Name: Kweken, invriezen, verwerken en afbeelden van volledige organoïden en sferoïden terwijl ze nog in een hydrogel zitten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-23T14:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Leer een protocol voor het kweken, invriezen en beeldvormen van organoïden en sferoïden in hydrogel met behulp van een multifunctioneel apparaat. Deze methode behoudt de 3D-structuur en verbetert de reproduceerbaarheid in celbiologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We zijn Dale Mertes van de Universiteit van Chicago dankbaar voor het opstellen van diagrammen, dr. Mehmet Serif Aydin voor zijn technische ondersteuning aan het Istanbul Medipol University Research Institute for Health Sciences and Technologies, en dr. Rana Kazemi van de Maltepe University voor het redigeren van het manuscript.

1. Kweken van organoïden en sferoïden
<ol><li>Leg de hydrogel een nacht op ijs (in een koelkast of een koude ruimte) om te ontdooien.</li>
	<li>Plaats het in de handel verkrijgbare multifunctionele apparaat (MD; zie materiaaltabel) 1 dag voor het experiment (37 °C, 5% CO2) in de incubator om op te warmen.</li>
	<li>Plaats steriele pipetpunten met brede uiteinden in de koelkast bij 4 °C. OPMERKING: Stappen 1.1-1.3 moeten worden uitgevoerd op dag 0 en stappen 1.4-1.11 moeten worden uitgevoerd op dag 1.</li>
	<li>Plaats de hydrogel op ijs in een laminaire stromingskap gedurende 15 minuten.<ol><li>Optioneel: Verdun de hydrogel in koud celkweekmedium volgens de aanbeveling van de fabrikant.</li>
	</ol></li>
	<li>Plaats de buis met een pellet hepG2-cellen (commercieel verkregen hepatocellulair carcinoom cellijn; zie materiaaltabel) op ijs.</li>
	<li>Plaat 30-35 μL van 100% hydrogel in de nis van het voorverwarmde apparaat om een geldruppel te creëren.</li>
	<li>Plaats 10.000 HepG2-cellen in het midden van de bovenkant van elke hydrogeldruppel (figuur 2) en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 °C.</li>
	<li>Bedek de hydrogeldruppel met 200 μL Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) met 10% Foetaal Runderserum.</li>
	<li>Bedek het deksel van de MD in de juiste positie om gasstroom mogelijk te maken en plaats het apparaat in de incubator.</li>
	<li>Voed de cellen om de dag met 200 μL DMEM met 10% FBS.</li>
	<li>Controleer de groei van de sferoïden onder een omgekeerde microscoop (figuur 3). De vorming van sferoïden begint na de3e dag. Video 1 toont de locatie van sferoïden op verschillende niveaus in een hydrogelkoepel. OPMERKINGEN: Het wordt sterk aanbevolen om de vloeistof rond de hydrogel voorzichtig op te zuigen en langzaam de nieuwe vloeistof aan het milieu toe te voegen om beschadiging van de hydrogeldruppels te voorkomen.</li>
</ol>2. Hematoxyline en Eosine kleuring van whole-mount organoïden / sferoïden in een hydrogel
<ol><li>Verwarm het fixeermiddel (4% paraformaldehyde; PFA), PBS en Hematoxyline (zie materiaaltabel) tot 37 °C.</li>
	<li>Adem het medium rond de hydrogeldruppel aan met een pipet, voeg 100-200 μL 4% PFA toe om te fixeren en incubeer gedurende 15-20 minuten bij 37 °C.</li>
	<li>Aspirateer de 4% PFA en voeg 200 μL PBS toe om 3x gedurende 5 minuten elk op 37 °C te wassen. Aspirateer vervolgens de PBS en incubeer met 200 μL Hematoxyline-oplossing gedurende 15-20 minuten bij 37 °C.</li>
	<li>Aspirateer de Hematoxyline en voeg 200 μL dH2O toe om 3x gedurende 10 minuten te wassen bij 37 °C. Giet de dH2O aan en incubeer met 200 μL ethanol gedurende 5-10 min bij 37 °C.</li>
	<li>Adem de ethanol op en incubeer met 200 μL eosine (zie materiaaltabel) gedurende 10 minuten bij 37 °C. Adem de Eosine aan en voeg 200 μL dH2O toe om gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT) te wassen.</li>
	<li>Adem de dH2O aan en voeg 100 μL glycerol toe om de hydrogeldruppel als montagemedium te bedekken.</li>
	<li>Optioneel: Monteer de nis met een coverslip. Deze stap kan worden weggelaten om te voorkomen dat organoïden / sferoïden van aanzienlijke omvang worden samengeknepen.</li>
	<li>Sluit het deksel van MD stevig om uitdroging tot onderzoek te voorkomen. Het monster is stabiel voor onderzoek gedurende ten minste 6 maanden.</li>
</ol>3. Immunohistochemie van organoïden/sferoïden in een hydrogel
<ol><li>Verwarm de commercieel verkregen oplossing voor immunohistochemie (S-IHC; zie materiaaltabel) tot 37 °C.</li>
	<li>Incubeer de organoïden of sferoïden in de hydrogel met 3% waterstofperoxide (H2O2) in 200 μL dH2O gedurende 5 minuten bij 37 °C.</li>
	<li>Giet de waterstofperoxideoplossing aan en was in dH2O gedurende 5 minuten bij 37 °C. Aspirateer de dH2O en incubeer tweemaal met 100 μL S-IHC bij 37 °C gedurende elk 10 minuten.</li>
	<li>Aspirateer de S-IHC en incubeer met 100 μL primair antilichaam (zie materiaaltabel) verdund in S-IHC gedurende 1-2 uur bij 37 °C (volgens de aanbevelingen van de fabrikant met betrekking tot werkverdunning).</li>
	<li>Aspirateer de primaire antilichaamoplossing en incubeer met 100 μL S-IHC 3x gedurende 5 minuten elk bij 37 °C.</li>
	<li>Aspirateer 100 μL S-IHC en incubeer met een gebiotinyleerd secundair antilichaam (zie Materiaaltabel) gedurende 10 minuten bij 37 °C.</li>
	<li>Aspirateer de secundaire antilichaamoplossing en incubeer met 100 μL S-IHC 3x gedurende 5 minuten elk bij 37 °C. Aspirateer de S-IHC en incubeer met 100 μL mierikswortelperoxidase (HRP) met het label streptavidin (zie Materiaaltabel) gedurende 10 minuten bij 37 °C.</li>
	<li>Aspirateer de HRP gelabelde streptavidin en incubeer met 100 μL S-IHC 3x gedurende 5 minuten elk bij 37 °C.</li>
	<li>Aspirateer de S-IHC en incubeer met 100 μL DAB/AEC chromogeenoplossingsmengsel (zie materiaaltabel) gedurende 5-10 minuten bij 37 °C.</li>
	<li>Controleer de intensiteit van de kleuring onder een lichtmicroscoop.</li>
	<li>Wassen met dH2O 3x gedurende 2 min elk.</li>
	<li>Optioneel: Incubeer met 100 μL hematoxyline (zie materiaaltabel) voor nucleaire tegenstaining gedurende 5 minuten bij 37 °C.</li>
	<li>Aspirateer de Hematoxyline en was in dH2O gedurende 5 min.</li>
	<li>Adem de dH2O op en bedek de hydrogeldruppel met 100 μL glycerol als montagemedium.</li>
	<li>Sluit het deksel van de MD stevig tot microscopisch onderzoek. OPMERKINGEN: Antigeen ophalen en eiwit blokkerende stappen zijn weggelaten in dit protocol, omdat S-IHC deze stappen elimineert.</li>
</ol>4. Immunofluorescentie-etikettering van organoïden/sferoïden in een hydrogel
<ol><li>Warm de volgende materialen op tot 37 °C: 4% PFA, PBS, S-IF, primaire antilichaamoplossing in S-IF, secundaire antilichaamoplossing in S-IF, nucleaire vlek en glycerol (zie materiaaltabel).</li>
	<li>Aspirateer het celkweekmedium en fixeer met 200 μL 4% PFA gedurende 15-30 min bij 37 °C. Giet het fixeermiddel aan en was het in S-IF 3x gedurende 10 minuten elk bij 37 °C.</li>
	<li>Voeg dH2O toe aan de zijkant rond de nis om vochtigheid te bieden tijdens de volgende stappen.</li>
	<li>Aspirateer de S-IF rond de hydrogeldruppel en incubeer de hydrogeldruppel met 100 μL primaire antilichaamoplossing (zie Materiaaltabel) in S-IF gedurende 30-60 min bij 37 °C.</li>
	<li>Aspirateer de primaire antilichaamoplossing en was in S-IF 3x gedurende 10 minuten elk bij 37 °C.</li>
	<li>Aspirateer de S-IF en incubeer met 100 μL secundaire antilichaamoplossing (zie materiaaltabel) in S-IF gedurende 30-60 min bij 37 °C in het donker.</li>
	<li>Aspirateer de secundaire antilichaamoplossing en was met PBS 3x gedurende 10 minuten elk bij 37 °C in het donker.</li>
	<li>Aspirateer de PBS en incubeer met 100 μL kern-DNA-vlek die in het donker een bevestigingsmedium of glycerol bij 37 °C bevat.</li>
	<li>Vul de nis met glycerol om uitdroging te voorkomen.</li>
	<li>Optioneel: Bedek de nis met een coverslip. Deze stap kan worden weggelaten om te voorkomen dat de organoïden / sferoïden worden samengeknepen.</li>
