Virusvoortplanting en celgebaseerde colorimetrische kwantificering

Dit protocol maakt het mogelijk om het Zika-virus te identificeren en te kwantificeren zonder afhankelijk te zijn van cytopathisch effect. Het hangt af van de antilichaamherkenning van de viruscomponent. Het gebruik van virusspecifieke antilichamen kan helpen bij het identificeren van verschillende virusserotypen in gemengde populaties.

Deze methode heeft voordelen ten opzichte van klassieke plaquevormende assays. Het is sneller en geschikt voor toepassingen met een hoge doorvoer wanneer het wordt toegepast met een geautomatiseerd beeldvormingssysteem voor het snel tellen van cellen. Het voorgestelde protocol is in hoge mate aanpasbaar.

Met de nodige aanpassingen kan het voorgestelde protocol worden toegepast op verschillende celtypen en virale doelen. Begin met het kweken van Vero-cellen in een celkweekkolf van 75 vierkante = centimeter die 12 milliliter DMEM bevat, aangevuld met 10% FBS en twee millimol L-glutamine. Plaats de kolf in een celkweekincubator bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide.

Om de celmonolaag te infecteren, gebruikt u een serologische pipet van 10 milliliter om het groeimedium uit de celkweekkolf te verwijderen. Spoel de kolf met een serologische pipet van vijf milliliter tweemaal met drie milliliter DPBS. Voeg vervolgens twee milliliter serumvrije DMEM en 20 microliter Zika-virusinoculum toe aan de celkweekkolf.

Laat de kolf een uur bij kamertemperatuur incuberen en zachtjes schommelen om de virusadsorptie te bevorderen. Verwijder aan het einde van de incubatie met behulp van een serologische pipet van vijf milliliter voorzichtig het verdunde virusinoculum uit de celkweekkolf en gooi het weg. Spoel de celkweekkolf twee keer met drie milliliter DPBS.

Voeg vervolgens 12 milliliter onderhoudsmedia toe aan de celkweekkolf om de geïnfecteerde cellen te behouden. Incubeer de geïnfecteerde Vero-cellen gedurende drie dagen in een celkweekincubator bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Gebruik na drie dagen incubatie een serologische pipet van 10 milliliter om het supernatans van de celkweek met het Zika-virus in een centrifugebuis van 50 milliliter te oogsten.

Voor de kwantificering van het virus zaait u Vero-cellen in daarvoor bestemde platen en laat u ze 's nachts groeien bij 37 graden Celsius met een atmosfeer van 5% koolstofdioxide. Bereid voor elke plaat zes steriele microcentrifugebuisjes van 1,5 milliliter voor om een tienvoudige seriële verdunning uit te voeren, inclusief een extra buisje voor een negatieve controle. Voor een plaatopstelling met 24 putjes voegt u 450 microliter serumvrije DMEM toe aan alle zes microcentrifugebuisjes.

Voor een plaatopstelling met 96 putjes doseert u 135 microliter serumvrije DMEM in zes extra buisjes. Om seriële verdunning uit te voeren voor het plaatexperiment met 24 putjes, voegt u 50 microliter van de Zika-virusvoorraad toe aan de buis van 10 tot min één met 450 microliter serumvrije DMEM. Voeg voor het plaatexperiment met 96 putjes 15 microliter Zika-virusvoorraad toe aan de 10 tot min één buis met 135 microliter serumvrije DMEM.

Draai elke buis om het virus en het medium grondig te mengen, zodat de virusdeeltjes gelijkmatig over de verdunning worden verdeeld. Gebruik een verse pipetpunt om de buis van 10 tot min één te resuspenderen en breng 50 en 15 microliter verdund Zika-virus over in het buisje van 10 tot min twee als een tweede tienvoudige verdunning voor respectievelijk de platen met 24 en 96 putjes. Verwijder het conditiemedium voor elk putje van de juiste plaat en gooi het weg.

Spoel elk putje twee keer met DPBS om eventuele resten te verwijderen. Begin met de hoogste verdunning en voeg het serieel verdunde virusinoculum toe aan de putjes, werkend naar de laagste verdunning. Verwijder na een uur incubatie de virussuspensie uit de putjes en gooi deze weg, te beginnen met de laagste naar de hoogste concentratie.

Was de geïnfecteerde cellen twee keer met DPBS om eventuele sporen van virussuspensie te verwijderen. Bedek het putje met DMEM en 1,5% carboxymethylcellulose met een lage viscositeit. Incubeer de plaat in een celkweekincubator bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide.

Verwijder na incubatie het overlaymedium en gooi het weg en was de cellen drie keer met PBS. Gebruik voor de plaat met 96 putjes een meerkanaalspipet om het overlaymedium te verwijderen en weg te gooien, en was de cellen drie keer met 60 microliter PBS per putje. Voeg 4% paraformaldehyde toe om de cellen te fixeren en incubeer de plaat gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.

Gooi na 20 minuten de paraformaldehyde weg en was de cellen driemaal met PBS. Voeg vervolgens 3, 3'diaminobenzidineperoxidasesubstraat toe en incubeer de plaat gedurende 30 minuten in het donker. Stop na 30 minuten de reactie door de putten met water te wassen.

Laat de platen een nacht aan de lucht drogen en ga verder met het opsommen van de brandpunten. Tel de brandpunten voor elke replicatie van de geselecteerde verdunning en bereken het gemiddelde aantal brandpunten voor elk. De geïnfecteerde Vero-cellen werden op verschillende tijdstippen na infectie gefixeerd.

Voor de plaat met 2 putjes werd de eerste verschijning van virushaarden 48 uur na infectie waargenomen, hoewel de grootte van de brandpunten te klein was om nauwkeurig te tellen. Na 96 uur na infectie waren er geen tekenen van celloslating. 60 uur na infectie was de grootte van de brandpunten toegenomen tot een optimaal niveau om te tellen.

Vervolgens, naarmate de tijd vorderde, werden de brandpunten groter en begonnen ze in intensiteit met elkaar samen te smelten of elkaar te overlappen, waardoor clusters werden gevormd die in de loop van de tijd groeiden. Daarom werden 60 uur na de infectie foci gevormd om de Zika-virustiter in een plaat met 24 putjes te bepalen. Voor de plaat met 96 putjes bleven de cellen 72 uur na infectie intact.

Het verschijnen van virushaarden werd voor het eerst waargenomen 24 uur na infectie. Tot 36 uur na infectie was de grootte van de brandpunten echter te klein. De optimale foci-grootte werd 48 uur na infectie bereikt.

Op de laatste tijdstippen werden overlappende of samengevoegde brandpunten waargenomen en nam het aantal overlappende brandpunten in de loop van de tijd toe. De foci vormden zich 48 uur nadat de infectie was gekozen om de virustiter van Zika-virusisolaten te bepalen. Voeg voorzichtig DPBS toe langs de zijkant van elk putje en schud de platen één tot drie keer heen en weer om celresten en overtollige media te verwijderen.

Deze techniek zal onderzoekers in Zika-onderzoek enorm ten goede komen en kan ook breed worden aangepast om andere klinisch belangrijke virussen te kwantificeren, waardoor het een waardevol hulpmiddel is voor virusbewaking en -diagnose.