Name: 3D-genoominteracties van zoogdieren in kaart brengen met Micro-C-XL (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-03T14:10:00.000+00:00
Duration: 11 min 41 s
Description: Leer Micro-C-XL voor het in kaart brengen van 3D-genoomorganisatie in zoogdiercellen met nucleosoomresolutie. Deze methode biedt een hoog signaal-ruisverhouding voor nauwkeurige chromatine-interacties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Christl Gaubitz en Kathleen Stewart-Morgan voor hun kritische lezing van het manuscript. We danken Anja Groth en het Groth-lab voor hun steun bij het opzetten van ons lab. We danken de medewerkers van het CPR/reNEW Genomics Platform voor hun steun: H. Wollmann, M. Michaut en A. Kalvisa. Het Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine (reNEW) wordt ondersteund door de Novo Nordisk Foundation subsidienummer NNF21CC0073729. Het Novo Nordisk Foundation Center for Protein Research (CPR) wordt ondersteund door de Novo Nordisk Foundation subsidienummer NNF14CC0001. We danken het Brickman-lab van het Novo Nordisk Center for Stem Cell Medicine, reNEW Copenhagen, voor de ES-cellen van muizen.

<ol><li>Lieberman-Aiden, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 326 (5950), 289-293 (2009).</li>
<li>Hsieh, T. -H. S., Fudenberg, G., Goloborodko, A., Rando, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-C+XL%3A+Assaying+chromosome+conformation+from+the+nucleosome+to+the+entire+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Micro-C XL: Assaying chromosome conformation from the nucleosome to the entire genome.</a> Nature Methods. 13 (12), 1009-1011 (2016).</li>
<li>Hsieh, T. -H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+nucleosome+resolution+chromosome+folding+in+yeast+by+Micro-C%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping nucleosome resolution chromosome folding in yeast by Micro-C.</a> Cell. 162 (1), 108-119 (2015).</li>
<li>Krietenstein, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+details+of+mammalian+chromosome+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural details of mammalian chromosome architecture.</a> Molecular Cell. 78 (3), 554-565 (2020).</li>
<li>Hsieh, T. -H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+the+3D+landscape+of+transcription-linked+mammalian+chromatin+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Resolving the 3D landscape of transcription-linked mammalian chromatin folding.</a> Molecular Cell. 78 (3), 539-553 (2020).</li>
<li>Belaghzal, H., Dekker, J., Gibcus, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hi-C+2.0%3A+An+optimized+Hi-C+procedure+for+high-resolution+genome-wide+mapping+of+chromosome+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Hi-C 2.0: An optimized Hi-C procedure for high-resolution genome-wide mapping of chromosome conformation.</a> Methods. 123, 56-65 (2017).</li>
<li>van Holde, K. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3avan+Holde%2C+KE+%22Chromatin%22">Chromatin</a>. , Springer. New York, NY. (1989).</li>
<li>Oksuz, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+chromosome+conformation+capture+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of chromosome conformation capture assays.</a> Nature Methods. 18, 1046-1055 (2021).</li>
<li>Lafontaine, D. L., Yang, L., Dekker, J., Gibcus, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hi-C+3.0%3A+Improved+protocol+for+genome-wide+chromosome+conformation+capture%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols%22%5BJournal%5D)">Hi-C 3.0: Improved protocol for genome-wide chromosome conformation capture.</a> Current Protocols. 1 (7), 198(2021).</li>
<li>Goloborodko, A., Venev, S., Abdennur, N., Di Tommaso, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mirnylab%2Fdistiller-nf%3B+v033%5BTitle%5D)+AND+%22Zenodo%22%5BJournal%5D)">Mirnylab/distiller-nf; v033.</a> Zenodo. , (2019).</li>
<li>Venev, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open2c%2Fcooltools%3A+v0.4.1%5BTitle%5D)+AND+%22Zenodo%22%5BJournal%5D)">Open2c/cooltools: v0.4.1.</a> Zenodo. , (2021).</li>
<li>Abdennur, N., Mirny, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooler%3A+Scalable+storage+for+Hi-C+data+and+other+genomically+labeled+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Cooler: Scalable storage for Hi-C data and other genomically labeled arrays.</a> Bioinformatics. 36 (1), 311-316 (2019).</li>
<li>Zhang, S., Übelmesser, N., Barbieri, M., Papantonis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancer-promoter+contact+formation+requires+RNAPII+and+antagonizes+loop+extrusion%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">Enhancer-promoter contact formation requires RNAPII and antagonizes loop extrusion.</a> BioRxiv. , (2022).</li>
<li>Barshad, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+polymerase+II+and+PARP1+shape+enhancer-promoter+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">RNA polymerase II and PARP1 shape enhancer-promoter contacts.</a> BioRxiv. , (2022).</li>
<li>Hansen, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+classes+of+chromatin+loops+revealed+by+deletion+of+an+RNA-binding+region+in+CTCF%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct classes of chromatin loops revealed by deletion of an RNA-binding region in CTCF.</a> Molecular Cell. 76 (3), 395-411 (2019).</li>
<li>Hua, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+genome+architecture+at+base-pair+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Defining genome architecture at base-pair resolution.</a> Nature. 595 (7865), 125-129 (2021).</li>
<li>Downes, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+targeted+3C+interrogation+of+cis-regulatory+element+organization+at+genome-wide+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">High-resolution targeted 3C interrogation of cis-regulatory element organization at genome-wide scale.</a> Nature Communications. 12, 531(2021).</li>
