Name: Op flotatie gebaseerde T-celisolatie, activering en uitbreiding van menselijke perifere bloedmononucleaire celmonsters met behulp van microbubbels (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-23T14:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: Leer T-celisolatie en -expansie op basis van microbubbels voor celtherapie met behulp van humane PBMC's. Deze methode verbetert T-celpersistentie en vermindert uitputting tijdens activering.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Isolatie van T-cellen met microbubbels met behulp van positieve selectie
OPMERKING: Dit protocol beschrijft een kleinschalige CD3+ positieve selectiebenadering met samb's.
<ol><li>Incubeer 3 x 108 commercieel verkregen PBMC's in 2,5 ml scheidingsbuffer met gebiotinyleerd anti-CD3 (OKT3) antilichaam in een concentratie van 25 ng antilichaam per 1 miljoen cellen (25 ng / M). Meng voorzichtig door op en neer te pipetteren en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Voeg streptavidin microbubbels (SIB's) toe in een verhouding van 0,5 (SAMB-hoeveelheid):1 (celhoeveelheid) volgens de door de fabrikant gerapporteerde SAMB-concentratie.</li>
	<li>Meng met behulp van een commerciële end-over-end (EOE) rotator bij 20 rpm gedurende 10-15 minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 400 x g bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Na centrifugatie bevinden de positief geselecteerde cellen zich aan de bovenkant van de suspensie met de SAMB's. De resterende niet-geselecteerde cellen bevinden zich in de celpellet aan de onderkant van de buis. Gebruik een 9 in glazen pipet, steek de punt onder de bubbelcellaag naar de bodem van de buis, adem de celpellet en subnatant op met een elektronische pipet en breng ze over naar een nieuwe buis.</li>
</ol>2. Co-stimulatie (activering) van de positief geselecteerde T-cellen
<ol><li>Resuspendeer de bellencellaag die in de oorspronkelijke buis achterblijft in 1 ml volledig T-celmedium (of een ander gewenst medium).</li>
	<li>Tel de cellen in het subnatant met brightfield-microscopie met behulp van een geautomatiseerde celteller en trek deze waarde af van het begincelnummer om het aantal cellen te bepalen dat in de bellencellaag is vastgelegd.</li>
	<li>Meng voorafgaand aan deze stap het gebiotinyleerde anti-CD28-antilichaam met commerciële SAMB's gedurende minimaal 2 uur om de geconjugeerde anti-CD28 SAMB's te maken. Neem contact op met de SAMB-fabrikant om de hoeveelheid anti-CD28-antilichaam te bepalen die nodig is voor conjugatie. Voeg de anti-CD28 geconjugeerde SIB's toe aan de bellencelsuspensie die het resultaat is van stap 2.1 met een verhouding van 1,5 (anti-CD28 SIB's):1 (cellen).</li>
	<li>Meng met behulp van EOE-rotatie gedurende 15 minuten en pas vervolgens het totale volume aan op 2 miljoen cellen per ml met volledig T-celmedium of een ander gewenst medium volgens het celnummer dat is verkregen in stap 2.2.</li>
</ol>3. Expansie van de mede gestimuleerde cellen in celkweekmedium
<ol><li>Verdeel 1 ml geactiveerde cellen uit stap 2.4 in een concentratie van 2 M/ml per put in een plaat met 24 putten. Incubeer in een bevochtigde 5% CO2 incubator bij 37 °C.</li>
