Name: Isolatie van rustige stamcelpopulaties van individuele skeletspieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-09T13:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 35 s
Description: Leer spierstamcellen en fibro-adipogene voorlopers isoleren uit individuele skeletspieren van muizen. Deze methode ondersteunt onderzoek naar regeneratie en ziekteprogressie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Celsortering werd uitgevoerd in de FACS Core Facility, Universiteit van Aarhus, Denemarken. Figuren zijn gemaakt met behulp van Biorender.com. We bedanken Dr. J. Farup voor het delen van het konijn anti-PDGFRa antilichaam. Dit werk werd ondersteund door een AUFF Starting Grant aan E.P. en Start Package subsidies van NovoNordiskFonden aan E.P. (0071113) en A.D.M. (0071116).

<ol><li>Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cell+of+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biophysical+and+Biochemical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Satellite cell of skeletal muscle fibers.</a> The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).</li>
<li>Relaix, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+on+skeletal+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Perspectives on skeletal muscle stem cells.</a> Nature Communications. 12 (1), 692(2021).</li>
<li>Cheung, T. H., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regulation+of+stem+cell+quiescence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular regulation of stem cell quiescence.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 14 (6), 329-340 (2013).</li>
<li>Kann, A. P., Hung, M., Krauss, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cell+contact+and+signaling+in+the+muscle+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell-cell contact and signaling in the muscle stem cell niche.</a> Current Opinion in Cell Biology. 73, 78-83 (2021).</li>
<li>Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repairing+skeletal+muscle%3A+regenerative+potential+of+skeletal+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (1), 11-19 (2010).</li>
<li>Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cells%2C+connective+tissue+fibroblasts+and+their+interactions+are+crucial+for+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration.</a> Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).</li>
<li>Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+absolute+requirement+for+Pax7-positive+satellite+cells+in+acute+injury-induced+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration.</a> Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).</li>
<li>Sambasivan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pax7-expressing+satellite+cells+are+indispensable+for+adult+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration.</a> Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).</li>
<li>Sacco, A., Doyonnas, R., Kraft, P., Vitorovic, S., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-renewal+and+expansion+of+single+transplanted+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells.</a> Nature. 456 (7221), 502-506 (2008).</li>
<li>Joe, A. W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+injury+activates+resident+fibro%2Fadipogenic+progenitors+that+facilitate+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis.</a> Nature Cell Biology. 12 (2), 153-163 (2010).</li>
<li>Wosczyna, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cells+are+required+for+regeneration+and+homeostatic+maintenance+of+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle.</a> Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).</li>
<li>Uezumi, A., Fukada, S. -I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+progenitors+distinct+from+satellite+cells+contribute+to+ectopic+fat+cell+formation+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle.</a> Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).</li>
<li>Seale, P., Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Mansouri, A., Gruss, P., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pax7+Is+Required+for+the+Specification+of+Myogenic+Satellite+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Pax7 Is Required for the Specification of Myogenic Satellite Cells.</a> Cell. 102 (6), 777-786 (2000).</li>
<li>Shea, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sprouty1+regulates+reversible+quiescence+of+a+self-renewing+adult+muscle+stem+cell+pool+during+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Sprouty1 regulates reversible quiescence of a self-renewing adult muscle stem cell pool during regeneration.</a> Cell Stem Cell. 6 (2), 117-129 (2010).</li>
<li>Fukada, S. -I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+signature+of+quiescent+satellite+cells+in+adult+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Molecular signature of quiescent satellite cells in adult skeletal muscle.</a> Stem Cells. 25 (10), 2448-2459 (2007).</li>
<li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li>
<li>Joe, A., Wang, J., Rossi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+isolation+of+adipogenic+progenitors+from+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Prospective isolation of adipogenic progenitors from skeletal muscle.</a> Journal of Investigative Medicine. 55 (1), 124(2007).</li>
<li>Yi, L., Rossi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+progenitors+from+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Purification of progenitors from skeletal muscle.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), e2476(2011).</li>
<li>Sherwood, R. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+adult+mouse+myogenic+progenitors%3A+functional+heterogeneity+of+cells+within+and+engrafting+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Isolation of adult mouse myogenic progenitors: functional heterogeneity of cells within and engrafting skeletal muscle.</a> Cell. 119 (4), 543-554 (2004).</li>