<li>Goel, V. Y., Huseyin, M. K., Hansen, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Region+capture+Micro-C+reveals+coalescence+of+enhancers+and+promoters+into+nested+microcompartments%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">Region capture Micro-C reveals coalescence of enhancers and promoters into nested microcompartments.</a> BioRxiv. , (2022).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het succes van een Micro-C-experiment hangt af van een paar cruciale stappen in het protocol die zorgvuldig moeten worden uitgevoerd. Ten eerste kan crosslinking met de extra crosslinker DSG of EGS leiden tot de aggregatie van cellen, afhankelijk van het celtype. Het toevoegen van 0,1%-0,5% BSA aan de verknopingsreactie vermindert de aggregatie aanzienlijk zonder de verknopingsefficiëntie te beïnvloeden. Inefficiënte verknoping kan leiden tot verhoogde percentages transchromosomale interacties die wijzen op willekeurige ligaties. De tweede, maar meest cruciale, stap in dit protocol is de vertering van chromatine met MNase. Suboptimale chromatinevertering leidt tot inefficiënte nabijheidsligatie (oververtering) of verhoogde snelheden van niet-nabijheidsgebonden dinucleosomen (ondervertering). De efficiëntie van de ligatiereactie kan worden geëvalueerd door middel van agarosegelelektroforese (Figuur 1B) en kan bovendien het best worden geschat door sequencing met een lage input. Als de sequentiebepaling met lage input een hoge duplicatiesnelheid (inefficiënte ligatie) of verhoogde di-nucleosoomsnelheden aan het licht brengt, moet de MNase-verteringsgraad opnieuw worden geëvalueerd. Met name het verlies van samples bij het uitvoeren van het protocol kan leiden tot een verminderde complexiteit van de bibliotheek. De concentratie van een monster kan het best worden geëvalueerd na DNA-zuivering (stap 5.3) of door minimale PCR (stap 8). De totale opbrengst van DNA van 5 x 106 zoogdiercellen na DNA-zuivering is doorgaans >2 μg. De DNA-concentratie moet worden gecontroleerd na de MNase-vertering, ExoIII-vertering en DNA-zuivering. Endogene nucleasen, waarvan de abundantie celtype-specifiek en soortspecifiek is, kunnen een bron van DNA-afbraak zijn. Bovendien kan DNA-zuivering op basis van kolommen leiden tot monsterverlies als gevolg van incompatibiliteit met het SDS door deproteïne-reacties. Ethanolneerslag kan worden overwogen als de DNA-concentratie bij deze stap laag is.
Aangezien Micro-C monsterspecifieke MNase-titratie vereist, is het een uitdaging om Micro-C toe te passen op kleine celpopulaties, zoals met kleine organen van verschillende modelorganismen, embryo's en afzonderlijke cellen, organoïden of biopsieën van patiënten. Hier biedt Hi-C 3.0 een beproefd alternatief met behulp van een eindpuntreactie door sequentiespecifieke restrictie-endonucleases 8,9.
Micro-C is een breed toepasbare hoge-resolutie chromosoomconformatietechnologie met een hoog dynamisch bereik en een lage signaal-ruisverhouding, waardoor het bijzonder geschikt is voor het onderzoeken van korteafstandschromosoomkenmerken 4,5,8, zoals chromosoomlussen. De resolutie van Micro-C maakt het mogelijk om promotor-enhancer-lussen vast te leggen, die buiten de detectielimiet van Hi-C liggen, waardoor een meer gedetailleerde analyse van de relatie tussen genoomorganisatie en regulatie 13,14,15 efficiënt mogelijk wordt. Bovendien zijn onlangs DNA-capturestrategieën gecombineerd met Micro-C om de locusspecifieke resolutie van de beoogde genomische loci tot ongekende niveaus te verhogen, waardoor nieuwe inzichten in de ultrastructuur van het 3D-genoom aan het licht zijn gekomen16,17,18. Samenvattend stellen we ons voor dat Micro-C en zijn derivaten een sleuteltechnologie zullen zijn voor het ontleden van de rol van het 3D-genoom in transcriptieregulatie en, bijgevolg, differentiatie en onderhoud van celtypen.

Micro-C-XL is een genoombrede techniek om 3D-genoomconformatie te meten met nucleosoomresolutie. Micro-C-XL bouwt voort op de veelgebruikte Hi-C-technologie op basis van nabijheidsligatie, die ons begrip van hoe 3D-genomen zijn georganiseerd heeftveranderd1. Micro-C-XL en zijn eerste iteratie, Micro-C, werden aanvankelijk ontwikkeld in Saccharomyces cerevisiae2,3 en later aangepast aan celsystemen van zoogdieren, waarvoor het protocol zijn volledige potentieel heeft aangetoond bij het detecteren van korteafstandskenmerken van het 3D-genoom, zoals chromosoomlussen en isolatieplaatsen. Deze versie is gebaseerd op recente publicaties van zoogdieren Micro-C-XL 4,5. Omdat Micro-C-XL Micro-C vervangt, wordt Micro-C-XL in het manuscript voortaan Micro-C genoemd.
De belangrijkste verschillen tussen Micro-C en Hi-C6 zijn als volgt: 1) genoomfragmentatie met microkokkennuclease (MNase) in vergelijking met restrictie-enzymen en 2) extra crosslinkers met grotere atomaire afstand tussen de reactieve groepen in vergelijking met alleen formaldehyde. Beide stappen dragen aanzienlijk bij aan de verbeterde signaal-ruisverhouding van Micro-C in vergelijking met conventionele Hi-C. De fragmentatiegrootte beperkt de resolutie waarmee de 3D-genoomorganisatie kan worden opgelost tijdens het proximity-ligatieprotocol. MNase is een nuclease dat bij voorkeur toegankelijk DNA verteert en nucleosomaal beschermd DNA intact laat. Nucleosoomvoetafdrukken met behulp van MNase-sequencing hebben aangetoond dat nucleosomen de meeste eukaryote genomen volledig bedekken7. Aangezien nucleosomen over het hele genoom zijn verdeeld met een gemiddelde afstand van 160-220 bp, afhankelijk van de soort en het celtype, is MNase het ideale enzym voor het in kaart brengen van de genoomarchitectuur met hoge resolutie.
