Name: In Silico Identificatie en karakterisering van circRNAs tijdens gastheer-pathogeen interacties (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Ontdek een in silico-pijplijn voor circRNA-voorspelling en functionele karakterisering uit RNA-sequencingdata tijdens gastheer-pathogeeninteracties. Deze methode helpt onderzoekers regulatoire netwerken en klinische kandidaten identificeren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteur wil Tan Ke En en Dr. Cameron Bracken bedanken voor hun kritische beoordeling van dit manuscript. Dit werk werd ondersteund door subsidies van Fundamental Research Grant Scheme (FRGS/1/2020/SKK0/UM/02/15) en University of Malaya High Impact Research Grant (UM. C/625/1/HIR/MOE/CHAN/02/07).

In dit protocol werden gedeïdentificeerde ribosomale RNA (rRNA)-uitgeputte RNA-seq bibliotheek datasets bereid uit de influenza A virus-geïnfecteerde menselijke macrofaagcellen gedownload en gebruikt uit de Gene Expression Omnibus (GEO) database. De volledige bioinformatica-pijplijn van voorspelling tot functionele karakterisering van circRNA's is samengevat in figuur 1. Elk deel van de pijplijn wordt verder uitgelegd in de onderstaande secties.
1. Voorbereiding, download en setup vóór gegevensanalyse
OPMERKING: Alle softwarepakketten die in dit onderzoek worden gebruikt, zijn gratis en open-source.
<ol><li>De vereiste tools downloaden op het Linux-platform<ol><li>Download en installeer de vereiste software en hulpprogramma's die worden vermeld in de materiaaltabel op een krachtige Linux-computer aan de hand van de instructies van de ontwikkelaar. OPMERKING: De meeste tools en software hebben hun eigen online GitHub-pagina's of documentatie met instructies voor het installeren en gebruiken van hun tools (raadpleeg de Materiaaltabel).</li>
		<li>Download de gewenste RNA-seq datasets voor circRNA detectie en analyse van sequence archive websites (bijv. European Nucleotides Archive en Gene Expression Omnibus).</li>
		<li>Download de referentiegenoom(s) (FASTA-indeling) en annotatiebestanden (GTF/GFF3-indeling), compatibel met de host waaruit de RNA-seq-dataset is samengesteld. Hostreferentiegenoom (en) en annotatiebestanden zijn meestal te vinden op online genoombrowsers zoals het National Center for Biotechnology Information (NCBI), de University of California Santa Cruz (UCSC) en de Ensembl-websites.</li>
	</ol></li>
	<li>Kwaliteitscontrole van RNA-seq<ol><li>Voer de FASTQ-bestanden in het FASTQC-programma in om de kwaliteit van RNA-sequenties te bepalen. Als de kwaliteit van de FASTQ-bestanden laag is (bijv. <Q20) of als er adaptersequenties aanwezig zijn, kan verder bijsnijden nodig zijn met behulp van tools zoals Trimmomatic29,30.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Voorspelling en differentiële expressieanalyse van circRNA's met behulp van CIRIquant
OPMERKING: Een meer gedetailleerde handleiding voor het installeren en uitvoeren van differentiële expressieanalyse is te vinden in de sectie codebeschikbaarheid van het CIRIquant-artikel31. De aanvullende gegevens omvatten ook enkele van de basiscommando's die in dit protocol worden gebruikt.
<ol><li>CircRNA voorspellingen<ol><li>Indexeer eerst het referentiegenoom van de gastheer met behulp van BWA- en HISAT2-aligners. Voer vervolgens op een Linux-terminal de opdrachten bwa index 32 en hisat2-build33 uit in de map van het referentiegenoom van de host om het te indexeren.</li>
		<li>Bereid vervolgens een YML-configuratiebestand voor met de naam van het bestand, het pad van tools (BWA, HISAT2, stringtie34, samtools35), het pad naar de gedownloade referentiebestanden (FASTA-bestanden van het referentiegenoom van de host, annotatiebestanden) en het pad naar de indexbestanden uit stap 2.1.1.</li>
		<li>Voer de CIRIquant-tool uit vanaf de terminal met behulp van de standaard- of handmatige parameters. De gebruiker kan het bibliotheektype (gestrand of niet-gestrand) van de RNA-seq-gegevens opgeven bij het uitvoeren van de CIRIquant-tool. OPMERKING: Het bibliotheektype van de RNA-seq-gegevens kan worden bepaald door het type bibliotheekvoorbereidingskit te kennen dat wordt gebruikt. Als de identiteit van de bibliotheekvoorbereidingskit onbekend is, kan een RNA-seq-controlebio-informaticapakket genaamd RSeQC36 worden gebruikt om de gestrandheid van RNA-seq-gegevens te bepalen.</li>
	</ol></li>
	<li>Differentiële expressieanalyse OPMERKING: CIRIquant-pakket bevat prep_CIRIquant, prepDE.py en CIRI_DE_replicate; Daarom zijn er geen extra downloads nodig voor deze drie tools.<ol><li>Bereid een tekstbestand (.lst) voor met een lijst met gegevens die het volgende bevatten: 1ekolom : ID's van de RNA-seq-gegevens die in stap 2.1.3 zijn gebruikt 2e kolom: pad naar de GTF-bestanden die door CIRIquant zijn uitgevoerd 3e kolom: groepering van de RNA-seq data, of het nu een controle of behandelde groep is.</li>
		<li>Zie tabel 1 hieronder voor een voorbeeld. OPMERKING: Het is niet nodig om de kopteksten in te voeren, omdat ze alleen ter referentie zijn.</li>
		<li>Voer op de Linux-terminal prep_CIRIquant uit met het tekstbestand (.lst) dat is voorbereid in stap 2.2.1 als invoer. De run genereert een lijst met bestanden: library_info.csv, circRNA_info.csv, circRNA_bsj.csv en circRNA_ratio.csv.</li>