	<li>Sluit de MD goed af. Monsters in MD's kunnen gedurende ten minste 6 maanden bij 4 °C in het donker worden bewaard met minimaal verlies van fluorescentie.</li>
	<li>Gebruik de volgende instellingen voor confocaal microscopisch onderzoek: stel de pinhole-waarde van alle kanalen in op 20,1, houd de gain master constant op 550 voor 488 nm, 485 voor 550 nm en 450 voor 594 nm, houd het laservermogen constant voor alle experimenten en het laagste percentage op 2,0. OPMERKINGEN: Primaire antilichamen: Anti-Na-K ATPase (1:100), Anti-Arginase (1:50), Anti-Albumine (1:50), Anti-Beta-galactosidase (1:25), Antimitochondrial antibody (1:100), Anti-Golgi Antibody (1:50), Anti-Cytokeratin 5 (1:100), Ov6 antilichaam (1:100). Secundaire antilichamen: Goat anti-Rabbit IgG (H+L)- 488, Goat anti-Rabbit IgG (H+L)-550, Goat anti-Mouse IgG (H+L)-488, Goat anti-Mouse IgG (H+L)-550, Goat anti-Chicken IgY(H+L)-647. De verdunning voor alle secundaire antilichamen is 1:100. Daarnaast wordt ook FITC-Phalloidin (1:100), een geconjugeerd antilichaam, gebruikt (zie Materiaaltabel).</li>
</ol>5. Plasmamembraan en kernetikettering van levende organoïden en sferoïden in een hydrogel
<ol><li>Bereid etiketteringsoplossing met Alexa fluor tarwekiem agglutinine (5,0 μg / ml) en Hoechst (2 μM) in Hank's gebalanceerde zoutoplossing (HBSS), volgens de aanbevelingen van de fabrikant (zie Tabel met materialen), en warm op tot 37 °C.</li>
	<li>Aspirateer het celkweekmedium en voeg 100 μL etiketteeroplossing toe om de hydrogeldruppel te bedekken. Incubeer gedurende 15-30 min bij 37 °C.</li>
	<li>Verwijder de etiketteeroplossing en was tweemaal in PBS 2x gedurende 10 minuten elk op 37 °C. Optioneel: Fixeer met 200 μL 4% formaldehyde gedurende 15 min bij 37 °C.</li>
	<li>Bedek de hydrogeldruppel met glycerol als bevestigingsmedium. Optioneel: Monteer de nis met een afdekglas.</li>
	<li>Sluit het deksel van de MD goed en bewaar het gekoeld in het donker tot fluorescentie / confocaal microscopisch onderzoek. Het is stabiel voor ten minste 6 maanden.</li>
</ol>6. Invriezen en ontdooien van organoïden/sferoïden in een hydrogel
<ol><li>Vries de organoïden in volgens de onderstaande stappen.<ol><li>Warm de in de handel verkregen vriesoplossing (FS; zie materiaaltabel) op tot 37 °C.</li>
		<li>Adem de celkweekmedia rond de hydrogelkoepel voorzichtig aan.</li>
		<li>Voeg voorzichtig 200 μL FS toe. Incubeer het monster met FS bij 37 °C gedurende 1 uur.</li>
		<li>Sluit het deksel van het apparaat goed en plaats het in een schuimdoos. Plaats deze schuimdoos in een andere schuimdoos, zoals weergegeven in aanvullende figuur 3. Sluit beide schuimdozen goed af. Twee schuimdozen in elkaar zorgen voor een temperatuurkoelingsgradiëntbereik van 1 tot 2° C/min van het monster in een vriezer van -20 °C.</li>
		<li>Plaats de doos gedurende 2 uur op -20 °C. Breng de doos over in een vriezer van -80 °C en laat hem een nacht staan.</li>
		<li>Haal het monster uit de dozen. Het monster in de MD kan gedurende 6 maanden in de vriezer van -80 °C worden bewaard.</li>
		<li>Breng de MD die het monster bevat over naar de tank met vloeibare stikstof voor opslag op langere termijn.</li>
	</ol></li>
	<li>Ontdooi de organoïden volgens de onderstaande stappen.<ol><li>Haal het MD met het monster uit de vriezer/stikstoftank en plaats het direct in een incubator bij 37 °C. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C.</li>
		<li>Voeg 200 μL warm kweekmedium toe aan de nis (de verhouding tussen FS en celkweekmedium is 1:1) en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C.</li>
		<li>Voeg meer warm kweekmedium toe aan de niche (de verhouding tussen FS en celkweekmedium is 1:2) en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C.</li>
		<li>Aspirateer het medium en FS mengsel voorzichtig. Ga verder met scanning elektronenmicroscopie (stap 7) en transmissie-elektronenmicroscopie (stap 8) beeldvorming van de organoïden/sferoïden in de hydrogel.</li>
	</ol></li>
</ol>7. Scanning elektronenmicroscopie van organoïden/sferoïden met hele montering
<ol><li>Warm Karnovsky's fixatieve en post-fixatieve oplossing (zie Tabel van Materialen) op tot kamertemperatuur (RT).</li>
	<li>Aspirateer het celkweekmedium rond de hydrogel in de MD. Plaats het monster in de MD op ijs in de laminaire stromingskap gedurende 15 minuten.</li>
	<li>Adem de vloeibare hydrogel rond de organoïden/sferoïden heel voorzichtig aan. Een beperkte hoeveelheid matrigel kan in de niche blijven om te voorkomen dat het monster wordt beschadigd en verloren.</li>
	<li>Fix met Karnovsky's fixatief (2% PFA, 2,5% glutaaraldehyde in 0,15 M cacodylaatbuffer en 2 mM CaCl2; zie Tabel van materialen) bij RT gedurende 1 uur.</li>
	<li>Giet het fixeermiddel voorzichtig aan en was met gedestilleerd water (dH2O) 3x gedurende 15 minuten per stuk.</li>
	<li>Adem de dH2O voorzichtig aan en fixeer met postfixatieve oplossing (1% waterig osmiumtetroxide [OsO4]; zie Materiaaltabel) bij RT gedurende 1 uur.</li>
	<li>Aspirateer het postfixatiemiddel voorzichtig en was met gedestilleerd water (dH2O) 3x gedurende 15 minuten elk.</li>
	<li>Droog uit in een gesorteerde reeks ethanol (30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 96%, 100%), mengsel van ethanol/aceton (1:1; 1:2) en absolute aceton bij RT gedurende elk 15 minuten.</li>
	<li>Droog met een kritische puntdroger.</li>
	<li>Bekleed het monster in het apparaat met 6 nm goud/palladium met behulp van een sputtercoater (zie Materiaaltabel) gedurende 90 s.</li>
	<li>Observeer onder een scanning elektronenmicroscoop met een in-lens secundaire elektronendetector bij 2-3 kV in vacuümmodus (5 x 10-6 mA). Maak foto's met een werkafstand van 8,1-8,2 mm en met vergrotingen van 675x, 1050x en 1570x. OPMERKINGEN: Alle stappen worden uitgevoerd in de MD. Gebruik 200-250 μL oplossing voor elke stap.</li>
</ol>8. Transmissie-elektronenmicroscopie van organoïden/sferoïden in een hydrogel
<ol><li>Warm Karnovsky's fixatief op tot 37 °C. Aspirateer het celkweekmedium rond de hydrogel in de MD.</li>
	<li>Bevestig het monster met Karnovsky's fixatief op RT gedurende 1 uur. Was met dH2O 3x gedurende 15 minuten per stuk.</li>
	<li>Post-fix met 2% waterig OsO4 en 2,5% kaliumferrocyanide bij RT gedurende 45 min. Wassen met dH2O 3x gedurende 10 min elk.</li>
	<li>Incubeer in 0,5% Thiocarbohydrazide (TCH; zie Tabel van Materialen) bij RT gedurende 30 min. Wassen met dH2O 3x gedurende 10 min elk.</li>
	<li>Incubeer in 2% waterige OsO4 op RT gedurende 30 min. Wassen met dH2O 3x gedurende 10 min elk.</li>
	<li>Incubeer in 2% uranylacetaatoplossing (zie materiaaltabel) bij RT gedurende 1 uur. OPMERKING: In deze stap kunnen sferoïden 's nachts bij 4 °C worden gehouden.</li>
	<li>Incubeer in lood aspartaatoplossing (zie materiaaltabel) bij 60 °C gedurende 45 minuten. Wassen met dH2O 3x gedurende 10 min elk.</li>
	<li>Droog uit in een gegradeerde reeks ethanol (50%, 70%, 90%, 100% [x2]) en absolute aceton bij RT gedurende elk 15 minuten.</li>
	<li>Behandel met een mengsel van (1:1; 1:2) aceton/eponhars en zuivere eponhars (zie materiaaltabel) op RT gedurende elk 2 uur.</li>
	<li>Polymeriseer de hars bij 60 °C 's nachts (minimaal 16 uur). Verwijder na de polymerisatie het harsblok uit de MD, zoals weergegeven in aanvullende figuur 4.</li>
	<li>Bevestig het harsblok aan een groter blok met een harslijm. Snijd het blok bij en bereik de locatie van organoïden of sferoïden.</li>
	<li>Krijg halfdunne (1.000 nm) en ultradunne secties (60 nm) met behulp van een ultramicrotoom (zie Materiaaltabel).</li>
	<li>Plaats de ultradunne secties op 100 mesh koperen roosters en observeer onder een scanning elektronenmicroscoop met een STEM-detector bij een versnellende spanning van 30 kV. Leg beelden vast met een werkafstand van 44 mm en met vergrotingen van 2580x, 5020x en 6060x. OPMERKINGEN: Gebruik 200-250 μL oplossing voor elke stap. Stappen 8.1-8.10 worden uitgevoerd in de MD.</li>
</ol>