Het gebruik van een extra crosslinker in combinatie met formaldehyde (FA) in de Micro-C-methode verbetert bovendien de signaal-ruisverhouding 2,8. Amine-specifieke crosslinkers met langere atomaire spacers tussen de reactieve groepen vergemakkelijken eiwit-eiwit crosslinks. Dit zijn meestal disuccinimidylglutaraat (DSG) of ethyleenglycolbis-succinimidylsuccinaat (EGS) met respectievelijk 7,7 Å en 16,1 Å afstandhouders. De vermindering van ruis door EGS of DSG is vooral duidelijk in experimenten met hoge fragmentatiesnelheden, zoals Micro-C, en treedt vermoedelijk op als gevolg van een vermindering van de snelheid van willekeurige ligatiegebeurtenissen8.
Een recent ontwikkeld Hi-C 3.0-protocol dat gebruikmaakt van ESG/DSG-crosslinking en meerdere combinaties van restrictie-enzymen, vermindert ruis in Hi-C-experimenten en verbetert de detectie van chromosoomlussen en isolatieplaatsen aanzienlijk 8,9. Toch bleek uit een site-by-site vergelijking van verschillende interactiegegevensfuncties dat Micro-C een superieure detectie had van korteafstandskenmerken, zoals chromosoomlussen en isolatieplaatsen, in vergelijking met zowel Hi-C 3.0 als conventionele Hi-C8. Hi-C 3.0 verbetert echter wel de detectie van korteafstandskenmerken en handhaaft een sterke detectie van genoomcompartimentering in vergelijking met conventionele Hi-C. Samenvattend kan worden gesteld dat de keuze van een methode voor het vastleggen van chromosomen moet worden bepaald door de objectieve en biologische vraag.
Hier bieden we een stapsgewijs protocol voor succesvolle Micro-C-experimenten die de organisatie van het 3D-genoom kunnen ontrafelen.

<table><tbody><tr><td>1 mM Biotin dATP</td><td>Jenna Bioscience&nbsp;</td><td>NU-835-Bio14-S</td><td></td></tr><tr><td>1 mM Biotin dCTP</td><td>Jenna Bioscience</td><td>NU-809-BioX-S</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dGTP</td><td>NEB</td><td>N0442S</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dTTP&nbsp;</td><td>NEB</td><td>N0443S</td><td></td></tr><tr><td>10 U/ml T4 PNK</td><td>NEB</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>100 U/L Exonuclease III</td><td>NEB</td><td>M0206L</td><td></td></tr><tr><td>10x NEBuffer 1.1</td><td>NEB</td><td>B7001S</td><td></td></tr><tr><td>10x NEBuffer 2.1</td><td>NEB</td><td>B7202S</td><td></td></tr><tr><td>10x T4 DNA Ligase buffer&nbsp;</td><td>NEB</td><td>B0202A</td><td></td></tr><tr><td>1x DPBS w/o Mg2+ and Ca2+</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>1x LIF</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2_Mercaptoethanol 50 mM&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>31350010</td><td>0.1 mM b-mercaptoethanol&nbsp;</td></tr><tr><td>37% Formaldehyde&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>252549-500ML</td><td>Caution. See manufactures MSDS</td></tr><tr><td>400 U/ml T4 DNA Ligase&nbsp;</td><td>NEB</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>5 U/ml Klenow Fragment</td><td>NEB</td><td>M0210L</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>BIO-RAD</td><td>1613102</td><td>Caution. See manufactures MSDS</td></tr><tr><td>BSA 20mg/ml</td><td>NEB</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cell counter</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8418-100ML</td><td>Caution. See manufactures MSDS</td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td><td>Invitrogen</td><td>65001</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td>refered to as: magnet magnet for 1.5 ml tubes</td></tr><tr><td>DynaMag-PCR Magnet</td><td>Invitrogen</td><td>492025</td><td>refered to as: magnet magnet for PCR tubes</td></tr><tr><td>EDTA Ultrapure 0.5M pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>EGTA Ultrapure 0.5M pH 8.0</td><td>BioWorld</td><td>40121266-1</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 96%&nbsp;</td><td>VWR Chemicals</td><td>20824365</td><td>quality control system&nbsp;</td></tr><tr><td>Ethidium Bromide&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15585-011</td><td></td></tr><tr><td>Ethylene glycol bis(succinimidyl succinate) (EGS)</td><td>ThermoFisher</td><td>21565</td><td></td></tr><tr><td>Fetl Bovin Serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7524</td><td>15% FBS</td></tr><tr><td>Gel Loading dye purple (6X)</td><td>NEB</td><td>B7024S</td><td></td></tr><tr><td>Glycine&nbsp;</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A1067.0500</td><td></td></tr><tr><td>Halt Proteinase inhibitor (100x)</td><td>ThermoFisher</td><td>78430</td><td>Caution. See manufactures MSDS</td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630 (NP-40)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>18896-50ML</td><td></td></tr><tr><td>MgCl 1 M</td><td>Invitrogen</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>Micrococcal Nuclease (MNase)</td><td>Worthington</td><td>LS004798</td><td></td></tr><tr><td>mouse embryonic stem cells&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9888-1KG</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Dual Index primers)</td><td>NEB</td><td>E7600S</td><td>amplification primers for sequencing libraries</td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II DNA library prep kit for Illumina</td><td>NEB</td><td>E7645L</td><td>sequencing library preparation kit&nbsp;</td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II Q5 Master mix&nbsp;</td><td>NEB</td><td>M0544S</td><td>Caution. See manufactures MSDS</td></tr><tr><td>Non-Essential Amino Acids