oliën voor gelatine methacryloyl (GelMa) microgels14 en 70% ethanol voor HA-microgels12. Dit protocol belicht methoden voor het vriesdrogen van bolvormige HA-microgels met behulp van 70% ethanol, een standaard laboratoriumreagens, om de oorspronkelijke microgel-eigenschappen tijdens het droogproces te behouden. De gevriesdroogde HA-microgels kunnen worden gewogen en gerehydrateerd met door de gebruiker gedefinieerde gewichtspercentages om de uiteindelijke deeltjesfracties in MAP-steigerste regelen 12.
De laatste stap in map-steigervorming is afhankelijk van het gloeien van de microgels om een bulk, poreuze steiger te creëren1. Door gebruik te maken van inheemse extracellulaire matrixcomponenten en bio-orthogonale gloeischema's te gebruiken, dienen MAP-steigers als een biocompatibel platform voor zowel in vitro celkweek als in vivo weefselherstel3. Door deze benaderingen kunnen MAP-steigers worden vervaardigd uit HA-NB-bouwstenen met door de gebruiker gedefinieerde deeltjesfracties voor hun gebruik in tissue engineering-toepassingen12. Het volgende protocol beschrijft de microfluïdische productie van HA-NB microgels gevolgd door lyofilisatie en rehydratatie voor het regelen van deeltjesfracties in MAP-steigers. Ten slotte worden stappen voor het gloeien van de microgels beschreven met behulp van bio-orthogonale chemie voor in vitro 3D-celkweekexperimenten.

