Name: Isolatie en cultuur van beenmerg-afgeleide macrofagen van muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-23T14:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Leer de isolatie en cultuur van beenmerg-afgeleide macrofagen van muizen voor immunologie en celbiologie. Deze methode levert ongeveer 2 x 10^7 ongestimuleerde cellen per dier op.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door subsidies van Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG), via Rede de Pesquisa em Doenças Infecciosas Humanas e Animais do Estado de Minas Gerais (RED-00313-16) en Rede Mineira de Engenharia de Tecidos e Terapia Celular - REMETTEC (RED-00570-16), en de Braziliaanse Nationale Raad voor Wetenschappelijke en Technologische Ontwikkeling (CNPq).

Dit protocol is uitgevoerd in overeenstemming met de Nationale Raad voor de Controle van Dierproeven (Concea) en met de goedkeuring van de Commissie Ethiek en Gebruik van Dieren (CEUA). C57BL/6 muizen werden gekocht van Biotério Central van de Federale Universiteit van Minas Gerais (UFMG), Belo Horizonte, Brazilië. Persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM's) zoals laboratoriumjassen, handschoenen en oogbescherming moeten worden gebruikt bij alle stappen die in dit protocol worden beschreven.
1. Bereiding van fibroblast L-929 afstammingssupernatant als bron van M-CSF
<ol><li>Ontdooi L-929 fibroblastafstammingscellen (American Type Culture Collection Certified Cell Line-ATCC CCL1) en start het kweekproces onmiddellijk om de levensvatbaarheid te behouden.</li>
	<li>Breng in een bioveiligheidskast met laminaire stroming met behulp van een pipet van 1.000 μl de cellen van de L-929-fibroblastlijn over van de injectieflacon naar een steriele centrifugebuis van 50 ml.</li>
	<li>Gebruik een serologische pipet om 50 ml steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) toe te voegen, vrij van calcium en magnesium.</li>
	<li>Centrifugeer op 300 x g, 4 °C gedurende 10 min. Gooi het supernatant weg.</li>
	<li>Resuspendeer de pellet in 20 ml Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium-F12 aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1 ml penicilline/streptomycine (P/S) (DMEM/F12-10) met behulp van een serologische pipet.</li>
	<li>Breng de geresuspendeerde cellen over in een T75-celkweekkolf.</li>
	<li>Incubeer in een incubator van 37 °C, 5% CO2 tot volledige samenvloeiing. NOTITIE: Zorg er bij het manipuleren van de kolf voor dat het deksel niet nat wordt met oplossing, aangezien dit een bron van besmetting kan zijn. Om een geschikte hoeveelheid supernatant te verkrijgen, is het noodzakelijk om de cellen te repliceren nadat ze het volledige oppervlak van de celkweekkolf hebben bedekt. L-929 cellen worden geremd door contact. Verwarm trypsine/ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA)-oplossing, DMEM/F12-10, en steriel PBS tot 37 °C om de uitbreiding van de celcultuur te starten, zoals beschreven in de volgende stappen.</li>
	<li>Zodra de volledige samenvloeiing is bereikt, gooit u het supernatans uit de celkweekkolf weg in de bioveiligheidskast met laminaire stroming.</li>
	<li>Was de celkweekkolf met 20 ml steriele PBS met behulp van een serologische pipet en gooi de oplossing weg.</li>
	<li>Voeg 10 ml trypsine/EDTA (0,05% oplossing) toe aan de celkweekkolf met de aangehechte cellen.</li>
	<li>Breng de celkweekkolf over van de laminaire stroming naar een incubator van 37°C, 5% CO2 en incubeer gedurende 3 minuten.</li>
	<li>Schud de celkweekkolf om de cellen te scheiden van het oppervlak van de kweekkolf en gebruik een microscoop om er zeker van te zijn dat alle cellen zijn gedissocieerd.</li>
	<li>Inactiveer de trypsine/EDTA (0,05% oplossing) met 10 ml DMEM/F12-10 medium.</li>
	<li>Breng de oplossing met behulp van een serologische pipet over in een steriele centrifugebuis van 50 ml.</li>
	<li>Centrifugeer bij 300 x g bij 4 °C gedurende 10 min. Gooi het supernatant weg.</li>