		<li>Bereid een tweede tekstbestand voor met een lijst met gegevens die de RNA-seq-ID's en het pad naar hun respectieve StringTie-uitvoer bevatten. De bestandslay-out moet vergelijkbaar zijn met het tekstbestand in stap 2.2.1 zonder de kolom groeperen.</li>
		<li>Voer prepDE.py uit met het tekstbestand dat is voorbereid in stap 2.2.4 als invoer om de matrixbestanden voor het aantal genen te genereren.</li>
		<li>Voer CIRI_DE_replicate uit met de library_info.csv - en circRNA_bsj.csv-bestanden uit stap 2.2.3 en het gene_count_matrix.csv-bestand uit stap 2.2.5 als invoer om het uiteindelijke circRNA_de.tsv-bestand uit te voeren.</li>
	</ol></li>
	<li>Filteren van DE-circRNA's<ol><li>Gebruik R (in de computerterminal of RStudio) of een spreadsheetsoftware (bijvoorbeeld Microsoft Excel) om het circRNA_de.tsv-bestand te openen dat is gegenereerd uit stap 2.2.6 om het aantal differentieel uitgedrukte (DE) circRNA's te filteren en te bepalen.</li>
		<li>Filter de DE-circRNA's volgens de criteria LogFC > |2| en FDR < 0,05.</li>
		<li>Maak een bestand met de naam DE_circRNAs.txt om de informatie van DE-circRNA's op te slaan.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Karakterisering en annotatie van voorspelde DE-circRNA's
<ol><li>Annotatiestatus van DE-circRNA's<ol><li>Laad het bestand met de naam DE_circRNAs.txt in RStudio , dat bestaat uit de lijst met DE-circRNA's die zijn gefilterd uit stap 2.3.3. Neem andere informatie op, zoals de genomische posities (Chr, Start, End), strengoriëntaties (+ of -), gennaam en circRNA-type. Voordat u verder gaat, converteert u de circRNA genomische startcoördinaten van CIRIquant naar 0-gebaseerd door 1 basenpaar af te trekken. OPMERKING: De andere hierboven vermelde informatie kan worden verkregen uit de GTF-bestanden die zijn uitgevoerd door CIRIquant (Aanvullend Bestand 1).</li>
		<li>Bepaal de annotatiestatus van de voorspelde DE-circRNA's door een bibliotheek te downloaden met de genomische posities van de circRNA-database (bijv. circBase) gedeponeerde circRNA's. OPMERKING: Zorg ervoor dat de genoomversie die wordt gebruikt om de circRNA's te voorspellen identiek is aan de circRNA-databasebibliotheek voordat u de vergelijking maakt. Het circBase-gegevensbestand dat hier wordt gebruikt, is vrij beschikbaar in de schijfmap in Github (https://github.com/bicciatolab/Circr)37.</li>
		<li>Zodra beide bestanden uit stap 3.1.1 en stap 3.1.2 zijn voorbereid, voert u het R-script uit dat wordt gegeven in Aanvullend bestand 1. Chromosomale locaties van DE-circRNA's worden opgevraagd bij de bibliotheek voordat de status Geannoteerd of Niet-geannoteerd wordt toegewezen.</li>
	</ol></li>
	<li>Karakterisering van DE-circRNA's<ol><li>Gebruik R en andere spreadsheetsoftware om het aantal circRNA's samen te vatten volgens de circRNA-typen (d.w.z. exon, intron, intergeen en antisense) en het aantal genen dat de circRNA's overspannen (1 of >1) (aanvullend bestand 1).OPMERKING: CIRIquant kan slechts vier soorten circRNA's detecteren (exon, intron, intergeen en antisense). Exon-intron circRNA's, ook bekend als ElciRNA's, kunnen niet worden gedetecteerd door CIRIquant.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Het voorspellen van de circRNA-miRNA interactie met behulp van Circr
OPMERKING: Een meer gedetailleerde handleiding over het installeren en gebruiken van Circr voor de circRNA-miRNA-interactieanalyse is te vinden op: https://github.com/bicciatolab/Circr37.
<ol><li>Voorbereiding van dossiers<ol><li>Pak de inhoud van het Circr.zip-bestand uit en pak het uit nadat u het hebt gedownload van de Circr GitHub-pagina met behulp van de relevante software zoals "WinRar" of "7-zip" in een nieuwe map waar de analyse zal worden uitgevoerd.</li>
		<li>Installeer de vereiste softwaretoepassingen (miRanda, RNAhybrid, Pybedtools en samtools) voordat u de circRNA-miRNA-analyse uitvoert.</li>
		<li>Referentiegenomen en annotatiebestanden voor verschillende organismen van belang, rRNA-coördinatenbestand, gevalideerd miRNA-interactiebestand en circRNA-bestanden circRNA-bestanden worden geleverd door de Circr-auteur op de Github-pagina (https://github.com/bicciatolab/Circr)37. Nadat u op de ondersteuningsbestanden in de stationsmap hebt geklikt, selecteert u de map voor het gewenste organisme, de miRNA-map en het circBase-tekstbestand en downloadt u deze.</li>
		<li>Na het downloaden van de benodigde bestanden in stap 4.1.3, maakt u een nieuwe map met de naam support_files in de map die wordt vermeld in stap 4.1.1. Pak vervolgens de inhoud uit en pak deze uit in de map support_files .</li>
		<li>Indexeer het referentiegenoombestand van het organisme van belang met behulp van het samtools faidx-commando (aanvullend bestand 1).</li>
		<li>Bereid een invoerbestand voor dat bestaat uit de coördinaten van DE-circRNA's van belang in een door tabs gescheiden BED-bestand, zoals weergegeven in tabel 2. OPMERKING: Omdat circRNA's voorspeld door CIRIquant niet op 0 zijn gebaseerd, is het noodzakelijk om min 1 bp te zijn op de begincoördinaat (zoals vermeld in stap 3.1.1) voordat ze worden geconverteerd naar het BED-formaat. De headers in tabel 2 zijn slechts ter referentie en zijn niet nodig in de BED-bestanden.</li>