Ranan Gulhan Aktas is eigenaar van MD, S-IHC, S-IF en FS patentaanvragen. Olgu Enis Tok was betrokken bij de ontwikkeling van deze producten. Olgu Enis Tok en Gamze Demirel zijn R&D-teamleden van het bedrijf genaamd Cellorama. Yusuf Mustafa Saatci, Zeynep Akbulut en Ozgecan Kayalar hebben geen belangenconflicten te melden.

De MD, als aanvulling op formuleringen en protocollen die hier worden beschreven, vergemakkelijkt snelle en spontane 3D-groei van organoïden en sferoïden in een meer gecontroleerde omgeving en zet het experiment voort in dezelfde omstandigheden. Het monster blijft gedurende het hele proces in dezelfde omgeving en bijna 100% van de 3D-groeiarchitecturen blijven intact in de container. Dit verbetert de homogeniteit tijdens de sequentiële experimenten en maakt een langere kweekperiode mogelijk. Bovendien is het aantal stapp...

De toekomst van celonderzoek en -therapie ligt binnen 3D-celculturen 1,2,3. Organoïde en sferoïde modellen dichten de kloof tussen in vitro experimenten en diermodellen door betere modellen te maken die de ontwikkeling van het menselijk lichaam, fysiologie en ziekten nabootsen 4,5,6,7,8,9. De reproduceerbaarheid en herhaalbaarheid van deze modellen blijven echter een uitdaging. Bovendien resulteert het hanteren, oogsten, overbrengen en centrifugeren van deze structuren met de huidige technologieën in verlies of beschadiging van de organoïden en sferoïden in veel omstandigheden, wat de resultaten aanzienlijk beïnvloedt.

Ondanks vele protocollen voor histologische kleuring, immunohistochemische kleuring, immunofluorescentie-etikettering en cryopreservatie, is er geen universele benadering met betrekking tot het standaardiseren van experimentele omstandigheden, het hanteren en verwerken van deze delicate structuren zonder ze te verliezen of te beschadigen. De huidige protocollen zijn ook ongelooflijk lang, afwisselend van enkele dagen tot enkele weken, en omvatten complexe procedures met verschillende reagentia 10,11,12,13,14. Bovendien veroorzaken het oogsten, pipetteren, centrifugen en overbrengen van 3D-groeistructuren tussen celkweekvaten en cryovialen veranderingen in de positionering van de structuren en mechanische krachten en beïnvloeden ze uiteindelijk de differentiatie en rijping van de organoïden en sferoïden. Er is gemeld dat weefseltopologie, positionering van de cellen en mechanische krachten een significante invloed hebben op celdifferentiatie en rijping 6,15,16,17.

Daarom is het wenselijk om de huidige conventionele technologieën te verbeteren om organoïden en sferoïden met stabiele kwaliteit te genereren. Een methode/apparaat dat de hierboven beschreven centrifugatie en andere stappen overslaat en het materiaal van het begin tot het einde van de meerdere processen in één veilige omgeving levert, zou gunstig zijn om de meest consistente en betrouwbare gegevens te bereiken. Bovendien zal dit de tijds-, arbeids- en kostenbeperkingen verminderen.
Het hier beschreven multipurpose device (MD) biedt één veilige omgeving voor meerdere processen van organoïden en sferoïden (aanvullende figuur 1). Dit apparaat en aanvullende protocollen elimineren de stappen voor het oogsten, pipetteren, overbrengen en centrifugeren. De organoïden en sferoïden blijven in hun in vitro omgeving tijdens de sequentiële processen. Deze omgeving bestaat voornamelijk uit natuurlijke of synthetische extracellulaire matrixcomponenten, zoals in de handel verkrijgbare hydrogels. Met andere woorden, de hier beschreven methoden maken het mogelijk om een monster van organoïden / sferoïden in zijn geheel te verwerken, te onderzoeken en te invriezen terwijl het nog in een hydrogeldruppel zit.
Het biocompatibele apparaat is bestand tegen temperaturen tussen 60 °C en -160 °C, wat het mogelijk maakt om de organoïden/steroïden in een tank met vloeibare stikstof bij -160 °C te herstellen of om harsblokken voor te bereiden voor elektronenmicroscopie bij 60 °C. De niche in het apparaat is ontworpen om een beperkte ruimte voor 3D-groeistructuren te definiëren en de vorming van sferoïden of organoïden te stimuleren op basis van de vorige studies 18,19,20,21,22,23. Dat deel van het apparaat is transparant en bevat een specifieke kunststof die een hoge optische kwaliteit biedt (brekingsindex: 1,43; abbewaarde: 58; dikte: 7,8 mil [0,0078 in of 198 μm]). Zowel de nis als het omringende 'zijdeel' veroorzaken autofluorescentie. De transparante nis in het midden heeft een 80 mm2-oppervlak, terwijl het zijgedeelte 600 mm2 is. De diepte van de container is 15 mm en de dikte is 1,5 mm. Deze kenmerken, naast de grootte en het ontwerp van het apparaat, maken het mogelijk om waarnemingen te doen onder verschillende soorten hightech microscoop en de monsters voor te bereiden op elektronenmicroscopisch onderzoek (figuur 2). Het sluitsysteem van het apparaat biedt twee posities, een verzegeld in de vriezer en de andere waardoor gasstroom in de incubator mogelijk is. CCK8-proliferatie- en cytotoxiciteitstests tonen vergelijkbare effecten op cellen in vergelijking met de traditionele celkweekschalen (aanvullende figuur 2). Trypan blue exclusion test toont een hoge levensvatbaarheid van cellen (94%) tijdens de celkweek in de MD (figuur 3).
De processen die kunnen worden uitgevoerd voor één monster in het enkele apparaat omvatten (1) kweken, (2) histologische kleuring, (3) immunostaining, inclusief immunohistochemische en immunofluorescentielabeling, (4) invriezen, (5) ontdooien, (6) onderzoeken onder optische microscopen, zoals brightfield,darkfield, fluorescentie, confocale en superresolutie microscopen, (7) coating en onderzoek rechtstreeks onder een scanning elektronenmicroscoop, of (8) voorbereiding op transmissie-elektronenmicroscopie ( Figuur 2).