<li>Montarras, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+isolation+of+satellite+cells+for+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration.</a> Science. 309 (5743), 2064-2067 (2005).</li>
<li>Conboy, M. J., Cerletti, M., Wagers, A. J., Conboy, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immuno-analysis+and+FACS+sorting+of+adult+muscle+fiber-associated+stem%2Fprecursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+In+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Immuno-analysis and FACS sorting of adult muscle fiber-associated stem/precursor cells.</a> Methods In Molecular Biology. 621, 165-173 (2010).</li>
<li>de Morree, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+polyadenylation+of+Pax3+controls+muscle+stem+cell+fate+and+muscle+function%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Alternative polyadenylation of Pax3 controls muscle stem cell fate and muscle function.</a> Science. 366 (6466), 734-738 (2019).</li>
<li>Stuelsatz, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraocular+muscle+satellite+cells+are+high+performance+myo-engines+retaining+efficient+regenerative+capacity+in+dystrophin+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Extraocular muscle satellite cells are high performance myo-engines retaining efficient regenerative capacity in dystrophin deficiency.</a> Developmental Biology. 397 (1), 31-44 (2015).</li>
<li>Mookhtiar, K., Randall Steinbrink, D., Van Wart, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mode+of+hydrolysis+of+collagen-like+peptides+by+class+I+and+class+II+Clostridium+histolyticum+collagenases%3A+evidence+for+both+endopeptidase+and+tripeptidylcarboxypeptidase+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mode of hydrolysis of collagen-like peptides by class I and class II Clostridium histolyticum collagenases: evidence for both endopeptidase and tripeptidylcarboxypeptidase activities.</a> Biochemistry. 24 (23), 6527-6533 (1985).</li>
<li>Stenn, K. S., Link, R., Moellmann, G., Madri, J., Kuklinska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dispase%2C+a+neutral+protease+from+Bacillus+polymyxa%2C+is+a+powerful+fibronectinase+and+type+IV+collagenase%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Dispase, a neutral protease from Bacillus polymyxa, is a powerful fibronectinase and type IV collagenase.</a> The Journal of Investigative Dermatology. 93 (2), 287-290 (1989).</li>
<li>Baghdadi, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+signalling+by+Notch-Collagen+V-CALCR+retains+muscle+stem+cells+in+their+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reciprocal signalling by Notch-Collagen V-CALCR retains muscle stem cells in their niche.</a> Nature. 557 (7707), 714-718 (2018).</li>
<li>van Velthoven, C. T. J., de Morree, A., Egner, I. M., Brett, J. O., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+profiling+of+quiescent+muscle+stem+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Transcriptional profiling of quiescent muscle stem cells in vivo.</a> Cell Reports. 21 (7), 1994-2004 (2017).</li>
<li>Machado, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+fixation+redefines+quiescence+and+early+activation+of+skeletal+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">In situ fixation redefines quiescence and early activation of skeletal muscle stem cells.</a> Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).</li>
<li>Machado, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+damage+induces+a+conserved+stress+response+that+initiates+quiescent+muscle+stem+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation.</a> Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).</li>
<li>vanden Brink, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+sequencing+reveals+dissociation-induced+gene+expression+in+tissue+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations.</a> Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).</li>
<li>Moore, D. K., Motaung, B., du Plessis, N., Shabangu, A. N., Loxton, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SU-IRG+consortium+isolation+of+B-cells+using+Miltenyi+MACS+bead+isolation+kits%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">SU-IRG consortium isolation of B-cells using Miltenyi MACS bead isolation kits.</a> PloS One. 14 (3), 0213832(2019).</li>
<li>Liou, Y. -R., Wang, Y. -H., Lee, C. -Y., Li, P. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Buoyancy-activated+cell+sorting+using+targeted+biotinylated+albumin+microbubbles%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Buoyancy-activated cell sorting using targeted biotinylated albumin microbubbles.</a> PloS One. 10 (5), 0125036(2015).</li>
<li>Brett, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise+rejuvenates+quiescent+skeletal+muscle+stem+cells+in+old+mice+through+restoration+of+Cyclin+D1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Exercise rejuvenates quiescent skeletal muscle stem cells in old mice through restoration of Cyclin D1.</a> Nature Metabolism. 2 (4), 307-317 (2020).</li>
<li>Tabula Muris Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+transcriptomic+atlas+characterizes+ageing+tissues+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A single-cell transcriptomic atlas characterizes ageing tissues in the mouse.</a> Nature. 583 (7817), 590-595 (2020).</li>
<li>de Morrée, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staufen1+inhibits+MyoD+translation+to+actively+maintain+muscle+stem+cell+quiescence%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Staufen1 inhibits MyoD translation to actively maintain muscle stem cell quiescence.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (43), 8996-9005 (2017).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen en geen belangenconflicten.

