Kweken, invriezen, verwerken en afbeelden van volledige organoïden en sferoïden terwijl ze nog in een hydrogel zitten

Organoïden en sferoïden, die zeer kwetsbaar zijn, raken ernstig beschadigd tijdens het hanteren. Ons protocol zorgt ervoor dat deze 3D-teeltstructuren intact blijven tijdens verschillende processen, waardoor de nauwkeurigheid, reproduceerbaarheid, betrouwbaarheid en herhaalbaarheid toenemen. De onderzoeker kan hele organoïden en sferoïden kweken, bevriezen, ontdooien, verwerken, beitsen, labelen en onderzoeken onder verschillende microscopen terwijl ze intact blijven in een hydrogel in een enkel multifunctioneel apparaat.

Het maakt het mogelijk om een ziektemodel te maken en sequentiële stappen in één multifunctioneel apparaat te volgen. De technologie brengt meer nauwkeurigheid bij het onderzoeken van biomarkers voor diagnose en prognose van ziekten. Deze methode kan worden toegepast op elk 3D-groeisysteem, inclusief organoïden, sferoïden, individuele cellen of levende organismen.

Om de organoïde of sferoïde cultuur te beginnen, plaatst u de goed ontdooide hydrogel gedurende 15 minuten op ijs in een laminaire stromingskap. Houd ook de buis met een pellet van het hepatocellulair carcinoom, of HEPG2-cellen, op ijs. Vervolgens plaat 30 tot 35 microliter 100% hydrogel binnen de nis van het voorverwarmde multifunctionele apparaat om een geldruppel te maken, plaats 10.000 HEPG2-cellen in het midden van de bovenkant van de hydrogeldruppel en incubeer de opstelling bij 37 graden Celsius gedurende 15 minuten.

Bedek na incubatie de hydrogeldruppel met 200 microliter Dulbecco's Modified Eagle Medium, of DMEM, met 10% foetaal runderserum of FBS. Plaats het deksel op de juiste manier op het apparaat, zodat het gas kan stromen, voordat u het in de incubator plaatst. Voed de cellen om de dag met 200 microliter DMEM met 10% FBS.

Controleer de groei van de sferoïden onder een omgekeerde microscoop. Voordat u begint met immunofluorescentie-etikettering van de organoïden, warmt u de benodigde media en oplossingen op tot 37 graden Celsius. Adem het celkweekmedium rond de hydrogeldruppel aan voordat u 200 microliter 4% paraformaldehyde toevoegt, voorverwarmd tot 37 graden Celsius en fixeer het door het gedurende 15 tot 30 minuten in een incubator op 37 graden Celsius te plaatsen.

Aspirateer vervolgens het fixatiemiddel en was de oplossing voor immunofluorescentielabeling, of SIF, drie keer voorverwarmd tot 37 graden Celsius gedurende 10 minuten elk. Voeg gedestilleerd water toe aan het gebied rond de nis om vochtigheid te bieden voordat u doorgaat met de volgende stappen. Aspirateer de SIF rond de hydrogeldruppel en voeg 100 microliter van de voorverwarmde primaire antilichaamoplossing in SIF toe aan de hydrogel voordat u deze gedurende 30 tot 60 minuten bij 37 graden Celsius incubeert.

Aspirateer vervolgens de primaire antilichaamoplossing en was met SIF voorverwarmd tot 37 graden Celsius drie keer gedurende 10 minuten elk. Na de wasbeurt zuigt u de resterende SIF aan en voegt u 100 microliter van de voorverwarmde secundaire antilichaamoplossing in SIF toe aan de hydrogel. Incubeer de hydrogel bij 37 graden Celsius in het donker gedurende 30 tot 60 minuten.

Na de incubatie aspirateer de secundaire antilichaamoplossing en was de hydrogeldruppel met PBS op 37 graden Celsius drie keer in het donker gedurende 10 minuten elk. Zuig vervolgens de resterende PBS op en incubeer de hydrogel met 100 microliter nucleaire DNA-vlek met montagemedium of glycerol bij 37 graden Celsius in het donker. Vul de nis met glycerol om drogen te voorkomen voordat u het multifunctionele apparaat met de hydrogel goed sluit.

Om de organoïden te onderzoeken door middel van confocale microscopie, stelt u de microscoopparameters in volgens de instructies in het manuscript. Om de organoïden te bevriezen, aspirateert u de celkweekmedia, voegt u 200 microliter van de voorverwarmde vriesoplossing toe en incubeert u het monster gedurende een uur bij 37 graden Celsius. Sluit het deksel van het apparaat goed voordat u het in een schuimdoos plaatst.

Plaats deze schuimdoos in een andere schuimdoos en sluit beide schuimdozen goed af. Bewaar de doos twee uur op min 20 graden Celsius en laat hem dan een nacht in een vriezer van min 80 graden Celsius staan. Om de organoïden langer dan zes maanden te bewaren, verwijdert u het multifunctionele apparaat met de organoïden uit de dozen en brengt u het over naar de tank met vloeibare stikstof.

Om de organoïden te ontdooien, haalt u het multifunctionele apparaat met het monster uit de vriezer of de tank met vloeibare stikstof en plaatst u het rechtstreeks in een incubator bij 37 graden Celsius. Eenmaal ontdooid, zuigt u voorzichtig het medium- en vriesoplossingmengsel op voordat u vers medium toevoegt en verder gaat met het in beeld brengen van de organoïde hydrogel met hele montage. In live beeldvorming werden de groeiende organoïden in de hydrogel drie tot vijf dagen na het inbrengen van de celpellet zichtbaar, vooral aan de rand van de hydrogelkoepel.

De tijdreeks van beelden op verschillende niveaus van een hydrogel met sferoïden onder een omgekeerde fasecontrastmicroscoop wordt hier weergegeven. Confocale microscopiebeelden van de levende organoïden met hele mount na live-kleuring van het celmembraan en de kern vertoonden een vergelijkbare labelingsdichtheid in de periferie en het centrum. Verder kan de immunofluorescentie-etikettering van de steroïden met hele mount met succes worden uitgevoerd met één antilichaam, twee antilichamen en drie antilichamen, waardoor er geen extra behandelingsstappen nodig zijn.

De representatieve analyse toont twee immunofluorescent-gelabelde luchtwegorganoïden in een apparaat. SEM-afbeeldingen van de volledige sferoïden in het multifunctionele apparaat en 10 afbeeldingen van gesegmenteerde steroïden duidden op een goed bewaard gebleven 3D-architectuur van sferoïden, cytoplasmatische organellen en andere ultrastructurele cellulaire kenmerken, wat de effectiviteit van het beschreven protocol aantoont. Onregelmatigheid aan de grenzen van de hydrogelkoepel was duidelijk na het invriezen van de monsters.

De grootte en rondheid van de sferoïden bleven echter vergelijkbaar. Celmigratie op het kweekoppervlak werd waargenomen na het ontdooien van de bevroren monsters. De techniek is heel eenvoudig.

De onderzoeker moet echter zeer voorzichtig zijn tijdens het aspirateren of toevoegen van vloeistoffen rond de hydrogeldruppel om te voorkomen dat het monster wordt beschadigd. De onderzoeker kan hetzelfde monster in een enkel apparaat bekijken met behulp van een hightech microscoop en een correlatieve studie uitvoeren.