	<li>Resuspendeer de pellet in 10 ml DMEM/F12-10 medium.</li>
	<li>Voeg 1 ml van de celsuspensie toe aan een T175-celkweekkolf (1:10 cultuur).</li>
	<li>Herhaal de procedure om tien T175-celcultuurkolven te verkrijgen.</li>
	<li>Voeg 50 ml DMEM/F12-10 toe aan elke celkweekkolf.</li>
	<li>Incubeer in een incubator van 37 °C, 5% CO2 tot volledige samenvloeiing. OPMERKING: Deze stappen garanderen 500 ml L-929-celsupernatant. Op dag 5, nadat de cellen het oppervlak van de T175-celkweekkolf hebben bedekt, wordt het supernatans verrijkt voor M-CSF en moet het worden verzameld14.</li>
	<li>Haal de celkweekkolf op dag 5 na contactremming uit de incubator.</li>
	<li>Breng het medium over in een steriele centrifugebuis van 50 ml.</li>
	<li>Centrifugeer bij 3.200 x g, bij 4 °C gedurende 10 min.</li>
	<li>Verzamel het met M-CSF verrijkte supernatans en breng de oplossing over in een steriele centrifugebuis van 50 ml. Bewaren in de vriezer bij -20 °C. OPMERKING: Centrifugeren is uiterst belangrijk om cellen en puin van de supernatanten te verwijderen.</li>
	<li>L-929 supernatans is een handige en goedkope bron van macrofaag koloniestimulerende factor (M-CSF) en bevat doorgaans 5 tot 10 ng/ml M-CSF8. Deze supernatanten bevatten ook sporen van andere cytokinen en groeifactoren, maar ze oefenen geen diepgaande invloed uit op de fysiologie van macrofagen15. Gezuiverd M-CSF kan echter worden gekocht en gebruikt als alternatief voor L-929-supernatanten in concentraties van 1 tot 2 ng/ml8.</li>
</ol>2. Verwijdering van het dijbeen en scheenbeen
<ol><li>Ga verder met 8 weken oude, C57BL-6 wildtype mannelijke muizeneuthanasie door cervicale dislocatie na verstikking door kooldioxide, in overeenstemming met normatieve resolutie nummer 18 van de Nationale Raad voor Dierproeven (Concea) en met goedkeuring van de Commissie ethiek en gebruik van dieren (CEUA).</li>
	<li>Doordrenk de muis met 70% ethanoloplossing en gebruik een steriele schaar om een incisie van 1 cm langs de buik te maken.</li>
	<li>Verwijder de huid totdat de spier van de achterpoten volledig bloot ligt.</li>
	<li>Verwijder de achterpoten op heuphoogte en zorg ervoor dat u het dijbeen en het scheenbeen niet breekt.</li>
	<li>Doe de achterpoten in een conische centrifugebuis met 70% ethanoloplossing. OPMERKING: Gebruik altijd pathogeenvrije muizen. Zorg ervoor dat u beide benen verzamelt om een groter aantal cellen te krijgen. Stap 2 wordt uitgevoerd in een niet-steriele omgeving (benchtop). Daarom is het belangrijk om het dijbeen en het scheenbeen voorzichtig te verwijderen, zodat ze intact blijven om bacteriële besmetting te voorkomen. De overige stappen van deze procedure worden uitgevoerd in een bioveiligheidskast met laminaire stroming. De tijd van blootstelling van de benen aan 70% ethanoloplossing moet worden beperkt tot 10 minuten. Als de tijd langer is, kunnen voorlopercellen van het beenmerg worden aangetast.</li>
</ol>3. Verkrijg beenmergvoorlopers uit het lumen van het scheenbeen en dijbeen
<ol><li>Haal de poten uit de 70% ethanoloplossing en breng ze over naar steriel PBS.</li>
	<li>Gebruik een tang en desinfecterende doekjes om alle spieren en fascia te verwijderen. Het bot moet na deze stap schoon zijn.</li>
	<li>Gebruik een steriel chirurgisch scalpelmesje om de botepifyse aan beide uiteinden door te snijden om het beenmerg bloot te leggen.</li>
	<li>Vul een spuit van 20 ml met 10 ml steriele PBS aangevuld met 2% penicilline/streptomycine-oplossing en sluit een naald van 26 G aan.</li>
	<li>Houd het bot vast met behulp van een anatomische dissectietang met één hand en gebruik de andere om de naald in de botholte te steken. Pas op dat u het bot niet verplettert met de tang.</li>
	<li>Was de binnenkant van het bot uit met de PBS en verzamel het beenmerg in een steriele kegelvormige centrifugebuis. Na deze stap zou de botholte er wit uit moeten zien.</li>