Solution</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td>1x NEAA</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140148</td><td>1% Pen-Strep</td></tr><tr><td>Proteinase K (40 mg/ml)</td><td>GoldBio</td><td>P-480-1</td><td>Caution. See manufactures MSDS</td></tr><tr><td>QIAquick Gel extraction kit</td><td>QIAgen</td><td>28706</td><td>refered to as: DNA gel elution kit&nbsp;</td></tr><tr><td>QIAquick PCR purification kit</td><td>QIAgen</td><td>28106</td><td>refered to as: commercial DNA purification kit&nbsp;</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td>high sensitivity DNA quantification instrument&nbsp;</td></tr><tr><td>Quick load purple 1kb plus DNA Ladder</td><td>NEB</td><td>N0550S</td><td></td></tr><tr><td>SPRIselect size selection beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>B23319</td><td>paramagnetic beads&nbsp;</td></tr><tr><td>ThermoMixer C</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>5382000015</td><td>refered to as: thermomixer</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Merck</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7949-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure 10% SDS</td><td>Invitrogen</td><td>15553-035</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure Phenol Chloroform Isoamyl Alcohol (PCI)</td><td>Invitrogen</td><td>15593-031</td><td></td></tr><tr><td>Fragment Analyzer</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

3d-genoominteracties van zoogdieren in kaart brengen met micro-c-xl

Mapping Mammalian 3D Genome Interactions with Micro-C-XL

Driedimensionale (3D) chromosoomorganisatie is een belangrijke factor in genoomregulatie en celtypespecificatie. Er wordt bijvoorbeeld gedacht dat cis-regulerende elementen, bekend als enhancers, de activiteit van distale promotors reguleren via interactie in de 3D-ruimte. Genoomwijde chromosoomconformatie capture (3C)-technologieën, zoals Hi-C, hebben ons begrip van hoe genomen in cellen zijn georganiseerd getransformeerd. Het huidige begrip van de organisatie van het 3D-genoom wordt beperkt door de resolutie waarmee de topologische organisatie van chromosomen in de 3D-ruimte kan worden opgelost. Micro-C-XL meet chromosoomvouwing met resolutie op het niveau van het nucleosoom, de basiseenheid van chromatine, door gebruik te maken van microkokkennuclease (MNase) om genomen te fragmenteren tijdens het protocol voor het vastleggen van chromosoomconformatie. Dit resulteert in een verbeterde signaal-ruisverhouding in de metingen, waardoor de detectie van isolatieplaatsen en chromosoomlussen beter kan worden gedetecteerd in vergelijking met andere genoombrede 3D-technologieën. In dit artikel wordt een visueel ondersteund, gedetailleerd, stapsgewijs protocol gepresenteerd voor het bereiden van hoogwaardige Micro-C-XL-monsters uit zoogdiercellen.

De succesvolle voorbereiding van Micro-C-bibliotheken kan in verschillende stappen van het protocol worden geëvalueerd. De belangrijkste stap is de keuze van een goede MNase-verteringsgraad. Daarom moet de MNase-concentratie worden getitreerd om consistent 70%-90% mononucleosomen te verkrijgen ten opzichte van di-nucleosomen voor elk monster. Het is belangrijk op te merken dat de vertering van chromatine verschillend is voor eu- en heterochromatine, waarbij MNase heterochromatine minder efficiënt verteert. De optimale verteringsgraad hangt dus af van het interessegebied van het chromatine en het bestudeerde celtype, aangezien het relatieve aandeel van eu- en heterochromatine celtypespecifiek is. Daarom is het raadzaam om de vereiste MNase-concentratie zorgvuldig te titreren en eerst het succes van het Micro-C-experiment te evalueren door middel van low-input sequencing.
Een typisch MNase-titratiepatroon van chromatine behandeld met afnemende hoeveelheden MNase wordt weergegeven in figuur 1A. Hier wordt chromatine van 250.000 cellen per reactie verteerd met een viervoudige verdunning van MNase. De hoogste concentratie (10 U van MNase, Lane 2) vertoont oververteerd chromatine dat bijna uitsluitend bestaat uit mononucleosomaal DNA (~150 bp). Met name het midden van de mono-nucleosomale band loopt lager in de agarosegel in vergelijking met de overeenkomstige banden in de monsters met verlaagde MNase-concentraties, wat wijst op een oververtering van nucleosomaal DNA. Oververteerde nucleosomen worden inefficiënt geligeerd in de nabijheidsligatiereactie; daarom is het monster in baan 2 suboptimaal voor Micro-C-experimenten. Baan 3 (2,5 U van MNase) vertoont een bijna geschikte verteringsgraad voor Micro-C-experimenten. Hier is de mononucleosomale band de dominante soort en is het subnucleosomale uitstrijkje, indicatief voor oververteerde nucleosomen, verminderd; Het is echter nog steeds aanwezig. De verteringsgraad in baan 4 (0,635 U van MNase) is een ideale conditie voor een Micro-C-experiment in dit titratievoorbeeld. Er is een duidelijke mono-nucleosomale band zonder subnucleosomaal DNA aanwezig. De bandintensiteit voor het mono- en dinucleosoom-DNA is bijna gelijk, wat wijst op een mono-nucleosoomopbrengst van 66% of hoger. Het is vermeldenswaard dat het di-nucleosomale DNA ongeveer twee keer zo groot is als het mono-nucleosomale DNA (~320 bp vs. ~150 bp), dus de bandintensiteit per mol DNA is twee keer zo hoog in vergelijking met zijn mono-nucleosomale tegenhanger. De verteringsgraad in baan 5 (0,156 U van MNase) toont onderverteerd chromatine met bijna geen nucleosomaal DNA, en dit vertegenwoordigt daarom een suboptimaal monster.