Er bestaan verschillende methodologieën voor histologische kleuring, immunohistochemische etikettering of fluorescerend labelen van organoïden en sferoïden 10,11,12,13,14,24,25. Het oogsten van hen uit de hydrogel is de eerste en belangrijkste stap van de huidige technologie. Na deze stap maken sommige methoden immuno-labeling met hele mount mogelijk. De geoogste organoïden zijn ingebed in paraffine, gesegmenteerd en gelabeld voor kleuring en immunostaining in anderen. Het is echter mogelijk dat de secties niet het volledige monster presenteren en slechts beperkte gegevens bevatten met betrekking tot de 3D-architectuur van de structuur. Bovendien zijn schade aan deze 3D-structuren en verlies van antigeniciteit bekende bijwerkingen van deze technologieën.
De aanvullende nieuwe protocollen voor microscopisch onderzoek in dit artikel maken een analyse mogelijk van monsters van de hele montering die nog in een hydrogel zitten. De hier beschreven protocollen omvatten twee nieuw ontwikkelde formuleringen: oplossing voor immunohistochemie (S-IHC) en oplossing voor immunofluorescentie-etikettering (S-IF). De methoden met deze oplossingen stellen onderzoekers in staat om nauwkeurigere gegevens te verkrijgen, omdat er geen schadelijke effecten zijn van traditionele workflows, zoals centrifuging, pipetteren en overbrengen van de delicate structuren. Het hier beschreven protocol elimineert ook de noodzaak voor het oogsten, blokkeren, opruimen en ophalen van antigeen en verkort de hele procedure tot 6-8 uur. Bovendien maakt de methodologie het mogelijk om tegelijkertijd één tot drie antilichamen toe te voegen aan dezelfde S-IF. Daarom is het mogelijk om de resultaten op dezelfde dag te krijgen, zelfs na de meerdere etiketteringsexperimenten, wat een ander voordeel is van het hier beschreven protocol; traditionele immunofluorescentie-etiketteringsprotocollen met hele mount duren meestal tussen de 3 dagen en enkele weken 10,11,12,13,14.
Paraffine-inbedding, een andere schadelijke stap die de antigeniciteit vermindert, wordt ook weggelaten. De 3D-structuur blijft in zijn in vitro omgeving van het begin tot het einde van het microscopisch onderzoek. Omdat de 3D-structuur in zijn groeiomstandigheden blijft, bootsen de eiwitexpressie- en lokalisatiegegevens in vivo omstandigheden beter na. Er worden nauwkeurigere resultaten verwacht, omdat de methodologie de stappen elimineert die de antigeenexpressie van het monster beïnvloeden. Tabel 1 en tabel 2 laten zien hoe deze nieuwe protocollen stappen elimineren, tijd en arbeid in het laboratorium besparen en kosten en afvalproducten verlagen in vergelijking met traditionele workflows.
Naast de cruciale stappen die hierboven zijn beschreven, is een ander probleem het bieden van een cryopreservatiemedium en een methode om de 3D-structuur van het monster te behouden met hogere levensvatbaarheidssnelhedenvan cellen 26,27,28,29,30,31. Cryopreservatie is essentieel voor het creëren van een stabiel modelsysteem en het mogelijk maken van de biobanking van organoïden en sferoïden32,33. Biobanking van de hele originele 3D-structuur zal een meer getrouwe recapitulatie van de natuurlijke gezondheidstoestand of ziekte mogelijk maken. De belangrijkste overwegingen zijn het gemak en de betrouwbaarheid van cryopreservatie en het ontdooien van organoïden / sferoïden. Post-dooi organoïde herstel is zeer laag in de meeste huidige technologieën, vaak minder dan 50%. Recente studies hebben echter veelbelovende resultaten laten zien met verbeterde overlevingskansenvan 26,27,28,29. Lee et al. toonden aan dat 78% van de sferoïde cellen overleefde na cryopreservatie toen ze de oplossing van de Universiteit van Wisconsin gebruikten die 15% DMSO28 bevatte. De celoverlevingsratio steeg tot 83% in de studie van Arai et al.29. De resultaten na cryopreservatie worden echter aanzienlijk beïnvloed, omdat de 3D-structuren niet dezelfde kenmerken en kwaliteit kunnen behouden. Bovendien zijn serumvrije reagentia vereist voor goede productiepraktijken in farmaceutische en diagnostische omgevingen. Traditionele workflows gebruiken een medium met foetaal runderserum (FBS) en dimethylsulfoxide (DMSO) voor de langzaam invriezende methode, die beide geassocieerd zijn met handicaps. FBS is een dierlijk product en kan batchvariaties hebben. DMSO is een zeer succesvol cryoprotectant, maar langdurige blootstelling, vooral tijdens het ontdooien, kan cytotoxische effecten veroorzaken30,31.
Dit artikel beschrijft ook de bevriezings-/ontdooimethode van hele organoïden of sferoïden terwijl ze nog in een hydrogel zitten. In het onderzoek worden twee formules voor het invriezen van organoïden en sferoïden gebruikt: (1) 10% DMSO met traditionele vriesoplossing (FS) en (2) een serum- en DMSO-vrij cryopreservatiemedium. Dit cryopreservatiemedium bevat extracellulaire matrixcomponenten, die verschillen van de huidige formules. De extracellulaire matrix bestaat uit twee hoofdklassen van macromoleculen, proteoglycanen en vezelige eiwitten, die essentieel zijn voor fysieke steigers voor de cellulaire bestanddelen, maar ook processen initiëren die nodig zijn voor weefselmorfogenese, differentiatie en homeostase 34,35,36,37,38,39,40 . Collageen biedt treksterkte, reguleert de celadhesie, ondersteunt chemotaxis en migratie en directe weefselontwikkeling37. Bovendien bieden elastinevezels terugslag naar weefsels die herhaalde rek ondergaan38. Een derde vezelig eiwit, fibronectine, stuurt de organisatie van de interstitiële extracellulaire matrix en heeft een cruciale rol bij het bemiddelen van celaanhechting en functioneert als een extracellulaire mechano-regulator39. Du et al. hebben het cryoprotectieve effect van kippencollageenhydrolysaat op het natuurlijke actomyosinemodelsysteem41 aangetoond. Hun resultaten suggereren dat collageenhydrolysaat de groei van ijskristallen kan remmen, eiwitbevriezing en oxidatie kan verminderen, vergelijkbaar met commerciële cryoprotectanten, en een betere gelstructuur kan bieden na vries-dooicycli. Daarom biedt het toevoegen van extracellulaire matrixcomponenten aan de cryopreservatiemedia een veiligere en beschermende omgeving voor het monster en ondersteunt het de levende structuren om te genezen na bevriezing-ontdooien.
Bovendien beschrijft de huidige studie een eenvoudig protocol om cytoplasmatische membranen en kernen van levende organoïden en sferoïden te labelen terwijl ze zich nog in de hydrogel bevinden.

