Een elektroporatiemethode om Rickettsia spp. te transformeren met een fluorescerende eiwitexpressie shuttlevector in tekencellijnen

Functionele studies van Rickettsia-genen zijn cruciaal voor het begrijpen van hun rol in pathogenese, dus we hebben betrouwbare methoden nodig om de genen op een gecontroleerde manier te veranderen. Ons protocol maakt gebruik van elektroporatie om exogene DNA te introduceren in obligate intracellulaire bacteriën van het geslacht Rickettsia, waardoor we de effecten van het geïntroduceerde DNA kunnen bestuderen. Lisa Price, een onderzoeker van Dr.Munderloh en het laboratorium van Dr.Kurtti, demonstreert vandaag samen met mij de procedure.

Bereid om te beginnen een 90 tot 100% Rickettsia parkeri-geïnfecteerde ISE6-celcultuur zoals beschreven in de tekst. Om vervolgens de infectiesnelheid door Giemsa-kleuring te bepalen, verdunt u de celsuspensie tot een verhouding van 1:5 met volledig medium en deponeert u 100 microliter van de celsuspensie op een glasmicroscoopglaasje door centrifugeren bij 113 G gedurende vijf minuten. Nadat u de schuif aan de lucht hebt laten drogen, bevestigt u deze gedurende vijf minuten op kamertemperatuur een absolute methanol.

Incubeer vervolgens de glijbaan en Giemsa-vlek gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius. Spoel vervolgens de dia in water en eenmaal droog, bekijk deze onder een lichte microscoop met oliedoelen. Bepaal het percentage geïnfecteerde cellen door de geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde cellen te tellen.

Om de celvrije Rickettsia parkeri te bereiden, giet ongeveer 0,2 milliliter steriel 60 tot 90 siliciumcarbide grit in twee steriele microcentrifugebuizen van twee milliliter en zet de buizen opzij. Verwijder uit een eerder geënte Rickettsia parkeri-geïnfecteerde kolf met vijf milliliter medium twee milliliter van het medium en zorg ervoor dat de cellaag niet wordt verstoord. Resuspendeer vervolgens de cellen met de resterende drie milliliter van het medium.

Verdeel deze suspensie gelijkmatig over de twee bereide siliconencarbide gritbuizen en vortex de buis op hoge snelheid gedurende 30 seconden. Leg ze vervolgens op ijs. Bereid vervolgens een steriele luervergrendelingsspuit van vijf milliliter door de zuiger uit te schuiven en het uiteinde van de zuiger in een polystyreenbasis te steken die wordt gebruikt voor het vasthouden van conische buizen van 15 milliliter.

Gebruik een barrière van twee milliliter Pasteur-pipet die wordt bediend met een rubberen bol en verwijder voorzichtig het supernatant van de vortexcellen zonder grit aan te zuigen. Steek vervolgens de pipetpunt in de naafopening van de spuit en werp de inhoud met zachte druk in de spuit. Filter vervolgens de Rickettsia parkeri-cultuur in steriele buizen van 1,5 milliliter door een steriel filter van twee micrometer poriegrootte dat op de spuitnaaf is gemonteerd en centrifugeer de buizen bij 13.600 G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius.

Na het verwijderen van het supernatant, was de celpellet twee keer met 1,2 milliliter ijskoude sucrose-oplossing van 300 millimolaire. Centrifugeer het monster en verwijder het supernatant tussen de wasbeurten. Aan het einde van de centrifugatie resuspendeert u de gepoolde celpellet met 100 tot 150 microliter ijskoude sucrose-oplossing voor respectievelijk twee tot drie transformatiemonsters.

Verdeel het monster vervolgens in aliquots van 50 microliter in voorgekoelde, steriele microcentrifugebuizen van 1,5 microliter. Voor transformatie bij drie microgram endotoxinevrij pRAM18sSFA plasmide-DNA naar elke buis met 50 microliter Rickettsia parkeri op ijs en roer voorzichtig met een pipetpunt. Breng het mengsel over in een voorgekoeld steriel elektroporatiecuvet met een opening van 0,1 centimeter.

Tik voorzichtig op de cuvette om het mengsel gelijkmatig te verdelen en incubeer op ijs gedurende 10 tot 30 minuten. Verwijder ondertussen het medium uit een volledig confluente eerder gekweekte ISE6-celkweekkolf en resuspendeer de cellaag door de cellen voorzichtig te spoelen met 1,5 milliliter vers medium dat natriumbicarbonaat en HEPES-buffer bevat. Breng na het genereren van een homogene celsuspensie het hele volume over in een enkele steriele microcentrifugebuis van twee milliliter.

Elektroporateer vervolgens de Rickettsia parkeri en plasmide DNA mengsel met behulp van een elektroporator. Gebruik na elektroporatie een steriele verlengde pipet met fijne punt om een kleine hoeveelheid van de ISE6-celsuspensie in de cuvette over te brengen en pipet voorzichtig op en neer om de geëlektroporated Rickettsia parkeri te herstellen. Breng vervolgens de inhoud van de cuvette over op de buis van twee milliliter die de rest van de ISE6-celsuspensie bevat.

Centrifugeer vervolgens het monster bij kamertemperatuur, eerst bij 700 G gedurende twee minuten om de ISE6-cellen naar beneden te trekken, en vervolgens bij 13.600 G gedurende één minuut om de Rickettsia naar beneden te trekken. Incubeer de buis bij 34 graden Celsius gedurende 15 minuten tot een uur. Breng na incubatie de geresuspendeerde inhoud van één transformatie over in één celkweekkolf van 25 vierkante centimeter met 3,5 milliliter vers medium met natriumbicarbonaat en HEPES-buffer.

Schommel de kolf om het mengsel gelijkmatig te verdelen en incubeer bij 34 graden Celsius. Voeg na 16 tot 24 uur 10 microliter spectinomycine en streptomycine toe aan de bebroede kolf. Schommel de kolf om de antibiotica gelijkmatig in het medium te mengen voordat de kolf naar de couveuse wordt teruggebracht.

Succesvolle vermeerdering van wild-type Rickettsia parkeri en ISE6 cellen was duidelijk door Giemsa kleuring. De kernen van de ISE6-cellen donkerpaars gekleurd met Giemsa in de intracellulaire en extracellulaire Rickettsi zijn zichtbaar. Transformatie van Rickettsia parkeri die het rode fluorescentie-eiwit in ISE6-cellen tot expressie brengt, werd bevestigd door confocale microscopie na zeven dagen incubatie.

Een aanzienlijke toename van de infectiegraad werd waargenomen na 10 dagen. Houd alles steriel tijdens de hele procedure. Besteed aandacht aan detail en wees geduldig, omdat sommige soorten Rickettsia er lang over doen om te transformeren, vooral langzaam groeiende endosymbionten.

Dit protocol heeft de studie mogelijk gemaakt van meerdere aspecten van rickettsia biologie en hun interacties met hun geleedpotige vectoren en zoogdier gastheren. Fluorescerende eiwitexpressie Rickettsi zijn bijvoorbeeld gebruikt om motiliteit en symbiont tick cell interacties te volgen.