<table><tbody><tr><td>1 mL Luer-Lok syringe sterile, single use, polycarbonate</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Luer-Lok syringe sterile, single use, polycarbonate</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 C5 maleimide</td><td>Invitrogen</td><td>A10254</td><td>Voor synthese van fluorescerend gelabeld tetrazine</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A22287</td><td>Voor kleuring van celcultuur monsters</td></tr><tr><td>Aluminiumfolie</td><td>VWR</td><td>89107-726</td><td></td></tr><tr><td>Biopsie punch met plunjer, 1,0 mm</td><td>Integra Miltex</td><td>69031-01</td><td></td></tr><tr><td>Biopsie punch, 4 mm</td><td>Integra Miltex</td><td>33-34</td><td></td></tr><tr><td>Blunt naald, 23 G 0,5", Niet-steriele, Met dop</td><td>SAI Infusion Technologies</td><td>B23-50</td><td></td></tr><tr><td>Fles-top vacuüm filter, 0,22 &mu;m</td><td>Corning</td><td>CLS430521</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchloride</td><td>VWR</td><td>1B1110</td><td>Voor microgel wasbuffer</td></tr><tr><td>Capillair-zuigerassemblages voor positief-verplaatsingspipetten, 1000 &mu;L max. volume</td><td>Rainin</td><td>17008609</td><td></td></tr><tr><td>Capillair-zuigerassemblages voor positief-verplaatsingspipetten, 25 &mu;L max. volume</td><td>Rainin</td><td>17008605</td><td></td></tr><tr><td>Capillair-zuigerassemblages voor positief-verplaatsingspipetten, 250 &mu;L max. volume</td><td>Rainin</td><td>17008608</td><td></td></tr><tr><td>Countess Cell Counting Chamber Slides</td><td>Invitrogen</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL Automated Cell Counter</td><td>Invitrogen</td><td>AMQAF1000</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugebuis, 15 mL</td><td>CELLTREAT</td><td>667015B</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugebuis, 50 mL</td><td>CELLTREAT</td><td>229421</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform, ACS-kwaliteit, glazen fles</td><td>Stellar Scientific</td><td>CP-C7304</td><td>Voor synthese van fluorescerend gelabeld tetrazine</td></tr><tr><td>Corona plasmapistool, BD-10A Hoge Frequentie Generator</td><td>ETP</td><td>11011</td><td></td></tr><tr><td>CryoTube Vials, Polypropylene, Interne draad met schroefdop</td><td>Nunc</td><td>368632</td><td></td></tr><tr><td>D1 muis mesenchymatische cellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-12424</td><td>Voorbeeld cel lijn voor cultuur in MAP gels</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>Voor kleuring van celcultuur monsters</td></tr><tr><td>Deuteriumoxide, 99,9 atoom% D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>151882</td><td>Voor NMR-spectroscopie</td></tr><tr><td>Dialysebuis, geregenereerd cellulosemembraan, 12-14 kDa moleculair gewicht cut-off</td><td>Spectra/Por</td><td>132703</td><td>Voor zuivering van HA-NB en HA-Tet</td></tr><tr><td>Diethylether</td><td>VWR</td><td>BDH1121-4LPC</td><td>Voor synthese van fluorescerend gelabeld tetrazine</td></tr><tr><td>Dimethylformamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>277056</td><td>Voor synthese van fluorescerend gelabeld tetrazine</td></tr><tr><td>4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride (DMTMM)&nbsp;</td><td>TCI-Chemicals</td><td>D2919</td><td>Voor modificatie van HA</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0861</td><td>Niet-afbreekbare dithiol linker (vervanger voor MMP-afbreekbaar peptide)</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), hoge glucose, met 4500 mg/L glucose, L-glutamine, natriumpyruvaat en natriumbicarbonaat, vloeibaar, sterieel gefilterd, geschikt voor celcultuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429-500ML</td><td>Voor D1 celcultuur</td></tr><tr><td>EMS Paraformaldehyde, Granular</td><td>VWR</td><td>100504-162</td><td>Voor het maken van 4% PFA</td></tr><tr><td>Ethanol absoluut (200 proof)</td><td>KOPTEC</td><td>89234-850</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum (FBS)</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td>Voor D1 celcultuur</td></tr><tr><td>Verwarmingsplaat</td><td>Kopf Instruments</td><td>HP-4M</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometer met dekglas</td><td>Daigger Scientific</td><td>EF16034F</td><td></td></tr><tr><td>2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid (HEPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhyaluronate, 79 kDa gemiddeld moleculair gewicht, geproduceerd in bacteriën Streptococcus zooepidemicus, farmaceutische kwaliteit, microbiële besmetting &lt;100 CFU/g, bacteriële endotoxinen &lt;0,050 IU/mg</td><td>Contipro</td><td>N/A</td><td>79 kDa gemiddeld moleculair gewicht werd gebruikt voor HA-Tet synthese, maar deze methoden kunnen worden aangepast voor andere moleculaire gewichten.</td></tr><tr><td>IMARIS Essentials softwarepakket</td><td>Oxford Instruments</td><td>N/A</td><td>Microscopie beeldanalyse software</td></tr><tr><td>Infusiepomp, dubbele spuit</td><td>Chemyx</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>Laboratoriumstandaard met ondersteuningslabklem</td><td>Geyer</td><td>212100</td><td></td></tr><tr><td>Vloeibare stikstof</td><td>Airgas</td><td>NI 180LT22</td><td></td></tr><tr><td>Lithium Phenyl(2,4,6-trimethylbenzoyl)phosphinate</td><td>TCI-Chemicals</td><td>L0290</td><td></td></tr><tr><td>Lyofiliseerder</td><td>Labconco</td><td>N/A</td><td>Labconco FreeZone 6 plus is stopgezet, maar andere laboratoriumkwaliteit console vriesdroogapparaten kunnen worden gebruikt voor dit protocol.</td></tr><tr><td>Methyltetrazine-PEG4-maleimide</td><td>Kerafast</td><td>FCC210</td><td>Voor synthese van fluorescerend gelabeld tetrazine</td></tr><tr><td>2-(4-Morpholino)ethane sulfonic acid (MES)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP300-100</td><td>Voor modificatie van HA</td></tr><tr><td>Micro dekglaas, 24 x 60 mm Nr. 1</td><td>VWR</td><td>48393-106</td><td></td></tr><tr><td>Microfluidic apparaat SU8 master wafer</td><td>FlowJem</td><td></td><td>Custom ontwerp gemaakt in eigen huis in cleanroom of uitbesteed</td></tr><tr><td>Mineralolie, zwaar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>330760</td><td></td></tr><tr><td>MMP-afbreekbare dithiol crosslinker peptide (Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH2)

deeltjesfractie regelen in microporeuze gegloeide deeltjessteigers voor 3d-celcultuur