	<li>Centrifugeer de verzamelde cellen gedurende 10 minuten bij 300 x g bij 4 °C.</li>
	<li>Gooi het supernatans weg en resuspendeer de celpellet in 1 ml DMEM/F12-10.</li>
	<li>Homogeniseer en voeg nog eens 9 ml DMEM/F12-10 medium toe om de cellen op een totaal van 10 ml te brengen.</li>
</ol>4. Macrofaag cultuur
<ol><li>Voeg 1 ml celvoorlopercellen toe aan elk van de ronde plastic petrischaaltjes van 100 mm x 20 mm (in totaal 10 schaaltjes) en verdeel de cellen met een pipet over de platen om een gelijkmatige verdeling te verkrijgen. Gebruik geen met weefselkweek behandelde schalen.</li>
	<li>Voeg 9 ml DMEM/F12-10 aangevuld met 20% van het L-929 celsupernatans toe aan elk schaaltje.</li>
	<li>Incuberen in een incubator van 37 °C, 5% CO2 .</li>
	<li>Voeg op de 3edag 10 ml DMEM/F12-10 medium toegevoegd met 20% van het supernatans van L-929-cellen toe aan elk schaaltje. Op deze manier hebben de kweekschaaltjes nu in totaal 20 ml kweekmedium, voldoende voor de groei van de cellen tot het einde van hun rijping. OPMERKINGEN: Met weefselkweek behandelde schalen mogen niet worden gebruikt omdat macrofagen, als natuurlijke aanhangende cellen die worden gekenmerkt door sterke interacties met oppervlakken, later niet gemakkelijk van de schaal zullen loskomen. Gewoonlijk kunnen celvoorlopercellen van één muis (twee dijbenen) in 10 kweekschaaltjes worden gezaaid. Celvoorlopercellen zullen transformeren in macrofagen, die kunnen worden gebruikt van incubatiedag 7 tot 10. De bevestiging van de rijping wordt geïdentificeerd door veranderingen in de morfologie van macrofagen. Volwassen macrofagen zijn aanhankelijk en vertonen een heterogene morfologie, verklaard door de emissie van pseudopodia in verschillende richtingen. Voorbeelden van deze rijpe cellen worden getoond in de representatieve resultaten.</li>
</ol>5. Macrofagen oogsten
<ol><li>Gooi de supernatanten van alle kweekgerechten weg.</li>
	<li>Was elk kweekschaaltje met 10 ml warme (37 °C) steriele Mg2+ en Ca2+ vrije PBS.</li>
	<li>Gooi de oplossing van elk gerecht weg.</li>
	<li>Verwarm de oplossing voor niet-enzymatische celdissociatie voor tot 37 °C en voeg 3 ml toe aan elk gerecht. Incubeer gedurende 10 minuten in een incubator van 37 °C, 5% CO2 . Gebruik een omgekeerde microscoop om te visualiseren of de macrofagen zich dissociëren van de kweekschaaltjes. OPMERKING: Het gebruik van niet met weefselkweek behandelde plastic platen moet een gemakkelijke dissociatie van cellen mogelijk maken en voorkomen dat de cellen van de plaat moeten worden geschraapt.</li>
	<li>Was de vaat met behulp van een serologische pipet met de niet-enzymatische celdissociatieoplossing keer op keer, waarbij u cirkelvormige bewegingen uitvoert om te bevestigen dat alle macrofagen van de schaal zijn gedissocieerd.</li>
	<li>Verzamel de oplossing van alle kweekschaaltjes samen in een conische centrifugebuis van 50 ml.</li>
	<li>Voeg 10 ml steriel voorverwarmd PBS toe aan de lege kweekschaaltjes en ga te werk zoals in stap 5.4. Deze procedure is een herhaling van stap 5.4 en is bedoeld om te garanderen dat alle macrofagen worden verzameld.</li>
	<li>Centrifugeer op 300 x g, 4 °C gedurende 10 min.</li>
	<li>Gooi het supernatans weg en resuspendeer de pellet met 1 ml DMEM/F12-10. Homogeniseer langzaam en voorzichtig op en neer met behulp van de pipet om beschadiging van de cellen te voorkomen.</li>
	<li>Bereid een aliquot van 10 μL macrofaagoplossing verdund met 10 μL Trypan Blue om de cellen te tellen met behulp van de hemocytometer. OPMERKING: Op dag 7 produceert elk gerecht ongeveer 2 x 106 macrofagen. Dit betekent dat één muis ongeveer 2 x 107 primaire macrofagen kan produceren wanneer deze in tien platen wordt geoogst. Aangezien M-CSF alleen de rijping van macrofagen stimuleert, garandeert de procedure een populatie cellen die in wezen alleen uit macrofagen bestaat en vrij is van andere vervuilende leukocyten.</li>
</ol>

