Op flotatie gebaseerde T-celisolatie, activering en uitbreiding van menselijke perifere bloedmononucleaire celmonsters met behulp van microbubbels

Het microbubbelactiverings- en uitbreidingsprotocol is belangrijk omdat het tegemoetkomt aan een grote onvervulde behoefte in celtherapieonderzoek en -productie, waardoor de persistentie en werkzaamheid van T-celtherapieën wordt verbeterd. De op drijfvermogen gebaseerde positieve selectie-, activerings- en expansietechniek van Akadeum beperkt overstimulatie en daaropvolgende T-celuitputting tijdens activerings- en uitbreidingsworkflows. Om te beginnen incubeer 3 keer 10 tot de 8e commercieel verkregen PBMC's in 2,5 milliliter scheidingsbuffer, met gebiotinyleerd anti-CD3-antilichaam.

Meng de componenten voorzichtig door te pipetteren en incubeer ze gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Voeg gestripte avidin-microbubbels toe aan de cellen in een verhouding van 0,5 tot 1, volgens de instructies van de fabrikant. En meng met behulp van een commerciële end-over-end rotator bij 20 RPM gedurende 10 tot 15 minuten bij kamertemperatuur.

Centrifugeer op 400g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Na centrifugatie bevinden de positief geselecteerde cellen zich aan de bovenkant van de suspensie met de gestripte avidin-microbubbels en de resterende niet-geselecteerde cellen bevinden zich in de celpellet aan de onderkant van de buis. Gebruik een glazen pipet van negen inch om de punt onder de bellencellaag aan de onderkant van de buis te plaatsen.

Aspirateer de celpellet en subnatant met een elektronische pipet en breng ze over naar een nieuwe buis. Resuspendeer de bubbelcellaag die in de oorspronkelijke buis is achtergebleven in één milliliter volledig T-celmedium. Centrifugeer het subnatant op 400 g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur en gebruik het voor indirecte meting van zuiverheid en terugwinning.

Na centrifugatie van de subnatant en niet-geselecteerde cellen, aspirateer het supernatant en resuspenseer de pellet in één milliliter media voordat u gaat tellen. Gebruik een geautomatiseerde celteller om de cellen in het subnatant te tellen met bright field microscopie en bepaal het aantal cellen dat is vastgelegd in de bellencellaag, zoals beschreven in het tekstmanuscript. Om de geconjugeerde anti-CD28 gestripte avidine en microbubbels te maken, voegt u het gebiotinyleerde anti-CD28-antilichaam toe aan de commerciële microbellen en mengt u met behulp van end-over-end rotatie gedurende minimaal twee uur.

Voeg de anti-CD28 geconjugeerde streptokokken avidin microbellen toe aan de bereide bellencelsuspensie in een verhouding van 1,5 tot 1. Meng de componenten met end-over-end rotatie gedurende 15 minuten. Pas vervolgens het totale volume aan op 2 miljoen cellen per milliliter met volledig T-celmedium, of een ander gewenst medium volgens het verkregen celgetal.

Verdeel een milliliter actieve cellen in een plaat met 24 putten en incubeer in een bevochtigde 5% kooldioxide-incubator bij 37 graden Celsius. Voeg na 24 uur IL-2 en oplosbare anti-CD3 toe om verdere expansie aan te moedigen, zoals berekend met behulp van het initiële aantal cellen dat op dag nul is verguld. Plaats de celplaat terug in de bevochtigde kooldioxide-incubator en incubeer 's nachts bij 37 graden Celsius.

Verwijder elke twee dagen de helft van het medium uit het middennatuur. Vervang het door vers, compleet T-cel medium en voeg IL-2 toe in een concentratie van 50 eenheden per milliliter. Tel de T-cellen twee keer per week om de celdichtheid te beoordelen.

Wanneer de celdichtheid groter is dan 2 keer 10 tot de 6e, of 2,5 keer 10 tot de 6e cellen per milliliter, breng ze dan over in een groter vat en verdun ze tot 5 keer 10 tot de 5e cellen per milliliter. Meng voorzichtig de inhoud van elk putje door op en neer te pipetteren. Verwijder de volledige inhoud van de put, inclusief de microbubbels, en breng ze over in een buis van 1,5 milliliter.

Was elke put met 400 microliter calciumvrije en magnesiumvrije DPBS en breng de oplossing over in een buis van 1,5 milliliter. Centrifugeer vervolgens de buis op 400g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Aspirateer het supernatant en resuspendeer de celpellet in 50 microliter scheidingsbuffer.

Splits vervolgens 50 microliter celsuspensie in 25 microliter elk voor activering en uitputting. Kleur de cellen met een kleuringscocktail van activerings- en uitputtingsantilichamen en incubeer ze gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Voeg een milliliter scheidingsbuffer toe, meng voorzichtig en centrifugeer om overtollige antilichamen uit te spoelen.

Adem het supernatant volledig op. Resuspendeer de celpellet in één milliliter scheidingsbuffer en breng deze over naar een geschikt vat voor de flowcytometrieanalyse. Toenames in levensvatbare T-celaantallen en transgen positieve T-cellen werden waargenomen tussen het controlemonster en de cellen die microbubbel co-stimulatie ontvingen.

Verhoogde effectorcelpopulaties werden ook waargenomen in de microbubbelmonsters. De levensvatbare geactiveerde T-cellen drukken verhoogde vroege activeringsmarker CD69 en midden- tot late activeringsmarker CD25 uit. Het totale aantal en percentage uitputtingsmarkers PD1-positieve cellen waren ook significant hoger in celmonsters die microbubbel co-stimulatie ontvingen.

Het goed mengen en doseren van microbubbels is essentieel om een nauwkeurige dosering te garanderen, omdat de microbubbels snel naar de oppervlakte drijven zonder te roeren. We verwachten dat dit gebeurt door een snelle groei mogelijk te maken van een grote populatie T-cellen met een hogere activiteit dan die meer uitgeputte T-cellen die vaak in andere methoden worden gezien.