<table><tbody><tr><td>Absolute Ethanol (EtOH)</td><td>Merck</td><td>8187602500</td><td>Verdunnen in dH2O om 30%, 50%, 70%, 80%, 90% en 96% oplossing te maken en bewaar bij RT</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Merck</td><td>8222512500</td><td>Bewaar bij RT</td></tr><tr><td>Alexa fluor wheat germ agglutinin en Hoechst&nbsp; in Hank's balanced salt solution (HBSS) &nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>I34406</td><td>Image-IT LIVE Plasma Membrane and Nuclear Labeling Kit, Bewaar bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Alpha-1-Fetoprotein (AFP) Concentrated and Prediluted Polyclonal Antibody</td><td>Biocare Medical</td><td>CP 028 A</td><td>Bewaar bij +4 &deg;C</td></tr><tr><td>Anti-albumin antibody</td><td>Abcam</td><td>EPR20195</td><td>Bewaar bij +4 &deg;C, Dilutie: 1:50</td></tr><tr><td>Anti-beta galactosidase antibody, Chicken polyclonal</td><td>Abcam</td><td>134435</td><td>Bewaar bij +4 &deg;C, Dilutie: 1:25</td></tr><tr><td>Anti-cytokeratin 5</td><td>Abcam</td><td>53121</td><td>Bewaar bij +4 &deg;C, Dilutie: 1:100</td></tr><tr><td>Arginase-1 Concentrated and Prediluted Rabbit Monoclonal Antibody</td><td>Biocare Medical</td><td>ACI 3058 A, B</td><td>Bewaar bij +4 &deg;C, Dilutie: 1:50</td></tr><tr><td>Calcium chloride (CaCl2)</td><td>Sigma</td><td>C1016-500G</td><td>Oplossen in Karnovsky's fixatiemiddel om 2 mM CaCl2 te maken; bewaar bij RT</td></tr><tr><td>Cell Counting Kit 8 (WST-8 / CCK8)</td><td>Abcam</td><td>ab228554</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge tubes, 15 mL&nbsp;</td><td>Nest</td><td>601051</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge tubes, 50 mL&nbsp;</td><td>Nest</td><td>602052</td><td></td></tr><tr><td>Class II Microbiological Safety Cabinet Bio II Advance Plus</td><td>Telstar</td><td>EN12469</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Incubator</td><td>Panasonic</td><td>KM-CC17RU2</td><td></td></tr><tr><td>Copper Grids</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>G100-Cu</td><td>Ultradunne secties op de roosters; 100 lijnen/inch vierkante mesh</td></tr><tr><td>Critical Point Dryer</td><td>Leica</td><td>EM CPD300</td><td>Voor het drogen van biologische monsters voor SEM toepassingen in absolute aceton</td></tr><tr><td>DAB/AEC chromogen solution mixture &nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>AEC101</td><td>Bewaar bij +4 &deg;C</td></tr><tr><td>Diamond knife</td><td>Diatome</td><td>Ultra 45&deg;, 40-US</td><td>Gebruik voor ultradunne secties voor TEM</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide for molecular biology</td><td>Biofroxx</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Plastic Pasteur Pippettes</td><td>Nest</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Gibco</td><td>41966-029</td><td>Bewaar bij +4 &deg;C</td></tr><tr><td>Eosin Y Solution Alcoholic</td><td>Bright Slide</td><td>2.BS01-105-1000</td><td></td></tr><tr><td>Epon resin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>45359-1EA-F</td><td>Epoxy Embedding Medium kit, Bewaar bij +4 &deg;C</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum with Additive Fortifier</td><td>Pan Biotech</td><td>P30-3304</td><td>Bewaar bij +4 &deg;C</td></tr><tr><td>Freezing Solution (FS)</td><td>Cellorama</td><td>CellO-F</td><td>Bewaar bij +4 &deg;C</td></tr><tr><td>Glass knife maker</td><td>Leica</td><td>EM KMR3</td><td>Voor het maken van glazen messen in 8 mm dikte</td></tr><tr><td>Glass knife strips (Size 8 mm x 25.4 mm x 400 mm)</td><td>Leica</td><td>7890-08</td><td>Gebruik voor ultra- of semi-dunne secties voor TEM</td></tr><tr><td>Glutaraldehyde Aqueous Solution, EM grade, 25%&nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>16210</td><td>Verdunnen in dH2O om 2.5% oplossing te maken en bewaar bij +4 &deg;C</td></tr><tr><td>Glycerol solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>56-81-5</td><td>Bewaar bij -20 C, Dilutie :1:100</td></tr><tr><td>Goat anti-chicken IgY (H+L) Secondary Antibody,Alexa, 647</td><td>Invitrogen</td><td>A32933</td><td>Bewaar bij RT</td></tr><tr><td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 488</td><td>Invitrogen</td><td>35502</td><td>Bewaar bij +4 &deg;C,&nbsp; Dilutie :1:50</td></tr><tr><td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 550</td><td>Invitrogen</td><td>84540</td><td>Bewaar bij +4 &deg;C,&nbsp; Dilutie :1:50</td></tr><tr><td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 488</td><td>Invitrogen</td><td>35552</td><td>Bewaar bij +4 &deg;C,&nbsp; Dilutie :1:50</td></tr><tr><td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 550</td><td>Invitrogen</td><td>84541</td><td>Bewaar bij +4 &deg;C</td></tr><tr><td>Hematoxylin Harris&nbsp;</td><td>Bright Slide</td><td>2.BS01-104-1000</td><td></td></tr><tr><td>HepG2 cells</td><td>ATCC</td><td>HB-8065</td><td>Bewaar in stikstoftank</td></tr><tr><td>Human/Rat OV-6 Antibody Monoclonal Mouse IgG1 Clone # OV-6</td><td>R&amp;D Systems</td><td>MAB2020</td><td>Bewaar bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Hydrogel</td><td>Corning</td><td>354248</td><td>Matrigel, Basement Membrane Matrix High Concentration (HC), LDEV-free, 10 mL, Bewaar bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Hydrogel</td><td>Corning</td><td>354234</td><td>Matrigel, Basement Membrane Matrix, LDEV-free, 10 mL, Bewaar bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Hydrogel</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>A1413201</td><td>Geltrex, LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td></tr><tr><td>Hydrogel</td><td>Biotechne, R&amp;D Systems</td><td>BME001-01</td><td>Cultrex Ultramatrix RGF BME, Bewaar bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Karnovsky's fixative</td><td></td><td></td><td>%2 PFA, %2.5 Glutaraldehyde in 0.15 M Cacodylate Buffer, 2 mM CaCl2; vers bereiden; gebruik voor TEM &amp; SEM monsters</td></tr><tr><td>L-Aspartic acid</td><td>Sigma</td><td>11189-100G</td><td>Bewaar bij RT</td></tr><tr><td>Lead aspartate solution</td><td></td><td></td><td>Los 40