<ol><li>Gomez Perdiguero, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-resident+macrophages+originate+from+yolk-sac-derived+erythro-myeloid+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors.</a> Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).</li>
<li>van Furth, R., Cohn, Z. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+and+kinetics+of+mononuclear+phagocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">The origin and kinetics of mononuclear phagocytes.</a> The Journal of Experimental Medicine. 128 (3), 415-435 (1968).</li>
<li>Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+biology+in+development%2C+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Macrophage biology in development, homeostasis and disease.</a> Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).</li>
<li>Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+physiological+roles+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Origin and physiological roles of inflammation.</a> Nature. 454 (7203), 428-435 (2008).</li>
<li>Shapouri-Moghaddam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+plasticity%2C+polarization%2C+and+function+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Macrophage plasticity, polarization, and function in health and disease.</a> Journal of Cellular Physiology. 233 (9), 6425-6440 (2018).</li>
<li>Davies, J. Q., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+murine+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of murine macrophages.</a> Methods in Molecular Biology. 290, 91-103 (2005).</li>
<li>Jin, X., Kruth, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+macrophage+colony-stimulating+factor+differentiated+human+monocyte-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Culture of macrophage colony-stimulating factor differentiated human monocyte-derived macrophages.</a> Journal of Visualized Experiments. (112), e54244(2016).</li>
<li>Gonçalves, R., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolation+and+characterization+of+murine+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">The isolation and characterization of murine macrophages.</a> Current Protocols in Immunology. 111 (1), 1-16 (2015).</li>
<li>Varol, C., Mildner, A., Jung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages%3A+development+and+tissue+specialization%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Macrophages: development and tissue specialization.</a> Annual Review of Immunology. 33, 643-675 (2015).</li>
<li>Andrés, V., Pello, O. M., Silvestre-Roig, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+proliferation+and+apoptosis+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Lipidology%22%5BJournal%5D)">Macrophage proliferation and apoptosis in atherosclerosis.</a> Current Opinion in Lipidology. 23 (5), 429-438 (2012).</li>
<li>Pineda-Torra, I., Gage, M., de Juan, A., Pello, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+polarization+of+murine+bone+marrow-derived+and+peritoneal+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and polarization of murine bone marrow-derived and peritoneal macrophages.</a> Methods in Molecular Biology. 1339, 101-109 (2015).</li>
<li>Edwards, J. P., Zhang, X., Frauwirth, K. A., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+functional+characterization+of+three+activated+macrophage+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Biochemical and functional characterization of three activated macrophage populations.</a> Journal of Leukocyte Biology. 80 (6), 1298-1307 (2006).</li>
<li>Hamczyk, M. R., Villa-Bellosta, R., Andrés, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+macrophage+phagocytosis+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In vitro macrophage phagocytosis assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1339, 235-246 (2015).</li>
<li>Hosoe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+tumoricidal+macrophages+from+bone+marrow+cells+of+normal+mice+or+mice+bearing+a+colony-stimulating-factor-producing+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology%2C+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Induction of tumoricidal macrophages from bone marrow cells of normal mice or mice bearing a colony-stimulating-factor-producing tumor.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 28 (2), 116-122 (1989).</li>
<li>Rice, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((rM-CSF+efficiently+replaces+L929+in+generating+mouse+and+rat+bone+marrow-derived+macrophages+for+in+vitro+functional+studies+of+immunity+to+intracellular+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">rM-CSF efficiently replaces L929 in generating mouse and rat bone marrow-derived macrophages for in vitro functional studies of immunity to intracellular bacteria.</a> Journal of Immunological Methods. 477, 112693(2020).</li>
<li>Boltz-Nitulescu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+rat+bone+marrow+cells+into+macrophages+under+the+influence+of+mouse+L929+cell+supernatant%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Differentiation of rat bone marrow cells into macrophages under the influence of mouse L929 cell supernatant.</a> Journal of Leukocyte Biology. 41 (1), 83-91 (1987).</li>
<li>Weischenfeldt, J., Porse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow-derived+macrophages+%28BMM%29%3A+isolation+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Bone marrow-derived macrophages (BMM): isolation and applications.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2008 (12), (2008).</li>
<li>Austin, P. E., Mcculloch, E. A., Till, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+factor+in+L-cell+conditioned+medium+capable+of+stimulating+colony+formation+by+mouse+marrow+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture.</a> Journal of Cellular Physiology. 77 (2), 121-134 (1971).</li>
<li>Stanley, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+colony-stimulating+factor+%28CSF-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Encyclopedia+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Macrophage colony-stimulating factor (CSF-1).</a> Encyclopedia of Immunology. 116 (1983), 1650-1654 (1998).</li>
<li>Bou Ghosn, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+physically%2C+functionally%2C+and+developmentally+distinct+peritoneal+macrophage+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Two physically, functionally, and developmentally distinct peritoneal macrophage subsets.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (6), 2568-2573 (2010).</li>
<li>Ray, A., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mouse+peritoneal+cavity+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of mouse peritoneal cavity cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (35), e1488(2010).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflicten hebben.