Controlling Particle Fraction in Microporous Annealed Particle Scaffolds for 3D Cell Culture

Microgels zijn de bouwstenen van microporeuze gegloeide deeltjes (MAP) steigers, die dienen als een platform voor zowel in vitro celkweek als in vivo weefselherstel. In deze korrelige steigers maakt de aangeboren porositeit die wordt gegenereerd door de lege ruimte tussen microgels celinfiltratie en migratie mogelijk. Het regelen van de leegtefractie en deeltjesfractie is van cruciaal belang voor het ontwerp van map-steigers, omdat porositeit een bioactieve aanwijzing is voor cellen. Sferische microgels kunnen worden gegenereerd op een microfluïdisch apparaat voor gecontroleerde grootte en vorm en vervolgens gevriesdroogd met behulp van methoden die breuk van het polymeernetwerk voorkomen. Bij rehydratatie leiden de gelyofiliseerde microgels tot gecontroleerde deeltjesfracties in MAP-steigers. De implementatie van deze methoden voor microgellyofilisatie heeft geleid tot reproduceerbare studies die het effect van deeltjesfractie op macromolecuuldiffusie en celverspreiding aantonen. Het volgende protocol zal betrekking hebben op de fabricage, lyofilisatie en rehydratatie van microgels voor het beheersen van deeltjesfracties in MAP-steigers, evenals het gloeien van de microgels door middel van bio-orthogonale crosslinking voor 3D-celkweek in vitro.

Het doel van dit protocol is om de bereiding van microporeuze gegloeide deeltjes (MAP) steigers met een bio-orthogonaal crosslinking schema en gecontroleerde deeltjesfracties voor 3D-celkweek te demonstreren. Ten eerste werd HA gemodificeerd met norborneen hangergroepen om te worden gebruikt in zowel microgelvorming als interlinking om MAP-steigers te vormen. Met behulp van deze methoden werd ongeveer 31% van de HA-herhalingseenheden met succes aangepast met een norborneen functionele handgreep (figu...

Het minimaliseren van de variabiliteit in de deeltjesfractie binnen korrelige steigers vergemakkelijkt reproduceerbare experimenten. Dit werk beschrijft methoden voor het genereren van granulaire steigers met gecontroleerde deeltjesfracties voor in vitro weefselmanipulatietoepassingen.

Deeltjesfractie regelen in microporeuze gegloeide deeltjessteigers voor 3D-celcultuur

Microgels are the building blocks of microporous annealed particle (MAP) scaffolds, which serve as a platform for both in vitro cell culture and in vivo ...