Verschillende stappen zijn essentieel in de uitvoering van dit protocol om goede opbrengsten te behalen. De individuele spieren hebben een klein volume in vergelijking met de hoeveelheid spieren die wordt gebruikt in bulkisolatieprotocollen. Dit resulteert in een risico op uitdroging van de spier tijdens de dissectie, wat de opbrengst vermindert. Om dit te voorkomen is het belangrijk om direct na de dissectie medium aan de spieren toe te voegen. Bovendien, als dissectie langer duurt, kan de huid van één ledemaat tegelijk...

Skeletspieren hebben een hoge capaciteit voor regeneratie door de aanwezigheid van spierstamcellen (MuSCs). MuSCs bevinden zich op de myofiberen, onder de basale lamina, en bevinden zich in een rustige toestand van langdurige, omkeerbare celcyclus uitgang 1,2,3,4. Na verwonding activeren MuSCs en komen ze in de celcyclus om aanleiding te geven tot versterkende voorlopers die kunnen differentiëren en fuseren om nieuwe myofiberente vormen 2,5. Eerder werk heeft aangetoond dat MuSCs absoluut essentieel zijn voor spierregeneratie 6,7,8. Bovendien kan een enkele MuSC zowel nieuwe stamcellen als nieuwe myofiberen enten en genereren9. Skeletspieren herbergen ook een populatie van mesenchymale stromale cellen genaamd fibro-adipogene voorlopers (FAPs), die een cruciale rol spelen bij het ondersteunen van de MuSC-functie tijdens spierregeneratie 6,10,11,12.
Vanwege hun potentieel om spierregeneratie te coördineren, is er een enorme interesse in het begrijpen van hoe MuSCs en FAPs werken. Rustige MuSC's worden gekenmerkt door expressie van de transcriptiefactoren Pax7 en Sprouty1, en de celoppervlakeiwitcalcitoninereceptor, terwijl rustige FAPs worden gekenmerkt door de van het celoppervlakeiwit afgeleide groeifactorreceptor alfa (PDGFRa)10,12,13,14,15. Eerdere studies hebben aangetoond dat MuSCs en FAPs kunnen worden gezuiverd uit skeletspieren met behulp van celoppervlakmarkers en fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) 9,15,16,17,18,19,20,21. Hoewel deze protocollen de mogelijkheid om MuSCs en FAPs te bestuderen enorm hebben verbeterd, is een nadeel dat de meeste van deze protocollen de isolatie van MuSCs uit een pool van verschillende spierweefsels vereisen. Recent werk van ons en anderen heeft verschillen in celfenotype en genexpressieniveaus onthuld tussen MuSCs geïsoleerd uit verschillende weefsels22,23. MuSCs van het diafragma, triceps en gracilis vertonen een snellere activering dan MuSCs van lagere achterspieren22, terwijl MuSCs van extraoculaire spieren een snellere differentiatie vertonen dan MuSCs van het middenrif en de onderste achterste spieren23.
Dit protocol beschrijft de isolatie van MuSCs en FAPs uit individuele skeletspieren (figuur 1). Dit omvat de dissectie van het diafragma, triceps, gracilis, tibialis anterior (TA), soleus, extensor digitorum longus (EDL), gastrocnemius (GA) en kauwspieren. Ontlede spieren worden vervolgens gedissocieerd door enzymatische vertering met behulp van collagenase II (een protease dat zich specifiek richt op de Pro-X-Gly-Pro aminosequentie in collageen, waardoor de afbraak van bindweefsel en weefseldissociatiemogelijk wordt 24) en dispase (een protease dat fibronectine en collageen IV splitst, waardoor verdere celdissociatie mogelijk wordt25). MuSCs en FAPs worden geïsoleerd van eencellige suspensies door FACS. Als voorbeelden van downstream-assays voor celanalyse wordt stamcelactivering bepaald door 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) -opname te testen, terwijl celzuiverheid wordt bepaald door immunofluorescentiekleuring voor de celtypespecifieke markers Pax7 en PDGFRa.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL tube( PCR performance tested, PP, 30,000 xg, DNA/DNase-/RNase-free, Low DNA binding, Sterile )</td><td>Sarstedt AG &amp; Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td><td>72.706.700</td><td>1.5 mL tube</td></tr><tr><td>15 mL tube (PP/HD-PE, 20,000 xg, IVD/CE, IATA, DNA/DNase-/RNase-free, Non-cytotoxic, pyrogen free, Sterile)</td><td>Sarstedt AG &amp; Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td><td>62.554.502</td><td>15 mL tube</td></tr><tr><td>5 mL polystyrene round-bottom tube</td><td>Falcon, Fisher Scientific&nbsp;</td><td>352054</td><td>FACS tube without strainer cap</td></tr><tr><td>5 mL polystyrene Round-bottom tube with cell-strainer cap</td><td>Falcon, Fisher Scientific&nbsp;&nbsp;</td><td>352235</td><td>FACS tube with strainer cap</td></tr><tr><td>5 mL tube (PP, non sterile autoclavable)</td><td>VWR collection</td><td>525.0946</td><td>5 mL tube</td></tr><tr><td>50 mL tube( PP/HD-PE, 20,000 xg, IVD/CE, ADR, DNA/DNase-/RNase-free, non-cytotoxic, pyrogen free, Sterile)</td><td>Sarstedt AG &amp; Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td><td>62.547.254</td><td>50 mL tube</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 