Het produceren van een populatie van beenmerg-afgeleide macrofagen is een basisstap in veel experimentele modellen in de celbiologie, vooral wanneer het belangrijk is om een homogene populatie van primaire cellen te bereiken. Zoals gezegd kunnen celvoorlopercellen alleen in macrofagen veranderen in aanwezigheid van M-CSF. L-929 celsupernatanten kunnen worden gebruikt als de belangrijkste bron van M-CSF. Afgezien van de kosten, is er geen probleem om recombinant M-CSF zelf 8,17<sup class...

Monocyten en macrofagen zijn mononucleaire fagocyten die kunnen worden afgeleid van voorlopercellen in het beenmerg. Recente studies hebben gemeld dat macrofagen ook afkomstig zijn van van dooierzak afgeleide erythro-myeloïde voorlopercellen1. Ongeacht hun afleiding hebben deze leukocyten belangrijke effectorfuncties bij homeostase en ontsteking 2,3. Monocyten zijn cellen uit perifeer bloed die verder kunnen differentiëren tot macrofagen in het weefsel 2,4, terwijl macrofagen heterogene cellen zijn die fenotypes en functies vertonen die worden gereguleerd door de lokale blootstelling van groeifactoren en cytokines5. Omdat macrofagen zo'n functionele diversiteit vertonen, zijn ze in veel ziektemodellen bestudeerd. De in vitro cultuur van macrofagen is dus een belangrijk hulpmiddel geworden om hun fysiologie en hun rol bij verschillende ziekten te begrijpen. Het beenmerg is een belangrijke bron van voorlopercellen, waaronder voorlopercellen van macrofagen, die kunnen worden geïsoleerd en vermenigvuldigd, waardoor het aantal verkregen macrofagen exponentieel toeneemt. Bovendien zijn van beenmerg afgeleide macrofagen vooral belangrijk om de effecten te voorkomen die worden gegenereerd door de micro-omgeving van het weefsel, aangezien macrofagen hun fenotype veranderen als reactie op verschillende stimuli in weefsels 6,7. Voorlopercellen van het beenmerg veranderen in macrofagen bij blootstelling aan macrofaagkoloniestimulerende factor (M-CSF)8. Van beenmerg afgeleide macrofagen kunnen niet worden onderscheiden van van monocyten afgeleide macrofagen door biochemische markers in weefsel. Deze cellen vertegenwoordigen een zeer homogene populatie van primaire cellen, die in veel andere opzichten vergelijkbaar zijn met peritoneale macrofagen 6,9.
Vanwege hun heterogene reeks cellulaire functies zijn macrofagen al lang grondig bestudeerd door onderzoekers. Deze cellen kunnen worden gebruikt in verschillende experimentele modellen, waaronder infectieziekten en ontstekingsziekten, omdat ze in deze processen voorkomen10,11. Ze kunnen ook nuttig zijn om de polarisatie van macrofagen te onderzoeken als reactie op verschillende micro-omgevingsstimuli12,13. Hier wordt dus een eenvoudig en betrouwbaar protocol geboden met als doel het verkrijgen van grote aantallen primaire macrofagen uit het beenmerg van muizen.