	<li>Voeg na 24 uur 50 U/ml IL-2 en 25 ng/M oplosbare anti-CD3 (OKT3) toe om de expansie verder te stimuleren, zoals berekend met behulp van het initiële aantal cellen dat op dag 0 is verguld. Plaats de celplaat terug in de bevochtigde CO2-incubator en laat deze een nacht incuberen bij 37 °C.</li>
</ol>4. Optioneel: Transductie van geactiveerde T-cellen met lentivirus
OPMERKING: De hier gehanteerde aanpak is overgenomen van Prommersberger et al. 10.
<ol><li>Ontdooi het lentivirus bij kamertemperatuur en meng kort door pipetteren.</li>
	<li>Verwijder voorzichtig de mid-natant, 600 μL uit elke put, zonder de dochtercellen aan te raken die zich nu op de bodem van de put bevinden of de bellenlaag die aan het oppervlak van de oplossing is achtergebleven.</li>
	<li>Voeg 5 μg/ml hexadimethrinebromide per put toe om de virale transductie te verbeteren. Voeg de lentivirale deeltjes toe bij een veelheid van infectie (MOI) van 3 (lentivirale deeltjes per cel).</li>
	<li>Centrifugeer de plaat gedurende 45 minuten bij 800 x g en 32 °C met langzame versnelling en geen pauze voor vertraging. Incubeer de cellen gedurende 4 uur in een bevochtigde CO2-incubator bij 37 °C.</li>
	<li>Voeg na 4 uur 600 μL in de handel verkrijgbaar, vers compleet T-celmedium en 50 U/ml IL-2 toe aan elke put en plaats de celplaat terug in de bevochtigde CO2-incubator bij 37 °C voor T-celexpansie.</li>
</ol>5. Expansie van de T-cellen (met of zonder voorafgaande transductie)
<ol><li>Verwijder om de 2 dagen de helft van het medium uit het middennatuur, vervang het door een vers, compleet T-celmedium en voeg IL-2 toe in een concentratie van 50 U / ml.</li>
	<li>Tel de T-cellen twee keer per week om de celdichtheid te beoordelen. Wanneer de celdichtheid groter is dan 2 x 10 6-2,5 x 106 cellen / ml, breng de cellen over in een groter vat en verdun ze tot 5 x 105 cellen / ml.</li>
</ol>6. Oogsten van de T-cellen en flowcytometrie
<ol><li>Meng voorzichtig de inhoud van elk putje door op en neer te pipetteren. Verwijder de volledige inhoud van de put, inclusief de microbubbels, en breng ze over in een buis van 1,5 ml.</li>
	<li>Was elk putje met 400 μL calciumvrije en magnesiumvrije DPBS (−/−) en breng de oplossing over in een buis van 1,5 ml. Centrifugeer bij 400 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Aspirateer het supernatant en resuspenseer de celpellet in 50 μL scheidingsbuffer.</li>
	<li>Beits met een activerings- en uitputtingsantilichaam / kleuringscocktail en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Bereid de vlekkende cocktails als volgt- activeringscocktail: AF700-CD3, PE/Dazzle-CD4, PE/Cy7-CD8, BV510-CD25, PE-CD69; uitlaat cocktail: AF700-CD3, PE/Dazzle-CD4, PE/Cy7-CD8, PE-PD-1.</li>
	<li>Voeg 1 ml scheidingsbuffer toe en meng voorzichtig. Centrifugeer bij 400 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om overtollige antilichamen uit te spoelen. Adem het supernatant volledig op.</li>
	<li>Resuspendeer de celpellet in 1 ml scheidingsbuffer en breng over naar een geschikt vat (bijv. Een FACS-buis, een 96-well-plaat, enz.) voor de flowcytometrie-analyse. Het aanbevolen gatingschema voor flowcytometrieanalyse is gedetailleerd beschreven in figuur 1.</li>
</ol>