Donkey anti-rabbit IgG (H+L)</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher</td><td>Lot: 2387458 (Cat # A31572)</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 donkey-anti mouse IgG (H+L)</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher</td><td>Lot: 2420713 (Cat#A31571)</td><td></td></tr><tr><td>ARIA 3</td><td>BD</td><td></td><td>FACS, Core facility Aarhus University</td></tr><tr><td>Centrifuge 5810</td><td>eppendorf</td><td>EP022628188</td><td>Centrifuge</td></tr><tr><td>Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 dye</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher</td><td>Lot: 2387287 (Cat# C10337)</td><td>Cell Proliferation Kit</td></tr><tr><td>Collagen from calf-skin&nbsp;</td><td>Bioreagent, Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>Source: SLCK6209 (Cat# C8919)</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase type II</td><td>Worthington, Fisher Scientific&nbsp;</td><td>Lot: 40H20248 (cat# L5004177 )</td><td>Collagenase</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Gibco, Fisher Scientific&nbsp;</td><td>Lot: 2309415 (cat# 17105-041 )</td><td>Dispase</td></tr><tr><td>Donkey serum (non-sterile)</td><td>Sigma Aldrich, Merck</td><td>Lot: 2826455 (Cat# S30-100mL)</td><td></td></tr><tr><td>Dumont nr. 5, 110 mm</td><td>Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td><td>1606.327</td><td>Straight forceps with fine tips</td></tr><tr><td>Dumont nr. 7, 115 mm</td><td>Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td><td>1606.335</td><td>Curved forceps</td></tr><tr><td>F-10 Nutrient mixture (Ham) (1x), +L-glutamine</td><td>Gibco, Fisher Scientific&nbsp;</td><td>Lot. 2453614 (cat# 31550-023)</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-mouse CD31</td><td>BioLegend, NordicBioSite</td><td>MEC13.3 (Cat # 102506)</td><td></td></tr><tr><td>FITC Anti-mouse CD45</td><td>BioLegend, NordicBioSite</td><td>30-F11 (Cat# 103108)</td><td></td></tr><tr><td>Glacial acetic acid (100%)</td><td>EMSURE, Merck&nbsp;&nbsp;</td><td>K44104563 9Cat # 1000631000)</td><td></td></tr><tr><td>Head over head mini-tube rotator&nbsp;</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>15534080 (Model no. 88861052)</td><td>Head over head mini-tube rotator</td></tr><tr><td>Horse serum</td><td>Gibco, Fisher Scientific&nbsp;</td><td>Lot. 2482639 (cat# 10368902 )</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp SWB 15</td><td>FisherBrand, Fisher Scientific</td><td>15325887</td><td>Shaking water bath</td></tr><tr><td>MS2 mini-shaker&nbsp;</td><td>IKA&nbsp;</td><td></td><td>Vortex unit</td></tr><tr><td>Needle 20 G (0.9 mm x 25 mm)</td><td>BD microlance, Fisher Scientific&nbsp;</td><td>304827</td><td>20G needle&nbsp;</td></tr><tr><td>Neutral formalin buffer 10%</td><td>CellPath, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td><td>Lot: 03822014 (Cat # HOU/1000.1002)</td><td></td></tr><tr><td>Non-pyrogenic cell strainer (40 &micro;M)</td><td>Sarstedt AG &amp; Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td><td>83.3945.040</td><td>Cell strainer&nbsp;</td></tr><tr><td>Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1)</td><td>BioLegend, NordicBioSite</td><td>D7 (Cat# 108120)</td><td></td></tr><tr><td>Pax7 primary antibody</td><td>DSHB</td><td>Lot: 2/3/22-282ug/mL (Cat# AB 528428)</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x powder concentrate</td><td>Fisher BioReagents, Fisher Scientific</td><td>BP665-1</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7 anti-mouse CD106 (VCAM1)</td><td>BioLegend, NordicBioSite</td><td>429 (MVCAM.A) (Cat # 105720)</td><td></td></tr><tr><td>Pen/strep</td><td>Gibco, Fisher Scientific&nbsp;</td><td>Lot. 163589 (cat# 11548876 )</td><td></td></tr><tr><td>Pipette tips p10</td><td>Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific</td><td>2140-05</td><td>Low retention, pre-sterilized, filter tips</td></tr><tr><td>Pipette tips p1000</td><td>Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific</td><td>2279-05</td><td>Low retention, pre-sterilized, filter tips</td></tr><tr><td>Pipette tips p20</td><td>Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific</td><td>2149P-05</td><td>Low retention, pre-sterilized, filter tips</td></tr><tr><td>Pipette tips p200</td><td>Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific</td><td>2069-05</td><td>Low retention, pre-sterilized, filter tips</td></tr><tr><td>Protective underpad</td><td>Abena&nbsp;</td><td>ACTC-7712</td><td>&nbsp;60 x 40cm, 8 layers</td></tr><tr><td>Rainin, pipet-lite XLS</td><td>Mettler Toledo, Thermo Scientific&nbsp;</td><td>2140-05, 2149P-05, 2279-05, 2069-05</td><td>Pipettes (P10, P20, P200, P1000)</td></tr><tr><td>Recombinant anti-PDGFR-alpha</td><td>RabMAb, abcam</td><td>AB134123</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel (shaft no. 3