<table><tbody><tr><td>20-cc spuit</td><td>DESCARPACK</td><td>SI100S4G</td><td>Steriele spuit</td></tr><tr><td>26-G naalden</td><td>BD</td><td>497AQDKT7</td><td>Steriele naalden</td></tr><tr><td>50-ml kegelcentrifugebuisje</td><td>SARSTEDT</td><td>62547254</td><td>Kunststof kegelbuisjes geschikt voor centrifugatie</td></tr><tr><td>70% ethanol oplossing</td><td>EMFAL</td><td>490</td><td>Ethanol oplossing voor sterilisatie</td></tr><tr><td>Anatomische dissectiepincetten</td><td>3B SCIENTIFIC</td><td>W1670</td><td>Bewaar in steriele beker met 70% ethanol oplossing</td></tr><tr><td>C57Bl/6 wild type muis</td><td>Aangeschaft bij Biot&eacute;rio Central aan Federal University of Minas Gerais</td><td>Niet van toepassing</td><td>Muizen moeten specifiek-pathogeen-vrij zijn, leeftijd tussen de 6 en 10 weken. Muizen moeten minimaal een week eerder worden gehuisvest om te herstellen van de stress van transport</td></tr><tr><td>Celkweekkolf T175</td><td>GREINER</td><td>C7481-50EA</td><td>T-175 kolf, schuin hals, oppervlakte 75 cm2, met filterdop, DNase vrij, RNase vrij</td></tr><tr><td>Celkweekkolf T75</td><td>GREINER</td><td>C7231-120EA</td><td>T-75 kolf, schuin hals, oppervlakte 75 cm2, met filterdop, DNase vrij, RNase vrij</td></tr><tr><td>Desinfecterende of babydoekjes?</td><td>CLOROX</td><td>Niet van toepassing</td><td>Het helpt bij het reinigen van het bot</td></tr><tr><td>Gedestilleerd water</td><td>GIBCO</td><td>15230</td><td>Sterieel gedestilleerd water</td></tr><tr><td>DMEM/F12-10</td><td>Niet van toepassing</td><td>Niet van toepassing</td><td>Voeg 10 mL van foetaal bovien serum (FBS) en 1 mL van Penicilline/Streptomycine (P/S) toe aan DMEM/F12 (q.s.p. 100 mL)</td></tr><tr><td>DMEM/F12-10 + supernatant van L-929 cellen</td><td>Niet van toepassing</td><td>Niet van toepassing</td><td>Voeg 20% van het supernatant van L929 cellen cultuur op DMEM/F-12-10 toe</td></tr><tr><td>Dulbecco's Aangepast Eagle's Medium - F12 (DMEM/F12)</td><td>GIBCO</td><td>12500096</td><td>DMEM: F-12 Medium bevat 2,5 mM L-glutamine, 15 mM HEPES, 0,5 mM natriumpyruvaat en 1200 mg/L natriumbicarbonaat. Hersuspendeer poeder tot 1 liter van gedestilleerd water en voeg 3,7 g natriumbicarbonaat toe. Pas pH aan op 7,2 en filter met 0,22 &micro;M. Bewaar bij 2 - 8 &deg;C in de vriezer</td></tr><tr><td>Foetaal bovien serum, gecertificeerd, hitte geïnactiveerd, Verenigde Staten (FBS)</td><td>GIBCO</td><td>10082147</td><td>Verrijking voor DMEM-F12</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>Z359629</td><td>Wordt gebruikt om macrofagen onder de microscoop te tellen</td></tr><tr><td>L-929 cellen</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>ATCC # CCL-1</td><td>L-929 is een lijn van muizen fibroblast cellen die worden gebruikt als bron van macrofaagkoloniestimulerend factor (M-CSF)</td></tr><tr><td>Nikon TI eclipse&nbsp;</td><td>NIKON&nbsp;</td><td>Niet van toepassing</td><td>Nikon TI Eclipse is een fluorescentie- en fasecontrastmicroscoop</td></tr><tr><td>Niet-enzymatische celdissociatieoplossing</td><td>CELLSTRIPER (CORNING)</td><td>25-056-CI</td><td>Niet-enzymatische celdissociatieoplossing verwijdert macrofagen uit de plaat zonder ze te beschadigen</td></tr><tr><td>Niet-behandelde ronde kweekschotels 100 &times; 20&ndash;mm</td><td>CORNING</td><td>CLS430591</td><td>Gebruik geen weefselkweek behandelde petrischalen of enige weefselkweek behandelde plaat</td></tr><tr><td>P3199 Penicilline G Kaliumzout</td><td>USBIOLOGICAL</td><td>113-98-4</td><td>Antibiotica</td></tr><tr><td>Penicilline en streptomycine (P/S) oplossing</td><td></td><td></td><td>Gebruik 0,26 gram penicilline en 0,40 gram streptomycine. Meng met 40 mL steriele PBS. Gebruik binnen een horizontaal lamellaire flowkast een 0,22 &micro;M filter en bewaar aliquots van 1,0 mL in 1,5 ml microfugebuisjes in de vriezer (-20&deg;C)</td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde zoutoplossing vrij van Calcium en Magnesium (PBS)</td><td>MEDIATECH</td><td>21-040-CM</td><td>Sterieel</td></tr><tr><td>S7975 Streptomycine Sulfaat, 650-850U/mg</td><td>USBIOLOGICAL</td><td>3810-74-0</td><td>Antibiotica</td></tr><tr><td>Serologische pipetten van 10mL of 25 mL</td><td>SARSTEDT</td><td>861254001</td><td>Serologische pipetten wordt gebruikt voor volumes hoger dan 1 mL</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonaat</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>144-55-8</td><td>pH correctie voor DMEM-F12</td></tr><tr><td>Software Nis Elements Viewer</td><td>NIKON</td><td>Niet van toepassing</td><td>NIS-Elements Viewer is een gratis standalone programma om afbeeldingsbestanden en datasets te bekijken</td></tr><tr><td>Steriele PBS en 2% van P/S oplossing</td><td>LABORCRIN</td><td>590338</td><td>Voeg 1 mL van P/S toe aan 40 mL van steriele PBS</td></tr><tr><td>Rechte iris schaar</td><td>KATENA</td><td>Niet van toepassing</td><td>Bewaar in steriele beker met 70% ethanol oplossing</td></tr><tr><td>Supernatant van L-929 cellen</td><td>Niet van toepassing</td><td>Niet van toepassing</td><td>L-929 is een lijn van muizen fibroblast cellen die worden gebruikt als bron van macrofaagkoloniestimulerend factor (M-CSF). L-929 supernatant werd verkregen uit het protocol</td></tr><tr><td>Chirurgische scalpelblad nr.24 Roestvrij staal</td><td>SWANN-MORTON</td><td>311</td><td>Wordt gebruikt om epifyse van botten bloot te leggen</td></tr><tr><td>Trypan Blauw Oplossing, 0,4%</td><td>GIBCO</td><td>15250061</td><td>Trypan Blauw Oplossing, 0,4%, wordt routinematig gebruikt als celkleuring om de celviabiliteit te beoordelen met behulp van de kleurstoffen uitsluitingstest</td></tr><tr><td>Trypsine/EDTA oplossing 0,05%</td><td>GIBCO</td><td>25300-062</td><td>Wordt gebruikt om cellen los te maken van de kweekfles</td></tr><tr><td>Water voor injectie (WFI) voor celkweek</td><td>GIBCO</td><td>A12873</td><td>Sterieel en end