<ol><li>Albinger, N., Hartmann, J., Ullrich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+and+perspective+of+CAR-T+and+CAR-NK+cell+therapy+trials+in+Germany%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Current status and perspective of CAR-T and CAR-NK cell therapy trials in Germany.</a> Gene Therapy. 28 (9), 513-527 (2021).</li>
<li>Tyagarajan, S., Spencer, T., Smith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+CAR-T+cell+manufacturing+processes+during+pivotal+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy.+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Optimizing CAR-T cell manufacturing processes during pivotal clinical trials.</a> Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 16, 136-144 (2019).</li>
<li>Stock, S., Schmitt, M., Sellner, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+manufacturing+protocols+of+chimeric+antigen+receptor+T+cells+for+improved+anticancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Optimizing manufacturing protocols of chimeric antigen receptor T cells for improved anticancer immunotherapy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (24), 6223(2019).</li>
<li>Rohaan, M. W., Wilgenhof, S., Haanen, J. B. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+cellular+therapies%3A+The+current+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Archiv%22%5BJournal%5D)">Adoptive cellular therapies: The current landscape.</a> Virchows Archiv. 474 (4), 449-461 (2019).</li>
<li>Abou-El-Enein, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+manufacturing+of+CAR+T+cells+for+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Scalable manufacturing of CAR T cells for cancer immunotherapy.</a> Blood Cancer Discovery. 2 (5), 408-422 (2021).</li>
<li>Poltorak, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expamers%3A+A+new+technology+to+control+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Expamers: A new technology to control T cell activation.</a> Scientific Reports. 10, 17832(2020).</li>
<li>Kagoya, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+stimulation+expands+superior+antitumor+T+cells+for+adoptive+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Transient stimulation expands superior antitumor T cells for adoptive therapy.</a> JCI Insight. 2 (2), 89580(2017).</li>
<li>Snow, T., Roussey, J., Wegner, C., McNaughton, B. Application No. 63/326,446. US Patent. , 63/326,446 (2022).</li>
<li>McNaughton, B., et al. Application No. 16/004,874. US Patent. , 16/004,874 (2018).</li>
<li>Prommersberger, S., Hudecek, M., Nerreter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-based+CAR+T+cells+produced+by+lentiviral+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Antibody-based CAR T cells produced by lentiviral transduction.</a> Current Protocols in Immunology. 128 (1), 93(2020).</li>
<li>Wijewarnasuriya, D., Bebernitz, C., Lopez, A. V., Rafiq, S., Brentjens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excessive+costimulation+leads+to+dysfunction+of+adoptively+transferred+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">Excessive costimulation leads to dysfunction of adoptively transferred T cells.</a> Cancer Immunology Research. 8 (6), 732-742 (2020).</li>
<li>Li, Y., Kurlander, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+anti-CD3+and+anti-CD28-coated+beads+with+soluble+anti-CD3+for+expanding+human+T+cells%3A+Differing+impact+on+CD8+T+cell+phenotype+and+responsiveness+to+restimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Comparison of anti-CD3 and anti-CD28-coated beads with soluble anti-CD3 for expanding human T cells: Differing impact on CD8 T cell phenotype and responsiveness to restimulation.</a> Journal of Translational Medicine. 8, 104(2010).</li>
</ol>