isolatie van rustige stamcelpopulaties van individuele skeletspieren

Isolation of Quiescent Stem Cell Populations from Individual Skeletal Muscles

Skeletspieren herbergen verschillende populaties van volwassen stamcellen die bijdragen aan de homeostase en het herstel van het weefsel. Skeletspierstamcellen (MuSCs) hebben het vermogen om nieuwe spieren te maken, terwijl fibro-adipogene voorlopers (FAPs) bijdragen aan stromale ondersteunende weefsels en het vermogen hebben om fibroblasten en adipocyten te maken. Zowel MuSCs als FAPs bevinden zich in een toestand van langdurige reversibele celcyclusuitgang, rust genoemd. De rusttoestand is de sleutel tot hun functie. Rustige stamcellen worden gewoonlijk gezuiverd uit meerdere spierweefsels die in één monster zijn samengevoegd. Recente studies hebben echter duidelijke verschillen aangetoond in de moleculaire profielen en rustdiepte van MuSCs geïsoleerd uit verschillende spieren. Het huidige protocol beschrijft de isolatie en studie van MuSCs en FAPs uit individuele skeletspieren en presenteert strategieën om moleculaire analyse van stamcelactivatie uit te voeren. Het beschrijft hoe spieren van verschillende ontwikkelingsoorsprong, diktes en functies kunnen worden geïsoleerd en verteerd, zoals het diafragma, triceps, gracilis, tibialis anterior (TA), gastrocnemius (GA), soleus, extensor digitorum longus (EDL) en de kauwspieren. MuSCs en FAPs worden gezuiverd door fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) en geanalyseerd door immunofluorescentiekleuring en 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) incorporatietest.

Volgens het protocol voor individuele skeletspierisolatie (figuur 2) werden de gracilis, TA, EDL, GA, soleus, triceps, masseter en middenrifspieren geïsoleerd van drie Zwitserse mannelijke outbred muizen die waren stopgezet uit een lokaal fokprogramma (figuur 2). Na weefseldissociatie en antilichaamkleuring werden MuSCs en FAPs uit de individuele spieren gezuiverd door FACS (figuur 3). De initiële gating werd verkregen met een niet-...

Dit protocol beschrijft de isolatie van spierstamcellen en fibro-adipogene voorlopers uit individuele skeletspieren bij muizen. Het protocol omvat enkelvoudige spierdissectie, stamcelisolatie door fluorescentie-geactiveerde celsortering, zuiverheidsbeoordeling door immunofluorescentiekleuring en kwantitatieve meting van S-fase-invoer door 5-ethynyl-2'-deoxyuridine-incorporatietest.

Isolatie van rustige stamcelpopulaties van individuele skeletspieren

Skeletal muscle harbors distinct populations of adult stem cells that contribute to the homeostasis and repair of the tissue. Skeletal muscle stem cells ...