Concluderend biedt in dit voorbeeld de vertering van 2,5 x 105 ES-cellen van muizen met 0,625 U MNase (overeenkomend met 2,5 U MNase voor 1 x 106 cellen in 200 μL) het meest veelbelovende startpunt voor preparatieve digesties in Micro-C-experimenten. Er moet echter ook rekening worden gehouden met een intermediaire MNaseconcentratie tussen de omstandigheden die worden gebruikt voor de monsters in baan 3 en baan 4 (overeenkomend met 5 U MNase voor 1 x 106 cellen in 200 μl). Belangrijk is dat chromatine-digestie met MNase niet lineair kan worden geschaald en dat het niet wordt aanbevolen om de preparatieve digestie meer dan 4x op te schalen. Om Micro-C-bibliotheken van meer dan 1 x 10 6 cellen te bereiden, is het raadzaam om het chromatine te verteren in aliquots van 1 x 106 cellen en deze samen te voegen na MNase-inactivering.
Om het succes van het proximity-ligatieprotocol te beoordelen, moet de inputcontrole, die MNase-verteerd is en niet proximity-ligated (stap 3.8), worden vergeleken met het proximity-ligated monster (stap 5.3) door 1,5% agarosegelelektroforese (Figuur 1B). De proximity-ligated mono-nucleosoomband heeft een geschatte grootte van 300 bp, vergelijkbaar met die van di-nucleosomen. Daarom moet de signaalverhouding tussen de mono- en dinucleosomale band verschuiven van overwegend mononucleosomen (baan 1) naar dinucleosomen (baan 3 en baan 4). Aangezien de agarosegel in deze stap het dinucleosomaal DNA is dat wordt weggesneden en gezuiverd, is het raadzaam om de monsters in meerdere banen te splitsen om overbelasting te voorkomen.
Het wordt aanbevolen om de kwaliteit en kwantiteit van de voorbereide sequencingbibliotheek te beoordelen met minimale PCR. Hier wordt DNA van 1 μL kralen (1/20 van het totale monster) gedurende 16 cycli geamplificeerd in 10 μL PCR-reactie. De totale concentratie van de minimale PCR-bibliotheek varieert doorgaans van 50-500 ng na 16 PCR-cycli. In theorie komt dit overeen met een bibliotheek van 1-10 μg uit het resterende monster van 19 μL als het ook gedurende 16 cycli zou worden geamplificeerd. Het wordt aanbevolen om het minimale aantal PCR-cycli te gebruiken dat nodig is om een bibliotheek van ongeveer 100 ng uit het totale DNA te genereren. Uitgaande van logaritmische amplificatie in de PCR, kan de theoretische concentratie van het DNA verkregen uit de invoer van 19 μL na 16 cycli achtereenvolgens door twee worden gedeeld om het aantal PCR-cycli te berekenen dat nodig is om een bibliotheek van 100 ng te genereren. Een opbrengst van 100 ng van 1 μL na 16 cycli komt bijvoorbeeld overeen met een opbrengst van 1.900 ng versterkt van 19 μL. In dit scenario zouden 12 cycli idealiter een sequentiebibliotheek van 118 ng moeten genereren uit het totale DNA (1.900 ng/[2 × 2 × 2 × 2] = 118 ng). Het resterende monster van 9 μL van de minimale PCR kan vervolgens worden gebruikt om de kwaliteit van de bibliotheek te beoordelen door middel van agarosegelelektroforese (Figuur 1C). Visualisatie moet één afzonderlijke band tonen bij 420 bp en geen banden voor adapterdimeren (120 bp). Er kunnen ook kleinere fragmenten verschijnen, en deze komen overeen met ongebruikte PCR-primers.