Alle auteurs zijn op het moment van indiening werknemers van Akadeum Life Sciences, dat microbubbelscheidingsproducten produceert en verkoopt.

Het beschreven protocol maakt de isolatie van T-cellen uit PBMC-monsters en de activering van gesuspendeerde T-cellen in kweekmedia met microbubbels mogelijk. Deze methode is gebaseerd op gefunctionaliseerde microbubbels waarvan het inherente drijfvermogen een unieke kans biedt om co-stimulerende signalen in cellen te introduceren en ze te activeren terwijl ze in een kweekmedium zijn gesuspendeerd, waardoor de blootstelling van de uitdijende cellen aan langdurige stimulatie wordt verminderd; een dergelijke overstimulatie...

Meer dan 500 chimere antigeenreceptor (CAR)-T celtherapie klinische studies worden momenteel over de hele wereld uitgevoerd, en vier CAR-T celtherapie producten zijn beschikbaar op de markt1. Er bestaan echter nog steeds tal van CAR-T-celonderzoeks- en productiebehoeften die moeten worden aangepakt om de werkzaamheid, schaalbaarheid en het succes op lange termijn van deze potentieel curatieve therapieën te verbeteren 2,3,4,5. Adoptief CAR-T-cel klinisch onderzoek en productie begint met T-celisolatie uit een perifeer bloedmonster en de daaropvolgende stimulatie, transductie en uitbreiding van de geïsoleerde cellen. Parameters zoals T-celherstel, zuiverheid en activerings- / uitputtingssignalen vereisen zorgvuldige overweging bij het kiezen van de celisolatie- en stimulatietechnieken voor CAR-T-celonderzoek en productie 3,4,6. Belangrijk is dat verbetering van de therapeutische persistentie van CAR-T-celtherapieën door het minimaliseren van de biologische belemmeringen die het gevolg zijn van de huidige productieprocessen, zoals T-celuitputting, nodig is om de therapeutische werkzaamheid te verbeteren 6,7.
Als alternatief voor traditionele celisolatiemethoden zoals fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) en magnetisch-geactiveerde celsortering (MACS), wordt hier buoyancy-activated cell sorting (BACS) met microbubbels voor T-celisolatie gedemonstreerd. Microbubbelscheiding maakt gebruik van drijvende, holle microsferen (microbubbels) om de doelen te binden en ze naar het oppervlak van vloeistofmonsters telaten drijven 8,9. Door microbubbels te functionaliseren met antilichamen (d.w.z. anti-CD3), kunnen de gewenste T-celpopulaties positief worden geselecteerd uit perifere bloedmonsters. Vervolgens wordt het gebruik van een andere populatie van antilichaam-gefunctionaliseerde microbubbels (d.w.z. anti-CD28) om positief geselecteerde T-cellen in suspensie te co-stimuleren en te activeren in dit werk aangetoond. Microbubbels bieden een eenvoudige en zeer instelbare isolatie- en activeringsworkflow die T-cellen genereert die klaar zijn voor zwevende celkweek en downstream-toepassingen zoals genetische modificatie en expansie. Van cruciaal belang is dat drijvende celactivering met microbubbels terughoudende celstimulatie bevordert om overmatige T-celuitputting te voorkomen7.
Voor deze studie was flowcytometrie het primaire hulpmiddel dat werd gebruikt om het isolatie-, activerings- en transductiesucces van de gefunctionaliseerde microbubbels te analyseren, evenals om gedetailleerde informatie te verstrekken over de specifieke subpopulaties die aanwezig zijn tijdens de groei- en expansiefasen na transductie. Naast flowcytometrie werden brightfield- en fluorescentiemicroscopie gebruikt om de celgezondheid, morfologie en transductiesucces te bevestigen. Op basis van deze resultaten bieden de microbubbeltechnologie en het protocol een afstembaarder en zachter alternatief voor de traditionele isolatie- en activeringsmethoden die momenteel worden gebruikt; in het bijzonder vertonen microbubbel-geactiveerde cellen een aanzienlijk lagere expressie van T-celuitputtingsmarkers dan die gewoonlijk wordt waargenomen met industriestandaard tools en kits.

```html
<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>21985-023</td><td>CAS: 60-24-2</td></tr><tr><td>Biologix Multi-Well Culture Plates 24-well plates</td><td>VWR&nbsp;</td><td>76081-560</td><td></td></tr><tr><td>Biotin anti-human CD28 (28.2) Antibody</td><td>Biolegend</td><td>302904</td><td></td></tr><tr><td>Biotin anti-human CD3 (OKT3) Antibody</td><td>Biolegend</td><td>317320</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, no calcium, no magnesium</td><td>Gibco</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Supplement</td><td>Thermofisher</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Human Recombinant IL2&nbsp;</td><td>BioVision (vwr)</td><td>10006-122</td><td></td></tr><tr><td>Lentiviral Particle rLV.EF1.zsGreen1-9</td><td>Takara Bio</td><td>0038VCT</td><td></td></tr><tr><td>Leukopak</td><td>BioIVT</td><td>HUMANLMX100-0001129</td><td></td></tr><tr><td>Normal Human PBMCs</td><td>BioIVT</td><td>HUMANHLPB-0002562</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin 100X for tissue culture</td><td>VWR</td><td>97063-708</td><td>CAS: 8025-06-7</td></tr><tr><td>Polybrene Infection/Transfection Reagent</td><td>Millipore Sigma</td><td>TR-1003-G</td><td>CAS:28728-55-4</td></tr><tr><td>Pooled Human AB Serum Plasma Derived Heat Inactivated</td><td>Innovative Research</td><td>ISERABHI100mL</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement, HEPES</td><td>Gibco</td><td>72400047</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin Microbubble Kit (includes Akadeum's separation buffer)</td><td>Akadeum</td><td>11110-000</td><td></td></tr></tbody></table>
```

op flotatie gebaseerde t-celisolatie, activering en uitbreiding van menselijke perifere bloedmononucleaire celmonsters met behulp van microbubbels

Flotation-Based T Cell Isolation, Activation, and Expansion from Human Peripheral Blood Mononuclear Cell Samples Using Microbubbles