Dit protocol is belangrijk omdat het de studie van de stamcelfunctie in verschillende skeletspieren mogelijk maakt, waardoor ons begrip van hoe ze bijdragen aan homeostase, regeneratie en ziekteprogressie wordt verdiept. Met behulp van dit protocol kunnen we twee populaties van levende stamcellen isoleren van specifieke spieren en bestuderen hoe ze werken. Om spierisolatie te beginnen, spuit u de geëuthanaseerde muis met ethanol en plaatst u deze met de buik naar boven gericht.Maak met een schaar een 0,5 centimeter lange horizontale incisie in de buikhuid. Trek met beide handen aan de huid om de romp en de onderste ledematen bloot te leggen tot aan de achterpoten. Lokaliseer de gracilis of de binnenste dijbeenspier en gebruik een paar gebogen tangen die je vastgrijpt en de spier iets optilt.Maak met een schaar een incisie van 0,5 centimeter om de gracilisa-spier uit te knippen. Herhaal de procedure op het andere been. Snijd met behulp van een scalpel de fascia door een incisie van 0,5 centimeter langs de zijkant van het scheenbeen te maken.Pak vervolgens de fascia vast met een gebogen tang en verwijder deze door te trekken, waarbij de pezen aan het distale uiteinde van de achterpoot worden blootgesteld. Plaats vervolgens een paar rechte tangen met superfijne uiteinden tussen de distale pees van de TA en de EDL-spier. Scheid de spieren door de tang naar het proximale uiteinde van de spieren te schuiven.Breng de tang terug naar het distale uiteinde en snijd de distale pees door. Pak voorzichtig de distale pees van de TA vast met een gebogen tang en til de spier op en over zijn proximale aanhechting. Om de proximale pees voorzichtig door te snijden, snijdt u het andere uiteinde zo dicht mogelijk bij de aanhechting en brengt u de TA over in een petrischaal.Gebruik vervolgens de rechte tang met superfijne uiteinden om onder de distale pees van de EDL te gaan en schuif de tang naar het proximale uiteinde van de spier om de spieren van elkaar te scheiden. Breng de tang terug naar het distale uiteinde en snijd de distale pees door zonder de spier te beschadigen. Door de distale pees van EDL voorzichtig vast te pakken met een gebogen tang, tilt u de spier op en over zijn proximale aanhechting om de proximale pees voorzichtig zo dicht mogelijk bij zijn aanhechting te snijden.Snijd het andere uiteinde en breng de EDL-spier over in een petrischaaltje. Herhaal de procedure voor de andere achterpoot. Gebruik een rechte tang met superfijne uiteinden om tussen de achillespees en de onderste achterpootbeenderen te komen.Schuif de tang naar het proximale uiteinde van de spier om de spier van de botten te scheiden. Breng de tang terug naar het distale uiteinde en snijd de distale pees door. Trek de gastrocnemius of GA spier omhoog en over het kuitbeen.Om de proximale soleuspees te lokaliseren. Plaats de rechte tang tussen de soleus- en GA-spieren en beweeg de tang naar het distale uiteinde van de spieren om de soleus van de GA te scheiden. Snijd nu de proximale soleuspees door. Pak het vast met een gebogen tang en til de sous voorzichtig op om toegang te krijgen tot de distale pees.Snijd de distale pees door om de soleus te isoleren van de GA en plaats de soleus in de petrischaal met het wasmiddel. Snijd vervolgens de GA en leg deze in de petrischaal. Om de tricepsspier te isoleren, gebruikt u een rechte tang met superfijne uiteinden om tussen de triceps en het opperarmbeen te reiken en schuift u de tang naar het proximale uiteinde van de spier om de spier van het bot te scheiden.Snijd vervolgens het distale uiteinde van de tricepsspier en trek deze met een gebogen tang omhoog en over de elleboog om toegang te krijgen tot de proximale pees. Snijd de proximale pees van de triceps door en breng de spier over in een petrischaaltje. Herhaal de procedure voor de andere vier ledemaat.Om de vacht en de huid van de kaak te verwijderen, gebruikt u een schaar om een incisie van 0,5 centimeter onder het oog te maken en in caudale richting te snijden. Gebruik vervolgens de duimen en de wijsvingers van beide handen, knijp aan elke kant van de incisie en verwijder de huid door deze naar boven en naar beneden te trekken. Lokaliseer de belangrijkste pees van de kauwer in de caudale zijde onder het oog en steek