		<li>Zorg er op dit punt voor dat de verwachte mapstructuur voor Circr-analyse is zoals in figuur 2.</li>
	</ol></li>
	<li>Hardlopen Circr.py<ol><li>Voer Circr.py uit met Python 3 en geef als argumenten het circRNA-invoerbestand, het FASTA-genoom van het gewenste organisme, de genoomversie van het geselecteerde organisme, het aantal threads en de naam van het uitvoerbestand op de opdrachtregel op.</li>
		<li>Als het organisme van belang niet is opgenomen in de stationsmap die wordt vermeld in stap 4.1.3 of als de gebruiker liever een aangepaste set bestanden heeft om de analyse uit te voeren, moeten aanvullende opdrachten die de locatie van deze bestanden specificeren, worden opgenomen bij het uitvoeren van Circr.py.</li>
		<li>Nadat de Circr-analyse is voltooid, voert het programma een circRNA-miRNA-interactiebestand uit in het csv-formaat.</li>
		<li>Filter de circRNA-miRNA interactieresultaten op basis van de gebruikersspecifieke voorkeur. Voor deze studie worden de voorspellingen gefilterd met behulp van Rstudio volgens de onderstaande criteria: -Gedetecteerd door alle drie de softwaretools -Twee of meer bindingssites gerapporteerd door zowel Targetscan als miRanda -Geïdentificeerd in de kolommen "AGO" of "gevalideerd" -Filter geen interacties tussen zaadregio's uit</li>
		<li>Schrijf de circRNA's die de gefilterde voorwaarden uit stap 4.2.3 doorgeven naar een nieuw tekstbestand met de naam circRNA_miRNA.txt. Een dergelijke filtering kan het vertrouwen van de voorspelde interacties vergroten.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Aanleg van het ceRNA-netwerk
OPMERKING: Een gedetailleerde handleiding voor het gebruik van Cytoscape is te vinden op: http://manual.cytoscape.org/en/stable/ en https://github.com/cytoscape/cytoscape-tutorials/wiki#introduction
<ol><li>Download en voorbereiding<ol><li>Download de nieuwste versie van Cytoscape38 van: https://cytoscape.org/download.html.</li>
		<li>Voer de installatiewizard uit die is gedownload in stap 5.1.1 en selecteer de bestandslocatie voor de Cytoscape-software.</li>
		<li>Bereid een door tabs gescheiden bestand voor met de circRNA's van belang en hun doel-miRNA. De eerste kolom bestaat uit de circRNA-naam; de tweede kolom specificeert het type RNA uit de eerste kolom; de derde kolom is het doel-miRNA; en de vierde kolom specificeert het type RNA uit de derde kolom. Een voorbeeld van het bestand is weergegeven in tabel 3.</li>
	</ol></li>
	<li>Het construeren van de ceRNA-netwerkkaart<ol><li>Open de Cytoscape-software die is geïnstalleerd in stap 5.1.2.</li>
		<li>Navigeer in Cytoscape naar Bestand > Importeer > netwerk uit Bestand. Selecteer het bestand dat is voorbereid in stap 5.1.3.</li>
		<li>Selecteer in het nieuwe tabblad de eerste en tweede kolom als "Bronknooppunt" en "Bronknooppuntkenmerk" terwijl u de derde en vierde kolom selecteert als respectievelijk "Doelknooppunt" en "Doelknooppuntkenmerk". Klik op OK en het netwerk verschijnt rechtsboven in Cytoscape.</li>
		<li>Om de visuele stijl van het netwerk te wijzigen, drukt u op de knop Stijl aan de linkerkant van Cytoscape.</li>
		<li>Druk op de pijl aan de rechterkant van Vulkleur. Kies Type voor de kolom en Discrete toewijzing voor het toewijzingstype. Selecteer vervolgens de gewenste kleur voor elk van de RNA-typen.</li>
		<li>Nadat u de kleur hebt gewijzigd, wijzigt u de vorm van de knooppunten door naar Vorm te gaan en stap 5.2.5 te volgen.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Functionele verrijkingsanalyse
<ol><li>Gene Ontology (GO) en Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) analyse voor het oudergen van de circRNA's<ol><li>Zorg ervoor dat de clusterProfiler 39,40 en org. Hs.eg.db41 pakketten zijn geïnstalleerd in Rstudio. De organisatie. Hs.eg.db41-pakket is een genoombreed annotatiepakket alleen voor mensen. Als het organisme van belang een andere soort is, raadpleegt u: https://bioconductor.org/packages/release/BiocViews.html#OrgDb</li>
		<li>Importeer de DE_circRNA informatie uit stap 2.3.1 in de Rstudio-werkruimte.</li>
		<li>Gebruik het oudergen van de circRNA's in dit bestand voor verrijkingsanalyse in de komende stappen. Als de gebruiker het gensymbool echter wil converteren naar andere formaten, zoals de Entrez-ID, gebruik dan een functie zoals "bitr".</li>
		<li>Door de gen-ID als invoer te gebruiken, voert u de GO-verrijkingsanalyse uit met behulp van de enrichGO-functie in het clusterProfiler 39,40-pakket met behulp van standaardparameters.</li>
		<li>Door de gen-ID als invoer te gebruiken, voert u de KEGG-verrijkingsanalyse uit met behulp van de enrichKEGG-functie binnen het clusterProfiler 39,40-pakket met behulp van de standaardparameters.</li>
	</ol></li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Om het nut van dit protocol te illustreren, werd RNA-seq van influenza A-virus-geïnfecteerde menselijke macrofaagcellen als voorbeeld gebruikt. CircRNA's die functioneren als potentiële miRNA-sponzen in gastheer-pathogeen interacties en hun GO- en KEGG-functionele verrijking binnen een gastheer werden onderzocht. Hoewel er verschillende circRNA-tools online beschikbaar zijn, is elk van hen een op zichzelf staand pakket dat niet met elkaar communiceert. Hier hebben we enkele van de tools samengesteld die nodig zijn voor c...