Het proces van het isoleren van T-cellen uit perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) om ex vivo culturen vast te stellen, is cruciaal voor onderzoek, klinische tests en celgebaseerde therapieën. In deze studie wordt een eenvoudig, nieuw protocol gepresenteerd om T-cellen ex vivo te isoleren, activeren en uitbreiden van PBMC's. Deze studie maakt gebruik van gefunctionaliseerde buoyancy-activated cell sorting (BACS) -technologie om T-cellen te isoleren en te activeren. In het kort omvat het protocol de positieve selectie van CD3 + -cellen uit van leukopak afgeleide PBMC's, gevolgd door een 48 uur co-stimulatie met voorgeconjugeerde anti-CD28-gebonden streptavidin microbubbels (SAMBs) voorafgaand aan transductie in 24-well platen. Gefunctionaliseerde microbubbels bieden een unieke kans om cellen te activeren, wat leidt tot proliferatieve fenotypen die expansie mogelijk maken met minimale uitputting. Deze techniek biedt verminderde uitputting omdat de co-stimulerende microbubbels drijvend blijven en terugkeren naar de top van het kweekmedium, waardoor de hoeveelheid tijd dat de expanderende cellen in contact komen met de co-stimulerende factoren wordt verminderd. De resultaten geven aan dat de geïsoleerde en gekweekte T-cellen voldoende stimulatie ontvangen om te activeren en te prolifereren, maar niet in een mate die leidt tot overactivatie, wat vervolgens leidt tot uitputting, zoals aangetoond door de aanwezigheid van overmatige PD-1.

T-cellen werden geïsoleerd uit gekochte PBMC's en verguld voor activering zoals beschreven in het protocol. De negatieve controlemonsters (gekochte PBMC's) werden niet geactiveerd. Deze controlemonsters werden opgenomen om het effect aan te tonen dat het microbubbelactiveringsproces had op de experimentele monsters in vergelijking met de onaangeroerde en niet-gestimuleerde T-celcontroles, om ervoor te zorgen dat de waargenomen activeringsmarkers het resultaat waren van de toegevoegde activeringsfactoren en niet inherent ...

Het doel van deze studie is om de haalbaarheid van op flotatie gebaseerde scheiding aan te tonen om primaire menselijke T-cellen te isoleren, activeren en uitbreiden.

Op flotatie gebaseerde T-celisolatie, activering en uitbreiding van menselijke perifere bloedmononucleaire celmonsters met behulp van microbubbels

The process of isolating T cells from peripheral blood mononuclear&#160;cells (PBMCs) to establish ex vivo cultures is crucial for research, clinical ...