kweken, invriezen, verwerken en afbeelden van volledige organoïden en sferoïden terwijl ze nog in een hydrogel zitten

Culturing, Freezing, Processing, and Imaging of Entire Organoids and Spheroids While Still in a Hydrogel

Organoïden en sferoïden, driedimensionale groeistructuren in celkweeklaboratoria, worden steeds meer erkend als superieure modellen in vergelijking met tweedimensionale kweekmodellen, omdat ze het menselijk lichaam beter nabootsen en voordelen hebben ten opzichte van dierstudies. Deze studies hebben echter vaak problemen met reproduceerbaarheid en consistentie. Tijdens de lange experimentele processen - met overdrachten van organoïden en sferoïden tussen verschillende celkweekvaten, pipetteren en centrifugeren - worden deze gevoelige en fragiele 3D-groeistructuren vaak beschadigd of verloren. Uiteindelijk worden de resultaten aanzienlijk beïnvloed, omdat de 3D-structuren niet dezelfde kenmerken en kwaliteit kunnen behouden. De hier beschreven methoden minimaliseren deze stressvolle stappen en zorgen voor een veilige en consistente omgeving voor organoïden en sferoïden gedurende de hele verwerkingssequentie terwijl ze zich nog in een hydrogel in een multifunctioneel apparaat bevinden. De onderzoekers kunnen groeien, bevriezen, ontdooien, verwerken, vlekken, labelen en vervolgens de structuur van organoïden of sferoïden onderzoeken onder verschillende hightech-instrumenten, van confocale tot elektronenmicroscopen, met behulp van een enkel multifunctioneel apparaat. Deze technologie verbetert de reproduceerbaarheid, betrouwbaarheid en validiteit van de studies, terwijl een stabiele en beschermende omgeving voor de 3D-groeistructuren tijdens de verwerking behouden blijft. Bovendien minimaliseert het elimineren van stressvolle stappen afhandelingsfouten, vermindert het de benodigde tijd en vermindert het het risico op besmetting.