Vervolgens wordt aanbevolen om succesvolle Micro-C-monstervoorbereiding te analyseren en te bevestigen door middel van low-input sequencing voordat u zich vastlegt op resource-intensieve diepe sequencing. Doorgaans worden bibliotheken gesequenced op een leesdiepte van 5 x 106 tot 1 x 107 en geëvalueerd op basis van de volgende criteria: de sequencing read duplication rate, de cis- versus trans-chromosomale interactiesnelheid en de sequencing read orientation frequency. De Micro-C-bibliotheken worden verwerkt met Distiller, een full-service pijplijn die de gegevens verwerkt van sequencing van leesbestanden (Fastq-formaat) tot leesparenbestanden (Bedpe-formaat) en schaalbare interactiematrices (Cool- en Mcool-formaten) met behulp van cooler, pairtools en cooltools10,11,12. De pijplijn genereert ook een overzichtsbestand dat ideaal is voor het beoordelen van de kwaliteit van de Micro-C-bibliotheken10 (https://github.com/open2c/distiller-nf). De PCR-duplicatiesnelheid geeft informatie over de complexiteit van de sequencingbibliotheek en kan worden geëxtraheerd uit het gegenereerde *.stats-bestand. Micro-C-bibliotheken van hoge kwaliteit hebben minder dan 5%-10% PCR-duplicatiepercentages wanneer ze worden gegenereerd uit 5 miljoen of meer cellen. Met name sommige sequencingplatforms genereren PCR-duplicaten tijdens clustervorming, onafhankelijk van de complexiteit van de sequencingbibliotheek. Figuur 2A toont de relatieve duplicatiepercentages van twee experimenten: een die we als een goede steekproef beschouwen en een slechte steekproef. In dit voorbeeld gaven beide steekproeven acceptabele kaartsnelheden weer. De volgende criteria om de kwaliteit van Micro-C-bibliotheken te beoordelen, zijn de cis- versus trans-verhouding en de leesoriëntatiefrequenties. Binnen de kern bewonen chromosomen individuele chromosomengebieden en hebben ze dus zelden interactie met andere chromosomen. Een hoog percentage gedetecteerde transchromosomale interacties duidt op een hoog percentage willekeurige ligaties. Opgemerkt moet worden dat op dit analyseniveau het slechte monster een hoog percentage transchromosomale interacties vertoonde in vergelijking met het goede monster (figuur 2B). Voor Micro-C is een cis-chromosomale interactiesnelheid van 70% of hoger wenselijk.
Een Micro-C-bibliotheek heeft een fragmentgrootte die vergelijkbaar is met de di-nucleosomale DNA-band, die samen met het nabijheidsgeligeerde monster kan zuiveren en het experiment kan besmetten. Deze verontreinigingen zijn altijd cis-chromosomale interacties. Daarom is het belangrijk om ook de leesoriëntatiepercentages te evalueren. De snelheid van dinucleosomale besmetting kan worden geschat door sequencing met een lage input. Dinucleosomaal DNA stamt af van twee naburige nucleosomen die niet door MNase zijn gesplitst. De resulterende sequencing-lezingen zullen dus altijd een voorwaarts-achterwaartse leesoriëntatie (F en R) weergeven en de afstand tussen de leesparen zal ongeveer 320 bp zijn. Proximity-geligeerde fragmenten kunnen daarentegen in vier oriëntaties worden geligeerd, wat leesparen oplevert met F-R, R-R, R-F en F-F, idealiter met gelijke abundantie (Figuur 2C). Bovendien geven ze verschillende afstanden weer tussen de twee leesparen. Om de hoeveelheid dinucleosomale verontreinigingen te schatten, kan de frequentie van leesoriëntaties worden berekend aan de hand van de *stats-bestanden die door de distilleerder worden gegenereerd (Figuur 2D). Met name in dit werk was de fractie van F-R-aflezingen (rood) hoger in de slechte steekproef in vergelijking met de goede steekproef, en dit werd duidelijker toen de leesoriëntaties werden gestratificeerd naar afstand (Figuur 2E). De F-R-fractie wordt gedomineerd door di-nucleosomale fragmenten in vergelijking met Micro-C-bibliotheken wanneer de leesparen worden gestratificeerd in aflezingen met afstanden <562 bp of ≥562 bp. Hier wordt de fractie van de metingen met een afstand <562 bp gedomineerd door F-R-metingen, terwijl de fractie met afstanden ≥562 bp een gelijkmatige verdeling vertoont tussen de vier mogelijke oriëntaties, wat aangeeft dat de globale oververtegenwoordiging van F-R-metingen voortkomt uit dinucleosomale verontreinigingen. De keuze van 562 bp als drempel voor subsetering wordt bepaald door de binning in het gegenereerde *stats-bestand. Hoewel dit niet nodig is voor deze kwaliteitscontrole, kan een meer gedefinieerde subset worden bereikt door de afstanden te extraheren uit het *pairs-bestand, dat ook door de distilleerder wordt gegenereerd. Het is belangrijk op te merken dat dinucleosomale metingen de kwaliteit van het Micro-C-monster niet verminderen, omdat ze tijdens de gegevensverwerking kunnen worden geïdentificeerd en genegeerd. Ze bevatten echter geen waardevolle informatie over 3D-interacties en ze verdunnen de informatieve lezingen.