Korrelige materialen, zoals MAP-steigers, zijn poreuze injecteerbare materialen gemaakt van onderling verbonden hydrogeldeeltjes van microformaat. Het beheersen van de deeltjesfractie is van cruciaal belang voor materiaaleigenschappen en cellulaire reacties. Variabele deeltjesfracties in MAP-scaffolds resulteren in een reeks scaffold-eigenschappen en celresponsen, maar deze techniek stelt gebruikers in staat om de uiteindelijke deeltjesfractie te definiëren in de MAP-scaffolds die ze maken.MAP-steigers kunnen worden gebruikt om het herstel en de regeneratie van complexe wonden te bevorderen, evenals om medicijnen af te leveren. Deeltjesfractie beïnvloedt bijvoorbeeld de snelheid en mate van cellulaire infiltratie en regeneratie. Deze methode kan worden toegepast op alle klassen van granulaire hydrogels.Nu we MAP-steigers kunnen maken met door de gebruiker gecontroleerde deeltjesfracties, kunnen we de bioactiviteit van deze materialen reproduceerbaar bestuderen en unieke celreacties onderzoeken, zoals opsluiting. Het instellen van de microfluïdische microgelgeneratie vereist tijd en geduld terwijl je de technieken leert. Het is het beste om meerdere apparaten voorbereid en klaar te hebben voor het geval u problemen ondervindt met de installatie.Begin met microfluïdische productie van hyaluronzuur, of HA, en Norborneen, of NB, microgels. Weeg voordat u de microgels droogt een cryoveilige schroefdopbuis. Breng vervolgens in een steriele kap de gewassen en gezuiverde microgels over op een cryoveilige schroefdopbuis met behulp van een pipet met positieve verplaatsing.Voeg 70% ethanol toe aan de gezuiverde microgels en meng goed. Centrifugeer de buis gedurende vijf minuten bij 5.000 g. Giet het supernatant aan en voeg 70% ethanol toe.Meng goed en incubeer een nacht bij vier graden Celsius. De volgende dag moet u kort centrifugeren om ervoor te zorgen dat de microgels zich op de bodem van de buis bevinden. Voeg vloeibare stikstof toe aan een cryogene container en plaats de tube microgels om te bevriezen.Verwijder na vijf tot 10 minuten de tube microgels met een tang. Verwijder snel de dop en bedek de buis met weefsel van laboratoriumkwaliteit. Bevestig het weefsel met een elastiekje en breng het over naar een lyofilisatiecontainer of kamer.Laad het monster op de lyofilisator volgens de instructies van de fabrikant en lyofiel bij 0,066 Torr en min 63 graden Celsius. Weeg de gelyofiliseerde microgels uit de tube voordat u ze bij kamertemperatuur bewaart. Meng polydimethylsiloxaan of PDMS-elastomeerbasis met het uithardingsmiddel in een massaverhouding van 10 tot één.Giet het PDMS-mengsel in een grote plastic petrischaal en ontgas in de exsiccator gedurende 30 minuten, of totdat alle bubbels zijn verdwenen. Zodra alle bubbels zijn verdwenen, plaatst u de 3D-geprinte mal voorzichtig in het PDMS om de vorming van nieuwe bubbels te minimaliseren. Zet twee uur in de oven op 60 graden Celsius om het PDMS uit te harden.Gebruik na het uitharden een mes of scheermesje om voorzichtig rond de omtrek van het kweekapparaat te traceren en verwijder de mal voorzichtig. Gebruik een biopsiepunch van vier millimeter om PDMS van de bodem van de putten te verwijderen. Knip de apparaten zodat ze op een glazen afdekplaat passen.Gebruik tape om stof van de onderkant van het kweekapparaat te verwijderen. Plaats de schone glazen afdekplaat en kweekapparaat gedurende 15 minuten op een hete plaat bij 135 graden Celsius om vocht te verwijderen. Gebruik in een zuurkast een coronaplasmapistool hoog op de glazen afdekplaat en de onderkant van het apparaat gedurende 30 