Subcellulaire fractionering voor de isolatie van synaptische componenten uit het muizenbrein

Synapsen zijn de basis computationele eenheden van de hersenen. De gepresenteerde methode is een eenvoudig en waardevol hulpmiddel om de synapsen en hun moleculaire processen te bestuderen en ook om te begrijpen hoe ze kunnen worden veranderd bij verschillende hersenaandoeningen. Deze techniek omvat een fractionering van synaptosoomstructuren geïsoleerd uit de hersenen.

Dit stelt de onderzoeker in staat om effecten vast te leggen die mogelijk worden gecompartimenteerd op de synaps. De distributieniveaus en activiteit van specifieke eiwitten kunnen ook worden geanalyseerd met subsynaptische resolutie. Deze procedure duurt ongeveer 11 uur voor een individuele onderzoeker om te voltooien als alles soepel verloopt.

Een persoon die deze techniek nog nooit heeft uitgevoerd, kan moeite hebben met de duur van deze procedure, omdat het natuurlijk iets langer duurt voor iemand die niet bekend is met de stappen. Vanwege de lengte van deze experimentele dag, raden we ten zeerste aan om de dissecties uit te voeren met een partner die u kan helpen bij het vergemakkelijken van snelle weefselverzameling om ervoor te zorgen dat er geen monsters langer op ijs worden gezet dan nodig is. We raden ook aan om buffers en bench top materialen de dag voorafgaand aan het uitvoeren van dit experiment voor te bereiden, zodat alles binnen handbereik is wanneer dat nodig is.

Dit geldt met name voor de verzamelbuizen. Meerdere aliquots van in totaal 11 subcellulaire fracties zullen tegen het einde van deze procedure worden verzameld. Dus als je deze buizen van tevoren duidelijk hebt gelabeld, wordt je dag veel gemakkelijker.

Om te beginnen, plaats een fijne schaar onder de huid bij de onthoofdingsincisie naar een peri craniale diepte en maak een mid sagittale incisie tot aan de intranasale hechting om de hoofdhuid uit de schedel terug te trekken. Werk vanuit het occipitale gebied naar elk temporeel aspect en trim de fascia en spier om het externe oppervlak van de schedel voorbij elke externe akoestische meatus bloot te leggen. Beveilig de hoofdhuid en het rostrale aspect van de schedel met de niet-dominante hand en steek met de andere hand een fijne schaar twee millimeter in de caudale kant van het foramen magnum waar het ruggenmerg zichtbaar is.

Maak een middellijnincisie totdat de schaar het interne oppervlak van het intrapariëtale bot bereikt. Verander de hoek van de schaar zodat de messen parallel lopen aan het dorsale oppervlak van de schedel. Ga door met het bevorderen van de midsagittale incisie rostrale door de pariëtale en frontale botten met behulp van de sagittale en interfrontale hechtingen als leidraad en beëindig de incisie net voorbij de internasale hechting.

Maak vervolgens een drie millimeter loodrechte incisie naar het neusbeen, rostral naar de interne hechting, door de schaar loodrecht op de schedel te plaatsen met elk mes op een nasale premaxillaire hechting en er een gelijkmatige snede te maken. Gebruik tijdens het beveiligen van het rostrale aspect één kant van een getextureerde tang om de schedel voorzichtig uit de hersenen op te tillen en vervolgens lateraal en ventraal op te tillen. Herhaal dit langs de middellijn als dat nodig is, dan voor de andere hemisfeer totdat het hele hersenoppervlak is blootgesteld.

Met behulp van een gebogen tang of een fijne spatel tilt u voorzichtig de rostrale kant van de hersenen op. Snijd de oog- en hersenzenuwen door om de excisie uit de schedel te voltooien. Homogeniseer de hersenen met behulp van een glazen dons homogenisator geplaatst op een ijsbad in 12 up down passes bij 500 rpm.

Pauzeer kort bij elke downstroke om een grondige homogenisatie van het weefsel te garanderen. Breng het totale hersenhomogenaat over naar een 14 milliliter hoge snelheid ronde bodemcentrifugebuis en draai het op 800 G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius om het supernatant genaamd S1.transfer S1 naar een nieuwe centrifugebuis te verkrijgen, gooi de pellet weg. Neem twee vijf microliter aliquots van S1 voor de bicinchonininezuurtest en twee 100 microliter aliquots van S1 voor de western blot.

Draai S1 op 9.000 G gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius om het synaptische somale supernatant, of S2, en ruwe synaptosoompellet of P2 te verkrijgen. Neem twee, 10 microliter aliquots van S2 voor de bicinchoninic acid assay en twee 500 microliter aliquots van S2 voor de western blot. Gooi het supernatant weg na het verkrijgen van de aliquots. na centrifugeren bij 9.000 G gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius, verkrijg het supernatant S2'en gewassen synaptosoom, P2'Gooi het supernatant weg en resuspendeer P2'in drie milliliter buffer A.Vermijd resuspendatie van het donkerrode gedeelte aan de onderkant van de pellet, die voornamelijk mitochondriën bevat.

Neem twee 20 microliter aliquots P2'voor de bicinchonininezuurtest en twee 100 microliter aliquots van P2' voor de western blot. Voeg voor de hypotone lyse van gewassen synaptosoom negen volumes gekoelde buffer B toe om P2 te resuspenderen en homogeniseer het synaptosoom in een glazen donshomogenisator. Breng de monsters over naar 50 milliliter afgedekte conische centrifugebuizen en draai ze gedurende 15 minuten op een buis revolver in een koude ruimte van vier graden Celsius.