Gastheer-pathogeen interacties vertegenwoordigen een complex samenspel tussen de pathogenen en gastheerorganismen, dat de aangeboren immuunresponsen van de gastheren veroorzaakt die uiteindelijk resulteren in de verwijdering van binnendringende pathogenen 1,2. Tijdens pathogene infecties wordt een groot aantal immuungenen van de gastheer gereguleerd om de replicatie en afgifte van pathogenen te remmen. Gemeenschappelijke interferon-gestimuleerde genen (ISG's) gereguleerd op pathogene infecties omvatten bijvoorbeeld ADAR1, IFIT1, IFIT2, IFIT3, ISG20, RIG-I en OASL 3,4. Naast eiwitcoderende genen hebben studies ook gemeld dat niet-coderende RNA's zoals lange niet-coderende RNA's (lncRNA's), microRNA's (miRNA's) en circulaire RNA's (circRNA's) ook een rol spelen en gelijktijdig worden gereguleerd tijdens pathogene infecties 5,6,7. In tegenstelling tot eiwitcoderende genen die voornamelijk coderen voor eiwitten als functionele moleculen, is het bekend dat niet-coderende RNA's (ncRNA's) functioneren als regulatoren van genen op transcriptionele en post-transcriptionele niveaus. Studies met de deelname van niet-coderende RNA's, met name circRNA's, bij het reguleren van de immuungenen van de gastheren zijn echter niet goed gerapporteerd in vergelijking met de eiwitcoderende genen.
CircRNA's worden op grote schaal gekenmerkt door hun covalent gesloten continue lusstructuur, die wordt gegenereerd door een niet-canoniek splicingproces dat back-splicing8 wordt genoemd. Het proces van back-splicing, in tegenstelling tot het splicingproces van verwante lineaire RNA's, omvat de ligatie van de downstream donorplaats naar de upstream acceptorplaats, waardoor een cirkelvormige structuur wordt gevormd. Momenteel zijn drie verschillende back-splicing mechanismen voor de biogenese van circRNA's voorgesteld. Dit zijn RNA binding protein (RBP) gemedieerde circularisatie9,10, intron-pairing-gedreven circularisatie 11 en lariat-gedreven circularisatie12,13,14. Aangezien circRNA's end-to-end verbonden zijn in een cirkelvormige structuur, hebben ze de neiging om van nature resistent te zijn tegen normale exonuclease-verteringen en worden ze daarom als stabieler beschouwd dan hun lineaire tegenhangers15. Een ander gemeenschappelijk kenmerk van circRNA's omvat de cel- of weefseltypespecifieke expressie in gastheren16.
Zoals geïmpliceerd door hun unieke structuur en cel- of weefselspecifieke expressie, is ontdekt dat circRNA's belangrijke biologische functies in cellen spelen. Tot op heden is een van de prominente functies van circRNA's hun rol als microRNA (miRNA) sponzen17,18. Deze regulerende rol van circRNA's vindt plaats door de complementaire binding van circRNA-nucleotiden met het zaadgebied van miRNA's. Een dergelijke circRNA-miRNA-interactie remt de normale regulerende functies van de miRNA's op doel-mRNA's, waardoor de expressie van genenwordt gereguleerd 19,20. Bovendien is ook bekend dat circRNA's genexpressie reguleren door interactie met RNA-bindende eiwitten (RBP's) en het vormen van RNA-eiwitcomplexen21. Hoewel circRNA's worden geclassificeerd als niet-coderende RNA's, zijn er ook aanwijzingen dat circRNA's kunnen fungeren als sjablonen voor eiwittranslatie22,23,24.
Onlangs is aangetoond dat circRNA's een cruciale rol spelen bij het reguleren van de gastheer-pathogeen interacties, met name tussen de gastheren en virussen. Over het algemeen wordt aangenomen dat gastheercircRNA's helpen bij het reguleren van de immuunresponsen van de gastheer om de binnendringende pathogenen te elimineren. Een voorbeeld van circRNA dat immuunresponsen van de gastheer bevordert, is circRNA_0082633, gerapporteerd door Guo et al.25. Dit circRNA verbetert type I interferon (IFN) signalering in A549-cellen, wat helpt om influenzavirusreplicatiete onderdrukken 25. Bovendien rapporteerden Qu et al. ook een humaan intronisch circRNA, circRNA AIVR genaamd, dat de immuniteit bevordert door de expressie van CREB-bindend eiwit (CREBBP), een signaaltransducer van IFN-β26,27, te reguleren. Er bestaan echter ook circRNA's waarvan bekend is dat ze de pathogenese van ziekte bij infectie bevorderen. Yu et al. rapporteerden bijvoorbeeld onlangs de rol die een circRNA uit het GATA-zinkvingerdomein met het 2A-gen (circGATAD2A) speelt bij het bevorderen van de replicatie van het H1N1-virus door de remming van autofagie van de gastheercel28.
Om circRNA's effectief te bestuderen, wordt meestal een genoombreed circRNA-voorspellingsalgoritme geïmplementeerd, gevolgd door een in silico-karakterisering van de voorspelde circRNA-kandidaten voordat functionele studies kunnen worden uitgevoerd. Een dergelijke bioinformatica-benadering om circRNA's te voorspellen en te karakteriseren is minder kostbaar en tijdsefficiënter. Het helpt om het aantal kandidaten dat functioneel moet worden bestudeerd te verfijnen en kan mogelijk leiden tot nieuwe bevindingen. Hier bieden we een gedetailleerd op bioinformatica gebaseerd protocol voor de in silico-identificatie , karakterisering en functionele annotatie van circRNA's tijdens de gastheer-pathogeen interacties. Het protocol omvat de identificatie en kwantificering van circRNA's uit RNA-sequencing datasets, annotatie via circBase en de karakterisering van de circRNA-kandidaten in termen van circRNA-typen, aantal overlappende genen en voorspelde circRNA-miRNA-interacties. Deze studie biedt ook de functionele annotatie van de circRNA-oudergenen via Gene Ontology (GO) en de Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) verrijkingsanalyse.