isolatie en cultuur van beenmerg-afgeleide macrofagen van muizen

Isolation and Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages from Mice

Macrofagen hebben belangrijke effectorfuncties bij homeostase en ontsteking. Deze cellen zijn aanwezig in elk weefsel in het lichaam en hebben het belangrijke vermogen om hun profiel te veranderen afhankelijk van de stimuli die in de micro-omgeving aanwezig zijn. Cytokinen kunnen de fysiologie van macrofagen diepgaand beïnvloeden, met name IFN-γ en interleukine 4, en respectievelijk M1- en M2-typen genereren. Vanwege de veelzijdigheid van deze cellen kan de productie van een populatie van beenmerg-afgeleide macrofagen een basisstap zijn in veel experimentele modellen van celbiologie. Het doel van dit protocol is om onderzoekers te helpen bij het isoleren en kweken van macrofagen afkomstig van beenmergvoorlopercellen. Beenmergvoorlopercellen van pathogeenvrije C57BL/6-muizen worden omgezet in macrofagen bij blootstelling aan macrofaagkoloniestimulerende factor (M-CSF) die, in dit protocol, wordt verkregen uit het supernatans van de muizenfibroblastlijn L-929. Na incubatie zijn volwassen macrofagen beschikbaar voor gebruik van de 7etot de 10edag. Een enkel dier kan de bron zijn van ongeveer 2 x 107 macrofagen. Daarom is het een ideaal protocol voor het verkrijgen van grote hoeveelheden primaire macrofagen met behulp van basismethoden van celcultuur.

Macrofagen zijn grote en hechtende cellen met speciale fysiologische kenmerken. Ze vertonen een diversiteit aan morfologische presentaties in cultuur vanwege het vermogen om zich te hechten aan glas en plastic, en hun typische verspreide morfologie is gerelateerd aan de emissie van cytoplasmatische extensies (Figuur 1). Zodra beenmergvoorlopercellen worden blootgesteld aan M-CSF van L-929-celsupernatant en de transformatie naar volwassen macrofagen starten, worden ze gehecht aan de petriplaa...

Het huidige protocol beschrijft de isolatie en kweek van beenmerg-afgeleide macrofagen van muizen.

Isolatie en cultuur van beenmerg-afgeleide macrofagen van muizen

Macrophages have important effector functions in homeostasis and inflammation. These cells are present in every tissue in the body and have the important ...

Dit protocol is gericht op het verkrijgen van grote hoeveelheden niet-gestimuleerde macrofagen die zijn afgeleid van beenmerg en nooit zijn blootgesteld aan weefselfactoren of cytokines. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is het aantal cellen dat van een enkel dier wordt verkregen. Met de juiste procedure kunnen ongeveer 2 keer 10 tot de macht 7 macrofagen worden verkregen.Deze methode zou onderzoekers kunnen helpen uit verschillende gebieden die macrofagen bestuderen, zoals celbiologie, pathologie, immunologie en parasitologie, Omdat cellen altijd vatbaar zijn voor besmetting, zijn voorzichtigheid met alle steriele stappen en het gebruik van een bioveiligheidskast met laminaire stroming noodzakelijk om de levensvatbaarheid van de cel te behouden. De procedure zal worden gedemonstreerd door Izabela Aparecida de Souza. Een masterstudent uit ons laboratorium.Om de procedure te starten op de correct geëuthanaseerde acht weken oude C57BL/6 wildtype mannelijke muis, weekt u de muis met 70%ethanol oplossing. Maak met een steriele schaar een incisie van een centimeter langs de buik en verwijder de huid totdat de spier van de achterpoten volledig bloot ligt. Verwijder vervolgens

isolation-and-culture-of-bone-marrow-derived-macrophages-from-mice

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Macrofagen spelen een centrale rol in homeostase en pathologie in vele weefsels. Het protocol hier gepresenteerde beschrijft methoden voor uitputting van...