seconden.Verlijm vervolgens snel de behandelde oppervlakken aan elkaar. Oefen voorzichtig druk uit om te zorgen voor een goede afdichting tussen het kweekapparaat en de glazen afdekslip. Plaats het apparaat 's nachts in een oven van 60 graden Celsius om de hechting vast te zetten.De volgende dag autoclaaf het apparaat om te steriliseren voor gebruik in vitro. Bereid vervolgens de Microporeuze Gegloeide Deeltjes, of MAP-steigercomponenten, op basis van de gewenste deeltjesfractie voor celkweek in MAP-steigers. Weeg gelyofiliseerde microgels om de massa van microgels te bepalen.Reconstitueer vervolgens de microgels in 84% van het uiteindelijke MAP-volume van celmedia op basis van het gekozen gewichtspercentage MAP. Laat de microgels 20 minuten opzwellen. Los het hyaluronzuur of HA-tetrazine en de celmedia op in 16% van het uiteindelijke MAP-volume.Zodra cellen de gewenste samenvloeiing hebben bereikt, tilt u de cellen op en telt u deze. Breng 10.000 cellen per microliter MAP over naar een nieuwe buis. Centrifugeer de cellen en aspirateer het supernatant uit de pellet zonder de cellen aan te zuigen.Voeg microgels en cross-linker toe aan de pellet met behulp van een verplaatsingspipet. Meng goed en zaai 10 microliter per put. Pipetteer in een cirkelvormige beweging om het mengsel gelijkmatig in de put te verdelen.Laat de microgels gedurende 25 minuten gloeien bij 37 graden Celsius voordat u celmedia toevoegt om de putjes te vullen. Houd de 3D-culturen op 37 graden Celsius en verander de media indien nodig. Om te voorkomen dat de steiger wordt opgezogen, stabiliseert u de pipetpunt langs de rand van de bovenste put.Fixeer monsters op de gewenste tijdstippen door media te vervangen door 50 microliter 4% paraformaldehyde per put gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Was de monsters drie keer met 50 microliter PBS, of voorkeursbuffer, en ga verder met immunofluorescentie of fluorescentiekleuring met behulp van 50 microliter per werkvolume. Microfluïdische apparaten met een stroomfocusgebied bleken HA-NB-microgels met een diameter van 50 of 100 micron te produceren.Het medium voor het lyofiliseren van de microgels werd geoptimaliseerd om cryogelvorming te minimaliseren door 70% ethanol te gebruiken. Andere media, zoals isopropylalcohol, water en acetonitril, kunnen echter door elkaar worden gebruikt om de vorming van cryogel te vergemakkelijken. Om bio-orthogonale interlinking van HA-NB microgels te vergemakkelijken werd een lineaire HA-tetrazine cross-linker gesynthetiseerd.Proton NMR-spectroscopie toont een succesvolle modificatie van 11% van de HA-herhalingseenheden met een tetrazine-hangergroep. Het gedroogde gelyofiliseerde microgelproduct werd gerehydrateerd met speciale volumes en gegloeid om verschillende gewichtsprocentformuleringen van microgels in MAP-steigers te bereiken. Deze gewichtspercentages van microgels in MAP-steigers kwamen overeen met unieke deeltjesfracties.Celkweek in MAP-steigers wordt hier weergegeven. Cellen in 3D-cultuur in MAP-steigers werden op dag vijf gefixeerd, gekleurd en afgebeeld op een confocale microscoop. Enkele Z-slices tonen verschillen in celgroei en steigers met verschillende gewichtspercentages MAP.Selecteer uw lyofilisatiemedia op de juiste manier, afhankelijk van of u cryogels wilt of niet. Sla de incubatiestappen niet over, zodat uw microgels voldoende tijd hebben om op te zwellen in de media. Standaardtechnieken zoals microscopie, flowcytometrie, RNA-sequencing en meer kunnen worden gebruikt om celresponsen binnen deze granulaire materialen met gedefinieerde porositeiten te beoordelen.