<table><tbody><tr><td>Bedtools</td><td>GitHub</td><td>https://github.com/arq5x/bedtools2/</td><td>Verwijzend naar sectie 4.1.2. Nodig voor Circr.</td></tr><tr><td>BWA</td><td>Burrows-Wheeler Aligner</td><td>http://bio-bwa.sourceforge.net/</td><td>Verwijzend naar sectie 2.1.1 en 2.1.2. Nodig om CIRIquant uit te voeren en om het genoom te indexeren</td></tr><tr><td>Circr</td><td>GitHub</td><td>https://github.com/bicciatolab/Circr</td><td>Verwijzend naar sectie 4. Gebruik om de miRNA-bindingsplaatsen te voorspellen</td></tr><tr><td>CIRIquant</td><td>GitHub</td><td>https://github.com/bioinfo-biols/CIRIquant</td><td>Verwijzend naar sectie 2.1.3. Om circRNA's te voorspellen</td></tr><tr><td>Clusterprofiler</td><td>GitHub</td><td>https://github.com/YuLab-SMU/clusterProfiler</td><td>Verwijzend naar sectie 7. Voor GO en KEGG functionele verrijking</td></tr><tr><td>CPU</td><td>Intel</td><td>&nbsp;Intel(R) Xeon(R) CPU E5-2620 V2 @ 2.10 GHz&nbsp;&nbsp; Kernen: 6-core CPU Geheugen: 65 GB Grafische kaart: NVIDIA GK107GL (QUADRO K2000)&nbsp;</td><td>Specificaties gebruikt om dit hele protocol uit te voeren.</td></tr><tr><td>Cytoscape</td><td>Cytoscape</td><td>https://cytoscape.org/download.html</td><td>Verwijzend naar sectie 5.2. Nodig om ceRNA-netwerk te plotten</td></tr><tr><td>FastQC</td><td>Babraham Bioinformatics</td><td>https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</td><td>Verwijzend naar sectie 1.2.1. Kwaliteitscontrole op Fastq-bestanden</td></tr><tr><td>HISAT2</td><td></td><td>http://daehwankimlab.github.io/hisat2/</td><td>Verwijzend naar sectie 2.1.1 en 2.1.2. Nodig om CIRIquant uit te voeren en om het genoom te indexeren</td></tr><tr><td>Linux</td><td>Ubuntu 20.04.5 LTS (Focal Fossa)</td><td>https://releases.ubuntu.com/focal/</td><td>Nodig om het hele protocol uit te voeren. Andere Ubuntu-versies kunnen nog steeds geldig zijn om het protocol uit te voeren.</td></tr><tr><td>miRanda</td><td></td><td>http://www.microrna.org/microrna/getDownloads.do</td><td>Verwijzend naar sectie 4.1.2. Nodig voor Circr</td></tr><tr><td>Pybedtools</td><td>pybedtools 0.8.2</td><td>https://pypi.org/project/pybedtools/</td><td>Nodig voor genomische manipulatie van BED-bestanden</td></tr><tr><td>Python</td><td>Python 2.7 en 3.6 of hoger</td><td>https://www.python.org/downloads/</td><td>Om noodzakelijke bibliotheekmodules uit te voeren</td></tr><tr><td>R</td><td>The Comprehensive R Archive Network</td><td>https://cran.r-project.org/</td><td>Om dataframes te manipuleren</td></tr><tr><td>RNAhybrid</td><td>BiBiServ</td><td>https://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybrid</td><td>Verwijzend naar sectie 4.1.2. Nodig voor Circr</td></tr><tr><td>RStudio</td><td>RStudio</td><td>https://www.rstudio.com/</td><td>Een werkruimte om R uit te voeren</td></tr><tr><td>samtools&nbsp;</td><td>SAMtools</td><td>http://www.htslib.org/</td><td>Verwijzend naar sectie 2.1.2. Nodig om CIRIquant uit te voeren</td></tr><tr><td>StringTie</td><td>Johns Hopkins University: Center for Computational Biology</td><td>http://ccb.jhu.edu/software/stringtie/index.shtml</td><td>Verwijzend naar sectie 2.1.2. Nodig om CIRIquant uit te voeren</td></tr><tr><td>TargetScan</td><td>GitHub</td><td>https://github.com/nsoranzo/targetscan</td><td>Verwijzend naar sectie 4.1.2. Nodig voor Circr</td></tr></tbody></table>