het platte scalpelblad tussen het bot en de spier om de pees door te snijden.Pak de grote kauwzetpees met een gebogen tang en knip deze met een scalpelmes of schaar in de rostrale richting om de kauwspier van het kaakbot te scheiden. Plaats de geïsoleerde kauwspier in de petrischaal en herhaal de procedure voor de tweede kauwspier. Gebruik een schaar om een thoracotomie in het midden van het borstbeen te maken en door het borstbeen te snijden.Leg het diafragma bloot door 360 graden door de ribbenkast te snijden. Gebruik vervolgens een schaar om het bovenlichaam van de buik te scheiden om door de luchtpijp, slokdarm, vena cava en abdominale aorta te snijden. Vervolgens voert u met een schaar een laparotomie een centimeter onder het borstbeen voor en maakt u een snede rond 360 graden.Plaats de gesloten schaar tussen de ribbenkast en de buikorganen en druk naar beneden. Trek voorzichtig aan de ribbenkast om deze te scheiden van de buikorganen. Om het diafragma van de ribbenkast te scheiden, houdt u het diafragma losjes tussen twee vingers en snijdt u met een schaar door de ribbenkast.Snijd het diafragma zo dicht mogelijk bij de ribben rond 360 graden en plaats het geïsoleerde diafragma in een petrischaaltje. Hak de geïsoleerde spieren één voor één fijn door ze in stukjes van ongeveer een millimeter te snijden. Breng de gehakte spieren over in een conische buis van 15 liter met vijf liter dissociatiebuffer en incuber de buis gedurende 35 minuten bij 37 graden Celsius in een schuddend waterbad met een snelheid van 60 rotaties per minuut.Na enzymatische vertering van de gehakte spieren, breng de suspensie over van de buis van 15 milliliter naar een buis van 50 milliliter. Gebruik een spuit van 10 milliliter met een naald van 20 gauge om het monster opnieuw op te hangen door het vijf keer op en neer door de naald te trekken. Trek de celsuspensie in de spuit en zeef het monster in een nieuwe conische buis van 50 milliliter met daarop een celzeef.Om alle mononucleaire cellen op te halen, wast u de lege conische buis met 20 milliliter wasmiddel en giet u deze door de zeef om te combineren met het gespannen monster. Haal het resterende volume onder de celzeef op met een P1000-pipet. Na weefseldissociatie en antilichaamkleuring werden de skeletspierstamcellen of MuSCs en fibro-adipogene voorlopers of FAPs uit individuele spieren gezuiverd door fluorescentie-geactiveerde celsortering.Na de eerste gating om de cellen te identificeren en de singlets van doubletten te scheiden, werden volgende poorten ingesteld met behulp van FMO-controles om kleuringsdrempels te identificeren. Het vlekmonster werd afgesloten en de SCA1-positieve CD31-negatieve en CD45-negatieve populatie die overeenkomt met FAPs werd gesorteerd in een aparte verzamelbuis. De dubbele negatieve populatie werd verder afgesloten om de VCA-positieve populatie te sorteren die overeenkomt met de MuSCs.Het middenrif en de tricepsspier eencellige suspensies hadden, in tegenstelling tot de andere, een hogere relatieve abundantie van MuSCs dan FAPs. EDU-kleuring, hoewel robuust, duidde op een verschil in fracties van EDU-positieve cellen voor de twee stamceltypen en over de verschillende spieren. Voor alle weefsels was de gemiddelde fractie van EDU-positieve MuSCs echter hoger dan die van EDU-positieve FAPs.MuSCs geïsoleerd uit EDL en GA vertoonden significant lagere EDU-opname in vergelijking met die van TA, diafragma, gracilis of triceps. Evenzo werd ook significante variatie in EDU-opname waargenomen bij FAPs geïsoleerd van verschillende spieren. Ten slotte werd de celzuiverheid bevestigd met immunofluorescente kleuring, wat de specificiteit van het stamcelisolatieprotocol aangeeft.De meest kritische stap is de mechanische vertering van het weefsel. Wanneer het weefsel te veel wordt gesneden, neemt de levensvatbaarheid af. Wanneer het weefsel te weinig wordt gesneden, neemt de EEL af.Het protocol kan worden gecombineerd met testen die celgedrag meten, zoals engraftment na transplantatie om stamcelfuncties in vivo beter te begrijpen. Deze techniek kan antwoorden of verschillen in stamcelgedrag binnen individuele spieren kunnen bijdragen aan ziektefenotypen en ziekten die worden gekenmerkt door unieke patronen van aangetaste spieren.