Centrifugeer de gelyseerde P2'at 25.000 G gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius om het lysis-supernatant of LS1 en de lysispellet met synaptosomale membranen of LP1 te verkrijgen. Neem twee, 50 microliter aliquots LS1 voor de bicinchonininezuurtest en twee 400 microliter aliquots LS1 voor de western blot. Breng LS1 over in een afgedekte centrifugebuis voor ultracentrifugatie.

Centrifugeer LS1 in een vaste hoek ultracentrifuge rotor op 100, 000 G gedurende 60 minuten bij vier graden Celsius om synaptisch cytosol supernatant, of LS2, en synaptische blaasjes pellet, of LP2 te verkrijgen. Resuspendeer LP2 in 500 microliter buffer A en gebruik een naald van 23 gauge en een spuit met één milliliter sheer LP twee met zachte trituratie. Neem twee, 10 microliter aliquots LP2 voor de bicinchonininezuurtest en twee, 250 microliter aliquots LP2 voor de western blot.

Breng ongeveer 30 milliliter LS2 over naar centrifugale filtereenheden met een afsnijding van 10 miliDalton en concentreer de LS2 tot ongeveer 0,5 milliliter door te draaien op 5.000 G gedurende maximaal een uur bij vier graden Celsius. Neem twee, 10 microliter aliquots geconcentreerd LS2 voor de bicinchoninische assay, en twee, 250 microliter aliquots van geconcentreerde LS2 voor de western blot. Resuspendeer LP1 in één milliliter buffer B, En neem twee, 10 microliter aliquots LP1 voor de bicinchonininezuurtest en twee 50 microliter aliquots LP1 voor de western blot.

Stel de resterende LP1 in op een eindvolume van 7,5 milliliter en een uiteindelijke sucroseconcentratie van 1,1 molair met buffer B en buffer C.Breng vervolgens 7,5 milliliter van de geresuspendeerde LP1 over in een ultracentrifugebuis van 14 milliliter. Leg de LP1 voorzichtig over elkaar met 3,75 milliliter buffer D en markeer de bovenkant van de oplossing met een pen. Vervolgens overlay met ongeveer 1,25 milliliter buffer A.En markeer op dezelfde manier de bovenkant van de oplossing met een pen.

Balanceer de buizen voor ultracentrifugatie op gewicht, niet volume, met de druppelgewijze toevoeging van buffer A tot binnen 10 milligram. Centrifugeer bij 48.000 G gedurende 2,5 uur bij vier graden Celsius in een zwaaiende emmer ultracentrifugerotor en verkrijg beelden van de intacte gradiënten om de onderscheidendheid van elke sucrose-interface en het succes van fractionering te documenteren. Verwijder voorzichtig de oppervlakkige laag van 320 millimolaire sucrose en herstel de myelinefractie op de 320 millimolar, 855 millimolaire sucrose-interface in een volume van 800 microliter.

Pipetteer op een cirkelvormige manier uit de buiswand om ervoor te zorgen dat de volledige fractie wordt verzameld. Herstel vervolgens de SPM-fractie op de 855 millimolaire, 1,1 millimolaire sucrose-interface in een volume van 1000 microliter. Zuig voorzichtig de resterende sucrose af en win de mitochondriale pellet terug door resuspendatie in 200 microliter buffer B.Verdun de SPM-fractie met twee volumes buffer B en centrifugeer vervolgens in een rotor met vaste hoek in een centrifugebuis van 3,5 milliliter.

Gooi het supernatant weg en resuspenseer de SPM-pellet in buffer A voor een eindvolume van 250 microliter. Neem twee, vijf microliter aliquots SPM voor de bicinchonininezuurtest en deel de resterende SPM in tweeën voor de western blot. Elektronenmicroscopiebeelden van synaptosoom worden in deze figuur getoond.

Een synaptosoom dat synaptische blaasjes bevat, zowel pre- als post-synaptische componenten en synaptische blaasjes in een mitochondrion, worden hier weergegeven. Immunoblotanalyse van subcellulaire fracties werd uitgevoerd om markers van fractiezuiverheid te beoordelen. In vergelijking met het initiële homogenaat van de hele hersenen, onthulde de analyse de verrijking van n-cadherine in de synaptische plasmamembraanfractie, alfa-synucleïne in het synaptische cytosol, synaptofysine in de synaptische blaasjesfractie en myelinebasisineteiwit in de myelinefractie.

Zodra de zuiverheid van de fractie is vastgesteld, kan kwantitatieve immunoblotting worden gebruikt om de lokalisatie van interessante eiwitten te bepalen, of om verschillen in eiwitverdeling tussen genotypen of behandelingen te onderzoeken. Wanneer u deze procedure probeert, zorg er dan voor dat u reinigingsmiddelvrij glaswerk gebruikt, zodat intact synafptosoom kan worden verzameld. Wees ook voorzichtig bij het voorbereiden van sucrosegradiënten om ervoor te zorgen dat u duidelijke interfaces krijgt.

Hiermee kunt u de synaptische plasmamembraanfractie met succes isoleren. Verschillende structurele en functionele analyses kunnen worden uitgevoerd om de kwaliteit van synaptische fracties zoals elektronenmicroscopie, immunoblotting, proteomics en andere moleculaire methoden te ondersteunen. Neurotransmitterafgifte of enzymatische assays kunnen ook worden uitgevoerd om de metabole levensvatbaarheid van synaptosoom te ondersteunen.

De isolatie van synasptosoomstructuren was een paradigmaverschuivingstechniek voor de analyse van synapsfunctie en -samenstelling. Omdat we vroege synaptische disfunctie in neurodegeneratie zien, zal de zorgvuldige dissectie van moleculaire veranderingen op synapsniveau ons helpen de moleculaire mechanismen van deze aandoeningen te onderzoeken.