Het microbubbelactiverings- en uitbreidingsprotocol is belangrijk omdat het tegemoetkomt aan een grote onvervulde behoefte in celtherapieonderzoek en -productie, waardoor de persistentie en werkzaamheid van T-celtherapieën wordt verbeterd. De op drijfvermogen gebaseerde positieve selectie-, activerings- en expansietechniek van Akadeum beperkt overstimulatie en daaropvolgende T-celuitputting tijdens activerings- en uitbreidingsworkflows. Om te beginnen incubeer 3 keer 10 tot de 8e commercieel verkregen PBMC's in 2,5 milliliter scheidingsbuffer, met gebiotinyleerd anti-CD3-antilichaam.Meng de componenten voorzichtig door te pipetteren en incubeer ze gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Voeg gestripte avidin-microbubbels toe aan de cellen in een verhouding van 0,5 tot 1, volgens de instructies van de fabrikant. En meng met behulp van een commerciële end-over-end rotator bij 20 RPM gedurende 10 tot 15 minuten bij kamertemperatuur.Centrifugeer op 400g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Na centrifugatie bevinden de positief geselecteerde cellen zich aan de bovenkant van de suspensie met de gestripte avidin-microbubbels en de resterende niet-geselecteerde cellen bevinden zich in de celpellet aan de onderkant van de buis. Gebruik een glazen pipet van negen inch om de punt onder de bellencellaag aan de onderkant van de buis te plaatsen.Aspirateer de celpellet en subnatant met een elektronische pipet en breng ze over naar een nieuwe buis. Resuspendeer de bubbelcellaag die in de oorspronkelijke buis is achtergebleven in één milliliter volledig T-celmedium. Centrifugeer het subnatant op 400 g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur en gebruik het voor indirecte meting van zuiverheid en terugwinning.Na centrifugatie van de subnatant en niet-geselecteerde cellen, aspirateer het supernatant en resuspenseer de pellet in één milliliter media voordat u gaat tellen. Gebruik een geautomatiseerde celteller om de cellen in het subnatant te tellen met bright field microscopie en bepaal het aantal cellen dat is vastgelegd in de bellencellaag, zoals beschreven in het tekstmanuscript. Om de geconjugeerde anti-CD28 gestripte avidine en microbubbels te maken, voegt u het gebiotinyleerde anti-CD28-antilichaam toe aan de commerciële microbellen en mengt u met behulp van end-over-end rotatie gedurende minimaal twee uur.Voeg de anti-CD28 geconjugeerde streptokokken avidin microbellen toe aan de bereide bellencelsuspensie in een verhouding van 1,5 tot 1. Meng de componenten met end-over-end rotatie gedurende 15 minuten. Pas vervolgens het totale volume aan op 2 miljoen cellen per milliliter met volledig T-celmedium, of een ander gewenst medium volgens het verkregen celgetal.Verdeel een milliliter actieve cellen in een plaat met 24 putten en incubeer in een bevochtigde 5% kooldioxide-incubator bij 37 graden Celsius. Voeg na 24 uur IL-2 en oplosbare anti-CD3 toe om verdere expansie aan te moedigen, zoals berekend met behulp van het initiële aantal cellen dat op dag nul is verguld. Plaats de celplaat terug in de bevochtigde kooldioxide-incubator en incubeer 's nachts bij 37 graden Celsius.Verwijder elke twee dagen de helft van het medium uit het middennatuur. Vervang het door vers, compleet T-cel medium en voeg IL-2 toe in een concentratie van 50 eenheden per milliliter. Tel de T-cellen twee keer per week om de celdichtheid te beoordelen.Wanneer de celdichtheid groter is dan 2 keer 10 tot de 6e, of 2,5 keer 10 tot de 6e cellen per milliliter, breng ze dan over in een groter vat en verdun ze tot 5 keer 10 tot de 5e cellen per milliliter. Meng voorzichtig de inhoud van elk putje door op en neer te pipetteren. Verwijder de volledige inhoud van de put, inclusief de microbubbels, en breng ze over in een buis van 1,5 milliliter.Was elke put met 400 microliter calciumvrije en magnesiumvrije DPBS en breng de oplossing over in een buis van 1,5 milliliter. Centrifugeer vervolgens de buis op 400g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Aspirateer het supernatant en resuspendeer de celpellet in 50 microliter scheidingsbuffer.Splits vervolgens 50 microliter celsuspensie in 25 microliter elk voor activering en uitputting. Kleur de cellen met een kleuringscocktail van activerings- en uitputtingsantilichamen en incubeer ze gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Voeg een milliliter scheidingsbuffer toe, meng voorzichtig en centrifugeer om overtollige antilichamen uit te spoelen.Adem het supernatant volledig op. Resuspendeer de celpellet in één milliliter scheidingsbuffer en breng deze over naar een geschikt vat voor de flowcytometrieanalyse. Toenames in levensvatbare T-celaantallen en transgen positieve T-cellen werden waargenomen tussen het controlemonster en de cellen die microbubbel co-stimulatie ontvingen.Verhoogde effectorcelpopulaties werden ook waargenomen in de microbubbelmonsters. De levensvatbare geactiveerde T-cellen drukken verhoogde vroege activeringsmarker CD69 en midden- tot late activeringsmarker CD25 uit. Het totale aantal en percentage uitputtingsmarkers PD1-positieve cellen waren ook significant hoger in celmonsters die microbubbel co-stimulatie ontvingen.Het goed mengen en doseren van microbubbels is essentieel om een nauwkeurige dosering te garanderen, omdat de microbubbels snel naar de oppervlakte drijven zonder te roeren. We verwachten dat dit gebeurt door een snelle groei mogelijk te maken van een grote populatie T-cellen met een hogere activiteit dan die meer uitgeputte T-cellen die vaak in andere methoden worden gezien.

flotation-based-t-cell-isolation-activation-expansion-from-human

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Wij beschrijven een werkwijze voor het regulerende, geheugen naïeve T-cellen van een menselijke bloed donoren. Gepolariseerde Tregs kan worden vergeleken met andere subgroepen in verschillende genetische en functionele toepassingen met genetische homogeniteit, zoals onderdrukking assay ook hier beschreven.

Genereren van Induced regulatoire T-cellen uit primaire menselijke naïef en geheugen T-cellen

In this video, we demonstrate the isolation of B cells from human peripheral blood using biotinylated antibodies specific for non-B cells and streptavidin-conjugated magnetic microbeads.