Zorgvuldige MNase-titratie en grondige kwaliteitscontrole met low-input sequencing zijn dus de beste hulpmiddelen om de kwaliteit van Micro-C-experimenten te optimaliseren.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64579/64579fig01.jpg"> Figuur 1: Tussenstadia van het Micro-C protocol . (A) Agarosegelelektroforese van chromatine uit 2,5 x 105 ES-cellen van muizen verteerd met variërende MNase-concentraties. De mono-, di- en tri-nucleosomale banden worden aangegeven met pijlen. M: DNA-ladder (baan 1/6); 10 U MNase per 250.000 cellen (baan 2); 2,5 U MNase per 250.000 cellen (baan 3); 0,625 U MNase per 250.000 cellen (baan 4); 0,156 U MNase per 250.000 cellen (Lane 2). (B) De 1,0% agarosegelelektroforese van de Micro-C geprepareerde monsters (Lane 3 en Lane 4) en de MNase verteerde inputcontrole (Lane 1). Baan 1 en Baan 2 (M: DNA-ladder) zijn verbeterd om de relatieve verandering in de intensiteit van mono- tot dinucleosomale fragmenten te benadrukken. De mono- en dinucleosomale banden worden aangegeven met pijlen. De di-nucleosomale band in het nabijheidsgebonden monster combineert di-nucleosomaal en Micro-C-bibliotheek-DNA. (C) De 1,0% agarosegelelektroforese van de Micro-C-sequencingbibliotheken versterkt uit een monster van 1 μL om de kwaliteit te evalueren. Baan 1 (M): DNA-ladder; Baan 2 (S): Mirco-C bibliotheek. (D) Fragment Analyzer-spoor van de uiteindelijke Micro-C-bibliotheek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64579/64579fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64579/64579fig02.jpg"> Figuur 2: Steekproefstatistieken voor de low-input sequencing van een goede en een slechte steekproef . (A) Staafdiagram van het percentage in kaart gebrachte (groen) en niet-toegewezen (rood) afleest. (B) Genormaliseerde fractie van reads die cis- en transchromosomale interacties in kaart brengen. De datasets werden genormaliseerd naar de cis-mapping read. De cis-mapping-metingen werden gestratificeerd op basis van de afstand tussen de eerste en de tweede lezing van de gepaarde sequentiemonsters: ≤1 kbp (geel), >1 kbp en ≤10 kbp (oranje) en >10 kbp (rood). (C) Schema van de potentiële molecuulsoorten met de dinucleosomale groottes. (D) Percentages van leespaaroriëntaties van alle aflezingen van de goede en de slechte steekproef. (E) Zelfde als paneel (D) maar gestratificeerd naar afstanden (links, <562 bp en rechts, ≥562 bp). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64579/64579fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Onderdelen</td>
			<td>1x</td>
			<td>4,4 keer</td>
		</tr><tr><td>10x NEBuffer 2.1,</td>
			<td>10 μL</td>
			<td>44 μL</td>
		</tr><tr><td>2 μL 100 mM ATP</td>
			<td>2 μL</td>
			<td>8,8 μL</td>
		</tr><tr><td>100 mM DTT</td>
			<td>5 μL</td>
			<td>22 μL</td>
		</tr><tr><td>H2O</td>
			<td>68 μL</td>
			<td>299,2 μL</td>
		</tr><tr><td>10 E/μL T4 PNK</td>
			<td>5 μL</td>
			<td>22 μL</td>
		</tr><tr><td>Totaal</td>
			<td>90 μL</td>
			<td>396 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 1: Micro-C mastermix 1. Samenstelling van de mastermix voor de eindkauwreactie.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Onderdelen</td>
			<td>1x</td>
			<td>4,4 keer</td>
		</tr><tr><td>1 mM Biotine-dATP</td>
			<td>10 μL</td>
			<td>44 μL</td>
		</tr><tr><td>1 mM Biotine-dCTP</td>
			<td>10 μL</td>
			<td>44 μL</td>
		</tr><tr><td>10 mM mix van dTTP en dGTP</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>4,4 μL</td>
		</tr><tr><td>10x T4 DNA Ligase Buffer</td>
			<td>5 μL</td>
			<td>22 μL</td>
		</tr><tr><td>200x BSA</td>
			<td>0,25 μL</td>
			<td>1,1 μL</td>
		</tr><tr><td>H2O</td>
			<td>23,75 μL</td>
			<td>104,5 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 2: Micro-C mastermix 2. Samenstelling van de mastermix voor de eindetiketteringsreactie.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Onderdelen</td>
			<td>1x</td>
			<td>4,4 keer</td>
		</tr><tr><td>10x NEB T4 Ligase reactiebuffer</td>
			<td>50 μL</td>
			<td>220 μL</td>
		</tr><tr><td>H2O</td>
			<td>422,5 μL</td>
			<td>1859 μL</td>
		</tr><tr><td>T4 DNA-ligase</td>
			<td>25 μL</td>
			<td>110μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 3: Micro-C mastermix 3. Samenstelling van de mastermix voor de nabijheidsligatiereactie.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Onderdelen</td>
			<td>1x</td>
			<td>4,4 keer</td>
		</tr><tr><td>10x NEBuffer 1.1</td>
			<td>20 μL</td>
			<td>88 μL</td>
		</tr><tr><td>H2O</td>
			<td>180 μL</td>
			<td>792 μL</td>
		</tr><tr><td>ExoIII-nuclease</td>
			<td>10 μL</td>
			<td>44 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 4: Micro-C mastermix 4. Samenstelling van het mastermengsel voor de biotineverwijderingsreactie.

Een protocol voor het in kaart brengen van de driedimensionale genoomorganisatie met nucleosoomresolutie met behulp van de genoomwijde chromosoomconformatie-capture-methode Micro-C-XL wordt hier gepresenteerd.

3D-genoominteracties van zoogdieren in kaart brengen met Micro-C-XL

Three-dimensional (3D) chromosome organization is a major factor in genome regulation and cell-type specification. For example, cis-regulatory elements, ...