controlling-particle-fraction-microporous-annealed-particle-scaffolds

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

We presenteren twee processen voor de microfabricage van poreuze polymeer chips voor drie-dimensionale celkweek. De eerste is hot embossing gecombineerd met een damp van oplosmiddelen lasproces. De tweede maakt gebruik van een recent ontwikkelde microthermoforming proces in combinatie met ion-Track technologie leidt tot een aanzienlijke vereenvoudiging van de productie.

Microfabricage van Chip-en kleinbedrijf Stellingen voor drie-dimensionale celkweek

Biocompatibele pH responsieve sol-gel nanosensors kan in poly (melkzuur-co-glycolzuur) (PLGA) electrospun steigers worden opgenomen. De geproduceerde zelfrapportage steigers kunnen worden gebruikt voor in situ bewaking van micromilieu omstandigheden tijdens het kweken van cellen op de scaffold. Dit is gunstig als de 3D cellulaire construct kan in real-time zonder de proef.

Zelfrapportage Stellingen voor 3-dimensionale Cultuur van de Cel

Dit artikel beschrijft een reeks configuraties voor het zaaien van menselijke mesenchymale stamcellen op materialen, in dit geval geëlektrospunnen garens, die de basis van standaard kweekputjes niet bedekken om het aantal cellen dat aanvankelijk hecht te maximaliseren en te kwantificeren in vergelijking met de bekende zaaidichtheid.

Het optimaliseren van Bevestiging van menselijke mesenchymale stamcellen op Poly (ε-caprolacton) elektrogesponnen Yarns

Vooruitgang in biomateriaaltechnologieën maakt de ontwikkeling van driedimensionale constructen met meerdere celtypen mogelijk. We hebben electrospinning protocollen ontwikkeld om drie individuele scaffolds te produceren om de belangrijkste structurele cellen van de luchtweg te kweken en zo een 3D in vitro model van de wand van de bronchiolen in de luchtweg te bieden.

Aanpassing van de elektrospinproces te bieden drie unieke omgevingen voor een Tri-layered<em&gt; In Vitro</em&gt; Model van de Airway Muur

Hier presenteren we een protocol voor 3D-cultuur systemen bij het zelf monteren van peptide steigers ter bevordering van de differentiatie van dedifferentiated menselijke articulaire chondrocyten in kraakbeen-achtig weefsel.

Kweken van zoogdiercellen in driedimensionale Peptide steigers

Presenteren we een procedure voor de controle op de eerste cel cluster-vorm in een 3D extracellulaire matrix te verkrijgen van een herhaalbare patroonformatie. Een kubieke apparaat met twee verschillende hydrogels wordt gebruikt om verschillende richtingen imaging voor weefsel patroonformatie.

Beheer van de clusters van de eerste 3D-cel in een hybride Gel kubus apparaat voor herhaalbare patroon formaties

Microgelstaven met complementaire reactieve groepen worden geproduceerd via microfluïdica met het vermogen om in waterige oplossing met elkaar te verbinden. De anisometrische microgels binden en verbinden zich tot stabiele constructies met grotere poriën in vergelijking met op bolvormige systemen gebaseerde systemen. Microgels gemodificeerd met GRGDS-PC vormen macroporeuze 3D-constructies die kunnen worden gebruikt voor celkweek.

Onderling verbonden macroporeuze 3D-steigers van Microgel-staven

Dit protocol beschrijft een reeks methoden voor het synthetiseren van de microgel-bouwstenen voor microporeuze gegloeide deeltjessteigers, die kunnen worden gebruikt voor een verscheidenheid aan regeneratieve geneeskundetoepassingen.

Microfluïdische synthese van microgel-bouwstenen voor microporeuze gegloeide deeltjessteiger

Dit werk beschrijft de voorbereiding van de 3D-fibrine steigers voor het kweken en te differentiëren plutipotent stamcellen. Dergelijke draagstructuren kunnen worden gebruikt om de effecten van verschillende biologische verbindingen op stamcellen gedrag vertonen en aangepast medicijnafgiftesystemen bevatten.

Voorbereiding van de 3D-fibrine steigers voor Stem Cell Cultuur Toepassingen

Micro-stromingsvisualisatie (μPIV) wordt gebruikt om gepaarde beelden microdeeltjes uitgezet in bloedstromen die kruis-gecorreleerde een accurate snelheidsprofiel geven visualiseren. Afschuifsnelheid, maximale snelheid, snelheid profielvorm en debiet, die elk klinische toepassingen kan worden afgeleid uit deze metingen.

Micro-stromingsvisualisatie voor Velocity Profiel Metingen van Micro Blood Flows

Leer hoe je deeltjesfractie regelt in MAP-scaffolds voor 3D-celcultuur. Deze methode zorgt voor reproduceerbare materiaaleigenschappen en verbetert celinfiltratie in weefselengineeringtoepassingen.

Deeltjesfractie regelen in microporeuze gegloeide deeltjessteigers voor 3D-celcultuur

Meer video's verkennen