Isolation and Purification of B Cells from Human Peripheral Blood

This video demonstrates T cell isolation from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using the functionalized buoyancy-activated cell sorting (BACS) technology. The isolation technique involves the positive selection of CD3+ T cells by labeling the cells with biotinylated anti-CD3 antibodies and separating the antibody-bound cells using streptavidin-bound microbubbles.

Flotation-Based T Cell Isolation Using Buoyancy-Activated Cell Sorting

Dit artikel beschrijft een methode voor de generatie en proliferatie van humane T-celklonen die specifiek reageren op een gedefinieerd allo-antigen. Dit protocol kan worden aangepast voor het klonen van humane T-cellen die specifiek zijn voor een verscheidenheid aan peptide-MHC-liganden.

Genereren van menselijke allogeen-specifieke T-cellen uit perifeer bloed

Hier bieden we een geoptimaliseerd protocol voor de isolatie en klonen van de schaarse T-cel entiteit van perifere Vδ1+CD4+ T-cellen die, zoals we onlangs hebben laten zien, een extrathymische αβ T-cel voorloper is. Deze techniek maakt het mogelijk om deze cellen kwantitatief te isoleren, klonen en efficiënt uit te breiden in ex vivo cultuur.

Isolatie en<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultuur van Vδ1<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; γδ T-cellen, een Extrathymic αβT-cel Progenitor

Hier voorgesteld is een eenvoudige methode voor het isoleren en flowcytometrische analyse van glioma infiltrerende perifere mononucleaire cellen die tijdsafhankelijk kwantitatieve gegevens over het aantal en activeringsstatus van immuuncellen die het begin hersentumor micro oplevert.

Isolatie en Flow cytometrische analyse van Glioom infiltreren perifere mononucleaire bloedcellen

Menselijk perifeer bloed wordt vaak gebruikt voor de beoordeling van de humorale immuunrespons. Hier worden de methoden beschreven voor het isoleren van menselijke B-cellen uit perifeer bloed, het differentiëren van menselijke B-cellen in antilichaam (Ab)-secreterende B-cellen (ASC's) in cultuur en het tellen van het totale aantal IgM- en IgG-ASC's via een ELISpot-assay.

De isolatie, differentiatie en kwantificering van menselijk antilichaam-uitscheidende B-cellen uit bloed: ELISpot als functionele Uitlezing van humorale immuniteit

Lymfocyten zijn de belangrijkste spelers in adaptieve immuunresponsen. Hier presenteren we een protocol voor de zuivering van lymfocyten om de fysiologische functies van de gewenste moleculen bij lymfocytenactivatie in vitro en in vivo te bepalen. De beschreven experimentele procedures zijn geschikt voor het vergelijken van functionele capaciteiten tussen controle- en genetisch gemodificeerde lymfocyten.

Isolatie en Activering van Muizen lymfocyten

We presenteren een eenvoudig protocol voor de isolatie van perifere mononucleaire bloedcellen uit volbloed verkregen van patiënten met de diagnose Sézary-syndroom, gevolgd door selectie van CD4 + T-cellen, hun stimulatie met phorbol12-myristate13-acetaat en A23187 ionofoor, en voorbereiding van RNA voor transcriptomische profilering.

Isoleren van menselijke perifere bloedmonucleaire cellen en CD4 + T-cellen van patiënten met het Sézary-syndroom voor transcriptomische profilering

Dit protocol beschrijft een high-throughput automatisering-compatibele methode om menselijke perifere bloed mononucleaire cellen te isoleren voor biobanking en andere doeleinden.

Het isoleren van Menselijke Perifere Bloed Mononucleaire Cellen van Buffy Coats via de Scheiding van de Hoge Doorvoer Immunomagnetische Parel

Leer T-celisolatie en -expansie op basis van microbubbels voor celtherapie met behulp van humane PBMC's. Deze methode verbetert T-celpersistentie en vermindert uitputting tijdens activering.

Op flotatie gebaseerde T-celisolatie, activering en uitbreiding van menselijke perifere bloedmononucleaire celmonsters met behulp van microbubbels (Video) | JoVE Journal

Op flotatie gebaseerde T-celisolatie, activering en uitbreiding van menselijke perifere bloedmononucleaire celmonsters met behulp van microbubbels

Meer video's verkennen