in silico identificatie en karakterisering van circrna's tijdens gastheer-pathogeen interacties

In Silico Identification and Characterization of circRNAs During Host-Pathogen Interactions

Circulaire RNA's (circRNA's) zijn een klasse van niet-coderende RNA's die worden gevormd via back-splicing. Deze circRNA's worden voornamelijk bestudeerd voor hun rol als regulatoren van verschillende biologische processen. Met name opkomend bewijs toont aan dat gastheer circRNA's differentieel tot expressie kunnen worden gebracht (DE) bij infectie met pathogenen (bijv. Influenza en coronavirussen), wat een rol suggereert voor circRNA's bij het reguleren van aangeboren immuunresponsen van de gastheer. Onderzoek naar de rol van circRNA's tijdens pathogene infecties wordt echter beperkt door de kennis en vaardigheden die nodig zijn om de noodzakelijke bioinformatische analyse uit te voeren om DE-circRNA's te identificeren uit RNA-sequencing (RNA-seq) -gegevens. Bioinformatica voorspelling en identificatie van circRNA's is cruciaal voor elke verificatie, en functionele studies met behulp van kostbare en tijdrovende wet-lab technieken. Om dit probleem op te lossen, wordt in dit manuscript een stapsgewijs protocol van in silico-voorspelling en karakterisering van circRNA's met behulp van RNA-seq-gegevens verstrekt. Het protocol kan worden onderverdeeld in vier stappen: 1) Voorspelling en kwantificering van DE-circRNA's via de CIRIquant-pijplijn; 2) Annotatie via circBase en karakterisering van DE circRNA's; 3) CircRNA-miRNA interactie voorspelling via Circr pijplijn; 4) functionele verrijkingsanalyse van circRNA-oudergenen met behulp van Gene Ontology (GO) en Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). Deze pijplijn zal nuttig zijn bij het stimuleren van toekomstig in vitro en in vivo onderzoek om de rol van circRNA's in gastheer-pathogeen interacties verder te ontrafelen.

Het protocol dat in de vorige sectie is ingeschakeld, is aangepast en geconfigureerd voor het Linux OS-systeem. De belangrijkste reden is dat de meeste modulebibliotheken en pakketten die betrokken zijn bij de analyse van circRNA's alleen op het Linux-platform kunnen werken. In deze analyse werden gedeïdentificeerde ribosomale RNA (rRNA)-uitgeputte RNA-seq bibliotheekdatasets bereid uit de influenza A-virus-geïnfecteerde menselijke macrofaagcellen gedownload uit de GEO-database42 en gebruikt om de...

Het hier ingediende protocol verklaart de volledige in silico-pijplijn die nodig is om circRNA's te voorspellen en functioneel te karakteriseren uit RNA-sequencing transcriptoomgegevens die gastheer-pathogeeninteracties bestuderen.

In Silico Identificatie en karakterisering van circRNA's tijdens gastheer-pathogeen interacties

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs that are formed via back-splicing. These circRNAs are predominantly studied for their roles as ...