isolation-quiescent-stem-cell-populations-from-individual-skeletal

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Het isoleren van volwassen stamcellen uit spier-en zachte weefsels op basis van de cel naleving snelheid kolf.

Het isoleren van stamcellen uit Soft musculoskeletale weefsels

De micro-ontleed explantaten techniek is een robuuste en betrouwbare methode voor het isoleren van proliferatieve skeletspieren cellen van jonge, volwassen of embryonale spieren als bron van skeletspieren stamcellen. Uniek, zijn deze cellen zijn klonaal ontleend aan de skeletspieren stamcellijnen gebruikt voor in vivo transplantatie te produceren.

Volwassen en embryonale skeletspier Microexplant Cultuur en isolatie van de skeletspieren Stem Cells

Isolatie en cultuur van myovezels is de gouden...

Isolatie en Cultuur van individuele myovezels en hun satelliet cellen van volwassen skeletspier

De isolatie en cultuur van een zuivere populatie van rustende cellen satelliet, een spier stamcelpopulatie, is essentieel voor het begrip van spier stamcel biologie en regeneratie, en stamceltransplantatie voor therapieën spierdystrofie en andere degeneratieve ziekten.

Isolatie, Cultuur en Transplantatie van Muscle satelliet-cellen

Bloedvaten in de menselijke skeletspier haven diverse multi-lineage voorloper populaties die ideaal is voor regeneratieve toepassingen zijn. Deze isolatie methode maakt gelijktijdige zuivering van drie multipotente precursor celpopulaties respectievelijk uit drie structurele lagen van de bloedvaten: myogene endotheelcellen van de intima, pericytes van media en adventitia cellen van adventitia.

Isolatie van bloedvatgeassocieerde afgeleid Multipotente Voorlopers van Human Skeletal Muscle

De belangrijkste aderente celtypen die zijn afgeleid van menselijk spierweefsel zijn myogene cellen en fibroblasten. Hier worden celpopulaties verrijkt met behulp van magnetisch geactiveerde celsortering op basis van het CD56-antigeen. Daaropvolgende immunolabeling met specifieke antilichamen en het gebruik van beeldanalysetechnieken maakt kwantificering van cytoplasmatische en nucleaire kenmerken in individuele cellen mogelijk.

Isolatie en Kwantitatieve Immunocytochemische karakterisering van primaire Myogene cellen en fibroblasten van Human Skeletal Muscle

We presenteren technieken voor het isoleren, kweken, karakteriseren en differentiëren van menselijke primaire spier voorlopercellen (Hmpc's) verkregen uit skeletspieren biopsie weefsel.  hmpc's verkregen en gekenmerkt door middel van deze methoden kunnen worden gebruikt om vervolgens onderzoek vragen met betrekking tot menselijke myogenese en skeletspier regeneratie aan te pakken.

Isolatie, cultuur, karakterisering, en differentiatie van menselijke spier voorlopercellen van de skeletspier biopsie procedure

Hier stellen we een methode voor om efficiënt te verkrijgen enkele spiervezels in de vroege postnatale ontwikkelingsstadia van homozygoot mutant Lamin Δ8-11 muis model, een zeer ernstig model voor Emery-Dreifuss spierdystrofie (EDMD).

Single Myofiber isolatie en cultuur van een Murine Model van Emery-Dreifuss Spierdystrofie in de vroege post-natale ontwikkeling

In dit protocol wordt een in vitro kweek- en functionele analysemethode voor spierstamcellen beschreven, die de meeste van hun interacties met hun endogene niche behoudt.

Single Myofiber Culture Assay voor de beoordeling van volwassen spierstamcelfunctionaliteit Ex Vivo

Skeletspieren bestaan uit meerdere celtypen, waaronder residente stamcellen, elk met een speciale bijdrage aan de homeostase en regeneratie van spieren. Hier worden de 2D-kweek van spierstamcellen en de spiercelniche in een ex vivo setting beschreven die veel van de fysiologische, in vivo en omgevingskenmerken behoudt.

Niet-gefractioneerde bulkkweek van skeletspieren van muizen om niche- en stamcelrust te recapituleren

Dit protocol biedt een gestandaardiseerde methode voor het isoleren en verrijken van primaire myoblasten uit volwassen en neonatale muisskeletspieren via weefseldissociatie, sequentiële filtratie, preplating en gedefinieerde kweekcondities, waardoor de opbouw en het onderhoud van satellietcel-afgeleide myoblastkweken mogelijk is voor latere experimentele toepassingen.

Isolatie van skeletspiersatellietcellen voor in vitro myogenesestudies

Leer spierstamcellen en fibro-adipogene voorlopers isoleren uit individuele skeletspieren van muizen. Deze methode ondersteunt onderzoek naar regeneratie en ziekteprogressie.

Isolatie van rustige stamcelpopulaties van individuele skeletspieren

Meer video's verkennen