Dit artikel vertegenwoordigt een multifunctioneel apparaat (MD) en vormt een aanvulling op methodologieën voor het kweken, bevriezen, ontdooien, histologische kleuring, immunohistochemische kleuring, immunofluorescentie-etikettering, coating en verwerking van volledige organoïden of sferoïden terwijl ze zich nog in een hydrogel bevinden in een enkele uniek ontworpen omgeving. De huidige studie is ontworpen om HepG2-leverkankersferoïden te bereiden in 35 hydrogeldruppels in 35 MD's. Experimenten werden uitgevoerd in driev...

De huidige studie beschrijft methodologieën voor het kweken, bevriezen, ontdooien, verwerken, kleuren, labelen en onderzoeken van volledige sferoïden en organoïden onder verschillende microscopen, terwijl ze intact blijven in een hydrogel in een multifunctioneel apparaat.

Kweken, invriezen, verwerken en afbeelden van volledige organoïden en sferoïden terwijl ze nog in een hydrogel zitten

Organoids and spheroids, three-dimensional growing structures in cell culture labs, are becoming increasingly recognized as superior models compared to ...

Organoïden en sferoïden, die zeer kwetsbaar zijn, raken ernstig beschadigd tijdens het hanteren. Ons protocol zorgt ervoor dat deze 3D-teeltstructuren intact blijven tijdens verschillende processen, waardoor de nauwkeurigheid, reproduceerbaarheid, betrouwbaarheid en herhaalbaarheid toenemen. De onderzoeker kan hele organoïden en sferoïden kweken, bevriezen, ontdooien, verwerken, beitsen, labelen en onderzoeken onder verschillende microscopen terwijl ze intact blijven in een hydrogel in een enkel multifunctioneel apparaat.Het maakt het mogelijk om een ziektemodel te maken en sequentiële stappen in één multifunctioneel apparaat te volgen. De technologie brengt meer nauwkeurigheid bij het onderzoeken van biomarkers voor diagnose en prognose van ziekten. Deze methode kan worden toegepast op elk 3D-groeisysteem, inclusief organoïden, sferoïden, individuele cellen of levende organismen.Om de organoïde of sferoïde cultuur te beginnen, plaatst u de goed ontdooide hydrogel gedurende 15 minuten op ijs in een laminaire stromingskap. Houd ook de buis met een pellet van het hepatocellulair carcinoom, of HEPG2-cellen, op ijs. Vervolgens plaat 30 tot 35 microliter 100% hydrogel binnen de nis van het voorverwarmde multifunctionele apparaat om een geldruppel te maken, plaats 10.000 HEPG2-cellen in het midden van de bovenkant van de hydrogeldruppel en incubeer de opstelling bij 37 graden Celsius gedurende 15 minuten.Bedek na incubatie de hydrogeldruppel met 200 microliter Dulbecco's Modified Eagle Medium, of DMEM, met 10% foetaal runderserum of FBS. Plaats het deksel op de juiste manier op het apparaat, zodat het gas kan stromen, voordat u het in de incubator plaatst. Voed de cellen om de dag met 200 microliter DMEM met 10% FBS.Controleer de groei van de sferoïden onder een omgekeerde microscoop. Voordat u begint met immunofluorescentie-etikettering van de organoïden, warmt u de benodigde media en oplossingen op tot 37 graden Celsius. Adem het celkweekmedium rond de hydrogeldruppel aan voordat u 200 microliter 4% paraformaldehyde toevoegt, voorverwarmd tot 37 graden Celsius en fixeer het door het gedurende 15 tot 30 minuten in een incubator op 37 graden Celsius te plaatsen.Aspirateer vervolgens het fixatiemiddel en was de oplossing voor immunofluorescentielabeling, of SIF, drie keer voorverwarmd tot 37 graden Celsius gedurende 10 minuten elk. Voeg gedestilleerd water toe aan het gebied rond de nis om vochtigheid te bieden voordat u doorgaat met de volgende stappen. Aspirateer de SIF rond de hydrogeldruppel en voeg 100 microliter van de voorverwarmde primaire antilichaamoplossing in SIF toe aan de hydrogel voordat u deze gedurende 30 tot 60 minuten bij 37 graden Celsius incubeert.Aspirateer vervolgens de primaire antilichaamoplossing en was met SIF voorverwarmd tot 37 graden Celsius drie keer gedurende 10 minuten elk. Na de wasbeurt zuigt u de resterende SIF aan en voegt u 100 microliter van de voorverwarmde secundaire antilichaamoplossing in SIF toe aan de hydrogel. Incubeer de hydrogel bij 37 graden Celsius in het donker gedurende 30 tot 60 minuten.Na de incubatie aspirateer de secundaire antilichaamoplossing en was de hydrogeldruppel met PBS op 37 graden Celsius drie keer in het donker gedurende 10 minuten elk. Zuig vervolgens de resterende PBS op en incubeer de hydrogel met 100 microliter nucleaire DNA-vlek met montagemedium of glycerol bij 37 graden Celsius in het donker. Vul de nis met glycerol om drogen te voorkomen voordat u het multifunctionele apparaat met de hydrogel goed sluit.Om de organoïden te onderzoeken door middel van confocale microscopie, stelt u de microscoopparameters in volgens de instructies in het manuscript. Om de organoïden te bevriezen, aspirateert u de celkweekmedia, voegt u 200 microliter van de voorverwarmde vriesoplossing toe en incubeert u het monster gedurende een uur bij 37 graden Celsius. Sluit het deksel van het apparaat goed voordat u het in een schuimdoos plaatst.Plaats deze schuimdoos in een andere schuimdoos en sluit beide schuimdozen goed af. Bewaar de doos twee uur op min 20 graden Celsius en laat hem dan een nacht in een vriezer van min 80 graden Celsius staan. Om de organoïden langer dan zes maanden te bewaren, verwijdert u het multifunctionele apparaat met de organoïden uit de dozen en brengt u het over naar de tank met vloeibare stikstof.Om de organoïden te ontdooien, haalt u het multifunctionele apparaat met het monster uit de vriezer of de tank met vloeibare stikstof en plaatst u het rechtstreeks in een incubator bij 37 graden Celsius. Eenmaal ontdooid, zuigt u voorzichtig het medium- en vriesoplossingmengsel op voordat u vers medium toevoegt en verder gaat met het in beeld brengen van de organoïde hydrogel met hele montage. In live beeldvorming werden de groeiende organoïden in de hydrogel drie tot vijf dagen na het inbrengen van de celpellet zichtbaar, vooral aan de rand van de hydrogelkoepel.De tijdreeks van beelden op verschillende niveaus van een hydrogel met sferoïden onder een omgekeerde fasecontrastmicroscoop wordt hier weergegeven. Confocale microscopiebeelden van de levende organoïden met hele mount na live-kleuring van het celmembraan en de kern vertoonden een vergelijkbare labelingsdichtheid in de periferie en het centrum. Verder kan de immunofluorescentie-etikettering van de steroïden met hele mount met succes worden uitgevoerd met één antilichaam, twee antilichamen en drie antilichamen, waardoor er geen extra behandelingsstappen nodig zijn.De representatieve analyse toont twee immunofluorescent-gelabelde luchtwegorganoïden in een apparaat. SEM-afbeeldingen van de volledige sferoïden in het multifunctionele apparaat en 10 afbeeldingen van gesegmenteerde steroïden duidden op een goed bewaard gebleven 3D-architectuur van sferoïden, cytoplasmatische organellen en andere ultrastructurele cellulaire kenmerken, wat de effectiviteit van het beschreven protocol aantoont. Onregelmatigheid aan de grenzen van de hydrogelkoepel was duidelijk na het invriezen van de monsters.De grootte en rondheid van de sferoïden bleven echter vergelijkbaar. Celmigratie op het kweekoppervlak werd waargenomen na het ontdooien van de bevroren monsters. De techniek is heel eenvoudig.De onderzoeker moet echter zeer voorzichtig zijn tijdens het aspirateren of toevoegen van vloeistoffen rond de hydrogeldruppel om te voorkomen dat het monster wordt beschadigd. De onderzoeker kan hetzelfde monster in een enkel apparaat bekijken met behulp van een hightech microscoop en een correlatieve studie uitvoeren.