Circulaire RNA's spelen een belangrijke regulerende rol in verschillende biologische processen. Dit protocol is geschikt voor beginners om circulaire RNA-analyse uit te voeren op het gebied van gastheer- en pathogeeninteracties. Hier hebben we een paar van de tools samengesteld om een gestroomlijnd protocol te creëren dat nodig is voor veilige RNA-voorspelling en -kwantificering, veilige RNA-functionele verrijking, veilig RNA, micro-RNA-interactievoorspelling en CCE RNA-netwerkconstructies.Dit stroomlijningsprotocol kan worden toegepast op klinische monsters om bepaalde kandidaten, diagnostische en prognostische waarden te identificeren in een gastheer- en pathogeeninteractieomgeving. Ik verwacht dat degenen die geen voorafgaande programmeerkennis hebben, moeite zullen hebben met de beginfase van deze techniek. Daarom zou ik adviseren om de basisprincipes van de programmeertalen die in deze techniek worden gebruikt, te leren.Ik geloof dat meestal kijken naar hoe de programmeertaal wordt toegepast om informatiever en gemakkelijker te begrijpen te zijn in vergelijking met alleen lezen. Om te beginnen open je een Linux-terminal en voer je in de map van het referentiegenoom van de host de commando's bwa index en hisat2-build uit om het genoom te indexeren. Bereid een yml-configuratiebestand voor met de naam van het bestand, het pad van de hulpprogramma's, het pad naar de gedownloade referentiebestanden en het pad naar de indexbestanden.Geef het bibliotheektype van de RNA-sequentiegegevens op en voer het gereedschap Ciriquant uit met behulp van de standaard- of handmatige parameters. Bereid een tekstbestand voor met een lijst met gegevens die de ID's van de RNA-sequentiegegevens bevatten, het pad naar de GTF-bestanden die door Ciriquant zijn uitgevoerd en de groepering van de RNA-sequentiegegevens, ongeacht of het een controlegroep of een behandelde groep is. Voer op de Linux-terminal prep_Ciriquant uit met een voorbereid tekstbestand als invoer.Deze run genereert een lijst met bestanden. Bereid een tweede tekstbestand voor met een lijst met gegevens die de RNA-sequentie-ID's en het pad naar hun respectieve string tie-uitvoer bevatten. De bestandsindeling moet vergelijkbaar zijn met het eerder voorbereide tekstbestand zonder dat de groeperingskolom wordt uitgevoerd.Voer prepde uit. py met dit tekstbestand als invoer om de gentellingmatrixbestanden te genereren. Voer Ciri_DE_Replicate uit met de library_info.CSV, circRNA_BSJ. CSV en gene_count_matrix. CSV-bestanden als invoer om de uiteindelijke circRNA_DE uit te voeren.TSV-bestand. Als u het aantal differentieel uitgedrukte of DE-circRNA's wilt filteren en bepalen, opent u het circRNA_DE. tsv-bestand met R of een andere spreadsheetsoftware.Pak de inhoud van het CircR-bestand uit en pak het uit nadat u het hebt gedownload van de CircR GitHub-pagina met behulp van de relevante software, zoals WinRar of 7-Zip. In een nieuwe directory waar de analyse zal worden uitgevoerd. Installeer vervolgens de vereiste softwaretoepassingen zoals SAMTools, miRanda, RNAhybrid en Pybedtools voordat u de circRNA miRNA-analyse uitvoert.Indexeer het referentiegenoombestand van het organisme van belang met behulp van de SAMtools FAIDX-opdracht en bereid een invoerbestand voor dat bestaat uit de coördinaten van de DE-circRNA's van belang in een door tabs gescheiden bedbestand. Voer vervolgens Circr uit. py met behulp van Python3.En als argumenten specificeren het circRNA-invoerbestand, het snellere genoom van het organisme van belang, de genoomversie van het geselecteerde organisme, het aantal threads en de naam van het uitvoerbestand in de opdrachtregel. Zodra de Circr-analyse is voltooid, voert het programma een circRNA-miRNA-interactiebestand uit in het CSV-formaat. Bereid een door tabs gescheiden bestand voor met de circRNA's van belang en hun doel-miRNA.De eerste kolom bestaat uit de naam circRNA. De tweede kolom geeft het type RNA uit de eerste kolom aan. De derde kolom is het doel-miRNA.En de vierde kolom specificeert het type RNA uit de derde kolom. Om de ceRNA-netwerkkaart te construeren, opent u de Cytoscape-software, navigeert u naar het bestand, importeert u, netwerkt u het bestand, selecteert u het voorbereide bestand en uploadt u het. Druk op de stijlknop om de visuele stijl van het netwerk te wijzigen.Druk vervolgens op de pijl aan de rechterkant van de vulkleur, kies type voor de kolom, discrete toewijzing voor het toewijzingstype en selecteer de gewenste kleur voor elk RNA-type. Navigeer daarna naar vorm om de vorm van de knooppunten te wijzigen en volg de stappen die eerder zijn weergegeven. Voor genontologie en KEGG-analyse van het oudergen van de circRNA's, zorg voor de clusterprofiler en org. Hs.eg.DB-pakketten zijn geïnstalleerd in onze studio. Importeer de DE-circRNA-informatie in de werkruimte van de R-studio. Als de gebruiker de ouderlijke gennamen wil converteren naar andere formaten zoals de entrezid, gebruik dan een functie zoals bidder.Gebruik de gen-ID als invoer en voer de genontologie en verrijkingsanalyse uit met behulp van de enrichGO-functie binnen het clusterprofiel of -pakket met behulp van standaardparameters. Voer ten slotte de KEGG-verrijkingsanalyse uit met behulp van de gen-ID als invoer en de enrichKEGG-functie binnen het clusterprofielpakket. De bubble plot van gen ontologie verrijkingsanalyse van DE circRNA oudergenen is weergegeven in deze figuur.De genverhouding op de x-as is het aantal genen in die invoerlijst dat geassocieerd is met een bepaalde genontologieterm gedeeld door het totale aantal genen in die term. De puntgrootte in de grafiek wordt weergegeven door de telwaarde, het aantal genen in de invoerlijst dat is gekoppeld aan een bepaalde term voor genontologie. Hoe groter de grootte van de stippen, hoe groter het aantal inputgenen dat aan de term is gekoppeld.De stippen in de grafiek zijn kleurgecodeerd op basis van de pvalue die wordt berekend door de waargenomen frequentie van een annotatieterm te vergelijken met de frequentie die bij toeval wordt verwacht. De verrijking is statistisch significant en wordt alleen op de bubbelplot uitgezet als de pwaarde lager is dan 0,01. Hier omvatten de top drie verrijkingen voor de biologische processen de biogenese van het ribonucleoproteïnecomplex, de reactie op het virus en de regulatie van de respons op een biotische stimulus.Terwijl voor de moleculaire functies alleen de katalytische activiteit die inwerkt op RNA en enkelstrengs RNA-binding statistisch verrijkt zijn. Voor de cellulaire componenten is alleen het retromeercomplex statistisch verrijkt. Deze representatieve afbeelding toont de KEGG-verrijkingsanalyse van de DE-circRNA-oudergenen in een bellenplot.Slechts twee KEGG-termen werden in dit geval verrijkt, de influenza A en de virale levenscyclusroutes. Een van de belangrijkste dingen bij het proberen van deze procedure is om ervoor te zorgen dat het juiste type eigenschap van de RNA-circ-dataset die u gebruikt bij het uitvoeren van een blessure. De bio-formatische pijplijn die hier wordt aangeboden, helpt bij het voorspellen van de potentiële seculiere RNA's en de functionele annotaties.Er zal echter nog steeds een goed geleide verificatie nodig zijn om solide bewijs te leveren. Dit protocol stelt onderzoekers in staat om veilig RNA en hun potentiële functionele rollen in de verschillende codes en pathogene interacties te ontdekken, die ze verder kunnen bestuderen.

in-silico-identification-characterization-circrnas-during-host

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Source: Mateer, E., et al., Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the confocal imaging of viral double-stranded RNA (dsRNA) and cytoplasmic pattern recognition receptors (PRRs) in virus-infected epithelial cells. It highlights how antibody-based fluorescent labeling reveals the interaction between viral replication intermediates and host immune sensors.