Uitputting en reconstitutie van macrofagen in Muizen

In this video, we demonstrate the isolation and culture of bone marrow stromal cells from the long bones of mice. The isolated adherent BMSCs can be used for further analysis.

Isolation and Culture of Bone Marrow Stromal Cells from a Mouse Tibia

In this video, we demonstrate the activation of bone marrow-derived macrophages in response to bacterial lipopolysaccharide and intravenous immunoglobulin.

Activation of Mouse Bone Marrow-Derived Macrophages in Response to Antibodies

Het artikel beschrijft een gemakkelijk gemakkelijk...

Onderzoek van Macrophage Polarisatie behulp beenmerg afgeleide Macrofagen

Macrofagen zijn lang erkend als een kritische component van het aangeboren en adaptieve immuunsysteem. De recente explosie van kennis met betrekking tot evolutionaire, genetische en biochemische aspecten van de interactie tussen macrofagen en microben heeft wetenschappelijke aandacht vernieuwd macrofagen. Dit artikel beschrijft een methode om macrofagen te onderscheiden van muizen beenmerg.

Bone Marrow-afgeleide macrofagen Productie

Hier presenteren we een protocol dat grote hoeveelheden muis-monocyten genereert uit heterogeen beenmerg voor translationele toepassingen. In vergelijking met andere methoden helpt deze nieuwe methode het aantal geofferde dieren te verminderen en de kosten te drukken door dure methoden zoals hooggradige magnetische celscheiding (MACS) te vermijden.

Isolatie en intraveneuze injectie van muizen beenmerg afgeleide Monocyten

Metabolische herprogrammering is een kenmerkend en vereist kenmerk voor M1 en M2 macrofaagpolarisatie. Dit manuscript beschrijft een test voor de meting van fundamentele parameters van glycolyse en mitochondriale functie in muis-beenmerg-afgeleide macrofagen. Deze tool kan worden toegepast om te onderzoeken hoe bepaalde factoren het metabolisme en fenotype van macrofagen beïnvloeden.

Metabole karakterisering van gepolariseerde M1 en M2 Bone Marrow-afgeleide macrofagen met behulp van real-time extracellulaire Flux Analysis

Dit protocol is vastgesteld voor het kweken van tetrahydrobiopterine (BH4) - en induceerbare stikstofmonoxidesynthase (iNOS) - deficiënte primaire murine macrofagen om NO-redox biologie te bestuderen. De studie richt zich op het verminderen van potentiële besmetting van BH4 en andere artefacten gevonden in traditionele isolatie- en kweekmethoden die experimentele uitkomsten en interpretatie van resultaten kunnen verstoren.

Isolatie en in vitro kweek van beenmerg-afgeleide macrofagen voor de studie van NO-redox biologie

We presenteren een tweestappenprotocol voor hoogwaardige mitochondrische isolatie dat compatibel is met eiwitontdekking en kwantificering op proteoomschaal. Ons protocol vereist geen genetische manipulatie en is dus geschikt voor het bestuderen van mitochondriën uit primaire cellen en weefsels.

Tweestaps tagvrije isolatie van mitochondriën voor verbeterde eiwitontdekking en kwantificering

Dit protocol beschrijft een niet-enzymatische en eenvoudige methode voor het isoleren van 7-9 dagen oude neonatale beenmergcellen van muizen en het genereren van gedifferentieerde macrofagen met behulp van een supernatans van L929-cellen als bron van granulocytkoloniestimulerende factor (M-CSF). De van beenmerg afgeleide macrofagen werden verder geanalyseerd op oppervlakteantigenen F4/80, CD206, CD11b en functionele competentie.

Neonatale beenmergisolatie bij muizen en bereiding van van beenmerg afgeleide macrofagen

Leer de isolatie en cultuur van beenmerg-afgeleide macrofagen van muizen voor immunologie en celbiologie. Deze methode levert ongeveer 2 x 10^7 ongestimuleerde cellen per dier op.

Isolatie en cultuur van beenmerg-afgeleide macrofagen van muizen

Meer video's verkennen