culturing-freezing-processing-imaging-entire-organoids-spheroids

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit protocol werd gegenereerd als een middel om hersenorganoïden te produceren in een vereenvoudigde, goedkope manier zonder exogene groeifactoren of kelder membraan matrix met behoud van de diversiteit van de hersenen cel types en vele kenmerken van cellulaire organisatie.

Een statische zelfsturende methode voor het genereren van hersenorganoïden uit menselijke embryonale stamcellen

De gehele 3D-structuur en cellulaire inhoud van organoïden, evenals hun fenotypische gelijkenis met het oorspronkelijke weefsel kan worden vastgelegd met behulp van de single-cell resolutie 3D imaging protocol hier beschreven. Dit protocol kan worden toegepast op een breed scala van organoïden variërend in oorsprong, grootte en vorm.

Single-Cell Resolutie driedimensionale beeldvorming van intacte organoïden

Hier bieden we gedetailleerde, robuuste en complementaire protocollen voor het uitvoeren van kleuring en subcellulaire resolutie beeldvorming van vaste driedimensionale celkweekmodellen variërend van 100 μm tot enkele millimeters, waardoor de visualisatie van hun morfologie, celtypesamenstelling en interacties mogelijk wordt.

Kleuring en beeldvorming met hoge resolutie van driedimensionale organoïde en sferoïde modellen

Hier worden gedetailleerde methoden beschreven voor het genereren, onderhouden en karakteriseren van menselijke pluripotente stamcel-afgeleide dunne darm- en colonorganoïden. Deze methoden zijn ontworpen om de reproduceerbaarheid te verbeteren, de schaalbaarheid uit te breiden en de werktijd te verkorten die nodig is voor het plateren en passeren van organoïden.

Generatie, onderhoud en karakterisering van menselijke pluripotente stamcel-afgeleide darm- en colonorganoïden

Een gedetailleerd protocol wordt hier gepresenteerd om een in vitro organoïde model van menselijke neusepitheelcellen te beschrijven. Het protocol heeft opties voor metingen die standaard laboratoriumapparatuur vereisen, met extra mogelijkheden voor gespecialiseerde apparatuur en software.

Cultuur en beeldvorming van menselijke nasale epitheliale organoïden

Hier beschrijven we een methode om glioblastoom (GBM) organoïden te genereren uit primaire patiëntspecimens of van patiënten afgeleide celculturen en deze tot volwassenheid te houden. Deze GBM-organoïden bevatten fenotypisch diverse celpopulaties en recreëren tumormicro-omgevingen ex vivo.

Behoud van humane glioblastoom cellulaire diversiteit ex vivo met behulp van driedimensionale organoïde cultuur

Dit artikel presenteert een fabricageprotocol voor een nieuw type kweeksubstraat met honderden microcontainers per mm2, waarin organoïden kunnen worden gekweekt en waargenomen met behulp van microscopie met hoge resolutie. De protocollen voor het zaaien en immunostainen van cellen zijn ook gedetailleerd.

Een high-throughput platform voor cultuur en 3D-beeldvorming van organoïden

Hier presenteren we een protocol dat snelle, robuuste en goedkope fabricage van tumorsferoïden mogelijk maakt, gevolgd door hydrogel-inkapseling. Het is breed toepasbaar omdat er geen gespecialiseerde apparatuur voor nodig is. Het zou met name nuttig zijn voor het onderzoeken van sferoïde-matrixinteracties en het bouwen van in vitro weefselfysiologische of pathologiemodellen.

Fabricage en inkapseling van tumorsferoïden in polyethyleenglycolhydrogels voor het bestuderen van sferoïde-matrixinteracties

Deze studie presenteert een kosteneffectieve en efficiënte methodologie voor het genereren van 3D-celstructuren met behulp van een op stempels gebaseerd systeem om microwells in agaroseschimmels te maken. Het systeem bevordert de vorming van uniforme sferoïden/organoïden, waardoor de celinteracties worden verbeterd. Deze aanpak vermindert de experimentele variabiliteit en ondersteunt toepassingen in het testen van geneesmiddelen en weefselmanipulatie.

Generatie van driedimensionale sferoïden/organoïden uit tweedimensionale celculturen met behulp van een nieuw stempelapparaat

We presenteren een stapsgewijs protocol voor hoge-resolutie, labelvrije en driedimensionale beeldvorming van organoïden met behulp van low-coherence holotomografie. Dit protocol beschrijft de voorbereiding van de organoïdecultuur, de beeldvorming en de computationele beeldanalyse, waardoor real-time visualisatie van structurele dynamiek en geneesmiddelresponsen in levende organoïden mogelijk is.

Labelvrije 3D-beeldvorming met hoge resolutie en machine learning-analyse van darmorganoïden via holotomografie met lage coherentie

Leer een protocol voor het kweken, invriezen en beeldvormen van organoïden en sferoïden in hydrogel met behulp van een multifunctioneel apparaat. Deze methode behoudt de 3D-structuur en verbetert de reproduceerbaarheid in celbiologisch onderzoek.

Kweken, invriezen, verwerken en afbeelden van volledige organoïden en sferoïden terwijl ze nog in een hydrogel zitten

Meer video's verkennen