Visualization of Viral Double-Stranded RNA and Host Pattern Recognition Receptors in Infected Epithelial Cells

Dit artikel richt zich op de identificatie van hoog-vertrouwen interactie datasets tussen gastheer en pathogeen-eiwitten met behulp van een combinatie van twee orthogonale methoden: gist twee-hybride, gevolgd door een high-throughput interactie test bij zoogdiercellen genaamd HT-GPCA.

Een vergelijkende benadering van het Landschap van gastheer-pathogeen eiwit-eiwit interacties karakteriseren

We ontwikkelden een protocol dat snel, gevoelig en reproduceerbaar is voor het profileren van pathogene genexpressie tijdens een infectie.

Genexpressie infecteren Microben Met behulp van een digitale Bar-codering Platform

Hier presenteren we de nematode Caenorhabditis elegans als een veelzijdig hostmodel aan de studie van microbiële interactie.

De Nematode Caenorhabditis Elegans - een veelzijdig In Vivo -Model om te studeren van Host-microbe interacties

Beschreven is een methode om te kwantificeren van de expressie van genen die 96 en 18 oppervlakte eiwitten door afzonderlijke cellen ex vivo, waardoor voor de identificatie van differentially uitgedrukte genen en proteïnen in virus-geïnfecteerde cellen ten opzichte van niet-geïnfecteerde cellen. Passen we de aanpak van de studie SIV-geïnfecteerde CD4+ T cellen geïsoleerd van rhesus makaken.

Eencellige kwantificatie van mRNA en oppervlak eiwituitdrukking in Simian Immunodeficiëntie Virus-geïnfecteerde CD4+ T cellen geïsoleerd van Rhesus Makaken

Het hier gepresenteerde protocol beschrijft een complete pijplijn om RNA-sequencing transcriptoomgegevens te analyseren, van ruwe reads tot functionele analyse, inclusief kwaliteitscontrole en voorbewerkingsstappen tot geavanceerde statistische analytische benaderingen.

Transcriptoomanalyse met hoge doorvoer voor het onderzoeken van gastheer-pathogeeninteracties

Detectie van gastheer-bacteriële pathogene interacties op basis van fenotypische therapietrouw met behulp van high-throughput fluorescentie labeling beeldvorming samen met geautomatiseerde statistische analysemethoden maakt een snelle evaluatie van potentiële bacteriële interacties met gastheercellen mogelijk.

Geautomatiseerde, high-throughput detectie van bacteriële hechting aan gastheercellen

Intestinale microben, waaronder extracellulaire bacteriën en intracellulaire pathogenen zoals het Orsay-virus en microsporidia (schimmels), worden vaak geassocieerd met wilde Caenorhabditis-nematoden . Dit artikel presenteert een protocol voor het detecteren en kwantificeren van microben die C. elegans-nematoden koloniseren en / of infecteren, en voor het meten van de pathogenenbelasting na gecontroleerde infecties in het laboratorium.

RNA-fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) om microbiële kolonisatie en infectie in caenorhabditis elegans darmen te visualiseren

Dit manuscript beschrijft een methode voor het screenen van middelgrote Candida albicans mutante bibliotheken op morfogenese fenotypes tijdens actieve infectie in een zoogdier gastheer met behulp van niet-invasieve confocale microscopie.

Gebruik van in vivo beeldvorming om te screenen op morfogenese fenotypes in Candida albicans mutante stammen tijdens actieve infectie bij een zoogdiergastheer

Enteroïden zijn in opkomst als een nieuw model voor het bestuderen van weefselfysiologie en pathofysiologie, medicijnontwikkeling en regeneratieve geneeskunde. Hier beschrijven we een 2D-enteroïde-afgeleid kweeksysteem van rundercellen dat co-kweek met relevante weefselceltypen mogelijk maakt. Dit model biedt een translationeel voordeel voor modellering van gastro-intestinaal onderzoek.

Generatie van een rundvee primair enteroïde-afgeleid tweedimensionaal monolaagkweeksysteem voor toepassingen in translationeel biomedisch onderzoek

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor het ontwerpen, bouwen en leveren van tetracycline-gecontroleerde geïnduceerbare synthetische schakelingen. Het effect van de synthetische circuits op de eliminatie van parasieten en de expressie van cytokines kan worden bestudeerd door de gepresenteerde pijplijn te kanaliseren. Dit protocol is relevant voor onderzoekers die op synthetische circuits gebaseerde therapieën bestuderen bij infectieziekten.

Immunometabole circuits bij infectie voor het bevorderen van gastheergerichte therapieën

Ontdek een in silico-pijplijn voor circRNA-voorspelling en functionele karakterisering uit RNA-sequencingdata tijdens gastheer-pathogeeninteracties. Deze methode helpt onderzoekers regulatoire netwerken en klinische kandidaten identificeren.

In Silico Identificatie en karakterisering van circRNA's tijdens gastheer-pathogeen interacties

Meer video's verkennen