Dit protocol is belangrijk omdat het chromosoomlussen met een hoge resolutie en andere interactiekenmerken op korte afstand laat zien. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is het in kaart brengen van de 3D-genoomorganisatie met nucleosoomresolutie met een hoge signaal-ruisverhouding. Om de MNase-titratie uit te voeren, ontdooit u een pellet van één keer 10 tot de zesde cellen gedurende 10 minuten op ijs, en resuspendeert u de cellen in 500 microliter DPBS en incubeert u de celsuspensie gedurende 20 minuten op ijs.Verzamel de cellen door centrifugeren bij 10.000 G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur en verwijder het supernatant. Resuspendeer de gepelleteerde cellen in 500 microliter MB Number one buffer. Ontdooi een injectieflacon van 20 eenheden per microliter MNase en verdun deze met 10 millimolair Tris voor de verteringsomstandigheden zoals beschreven in de tekst.Voeg met de juiste tijdsintervallen van 10 tot 20 seconden een microliter van de eerste MNase-digestieoplossing toe aan een van de vier monsterbuizen, vortex en incubeer in een ThermoMixer bij 37 graden Celsius gedurende 10 minuten bij 800 RPM. Ga door met het toevoegen van één microliter van de resterende MNase-verdunningen aan de andere celaliquots. Stop de MNase-vertering door 200 microliter vers bereide stopbuffer toe te voegen aan elke buis in dezelfde volgorde en hetzelfde tijdsinterval waarin de MNase is toegevoegd.Incubeer gedurende twee uur bij 65 graden Celsius. Voeg 500 microliter PCI toe aan elk monster en meng grondig door vortexen. Centrifugeer bij 19.800 G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur om de fasen te scheiden.En breng de waterige fase over naar nieuwe buizen. Zuiver het DNA met behulp van een in de handel verkrijgbare DNA-zuiveringskit volgens de instructies van de fabrikant en eluer de monsters in 12 microliter elutiebuffer. Voeg twee tot vijf microliter laadkleurstof toe aan het gezuiverde DNA-monster.Voer de monsters uit op een 1,5%agarose-gel en kies de beste mate van vertering voor het experiment. Een optimale verteringsgraad vertoont weinig tot geen subnucleosomale fragmenten en een verhouding van 70 tot 90% mono tot dinucleosoom. In deze representatieve steekproef werd een intermediaire verteringsgraad tussen de drie en vier banen geselecteerd voor vervolgexperimenten.Op basis van de MNase-titratie verteert u het chromatine door de juiste hoeveelheid MNase toe te voegen aan elk monsteraliquot. Meng goed en incubeer in de ThermoMixer op 37 graden Celsius, 800 RPM gedurende 10 minuten. Stop de MNase-vergisting door 1,6 microliter 0,5 molaire EGTA toe te voegen aan elk aliquot en incubeer gedurende 10 minuten in een ThermoMixer bij 65 graden Celsius met 800 RPM schudden.Verzamel het monster door centrifugeren bij 10.000 g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur en gooi het supernatant weg. Resuspendeer de celpellet in 500 microliter 1X NEB-buffer 2.1. Poolmonsters die overeenkomen met een invoer van vijf keer 10 naar de zesde cel of minder voor verdere verwerking.Voordat u overgaat tot de nabijheidsligatie, moet u 10% van het monster overbrengen als invoercontrole om het MNase-verteringsniveau te controleren. Voeg 150 microliter 10 millimolaire Tris, 25 microliter 10%SDS en 25 microliter 20 milligram per milliliter proteïnase K toe aan de spijsverteringscontrole en incubeer een nacht bij 65 graden Celsius. Verzamel het resterende monster door centrifugeren bij 10.000 G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius en gooi het supernatant weg.Resuspendeer de pellet in 90 microliter vers bereide Micro-C master mix één, en incubeer in een ThermoMixer op 37 graden Celsius, 800 RPM gedurende 15 minuten. Voeg 10 microliter van vijf eenheden per microliter Klenow-fragment toe en incubeer in een ThermoMixer. Voeg vervolgens 100 microliter vers bereide Micro-C mastermix twee toe.Incubeer gedurende 45 minuten bij 25 graden Celsius, 800 RPM, en blus de enzymatische reactie met EDTA zoals beschreven in de tekst. Incubeer in een Thermo Mixer gedurende 20 minuten op 65 graden Celsius, 800 RPM. Verzamel het monster door centrifugeren bij 10.000 G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius en gooi het supernatant weg.Resuspendeer het monster in 500 microliter vers bereide Micro-C master mix drie en incubeer gedurende 2,5 uur bij kamertemperatuur bij 15 tot 20 RPM. Herhaal het centrifugeren en verwijder het supernatant. Resuspendeer het monster vervolgens in 200 microliter vers bereide Micro-C master mix four, en incubeer in een ThermoMixer ingesteld op 37 graden Celsius gedurende 15 minuten bij 800 RPM.Voeg voor omgekeerde verknoping en deproteïnenatie 25 microliter van 20 milligram per microliter proteïnase K en 25 microliter 10% SDS toe aan het monster, en incubeer 's nachts bij 65 graden Celsius met intermitterend mengen. Voeg 500 microliter PCI toe aan de monsters en invoerregeling en meng vervolgens door middel van vortexen. Scheid de fasen door centrifugeren bij 19.800 G gedurende vijf minuten en breng de bovenste waterige fase over in een nieuwe buis.Concentreer het DNA en elute de monsters in 30 microliter en de invoercontroles in 15 microliter. Voer een 1,5%agarose-gel uit om de mononucleosomen en dinucleosomen te scheiden. Snijd de DNA-fragmenten met een dinucleosomale grootte weg en extraheer het DNA zoals beschreven in de tekst.Voeg 150 microliter vooraf voorbereide kralen toe aan 150 microliter van het monster en incubeer bij kamertemperatuur. Plaats de buisjes in een geschikte magneet en wacht tot de oplossing helder is. Verwijder het supernatans en suspendeer de korrels in 300 microliter 1X TBW, en herhaal deze stap.Herhaal de magnetische scheiding en nadat de oplossing is verdwenen, verwijdert u het supernatans en resuspendeert u de kralen in 100 microliter 0.1X TE. Herhaal en resuspendeer in 50 microliter 0,1X TE. Breng de oplossing over in PCR-buisjes en voer de DNA-manipulatie uit zoals beschreven in de tekst. Nadat de ligatie van de adapter is voltooid, wast u het monster in 1X TBW, gooit u het supernatans weg en resuspendeert u de korrels in 20 microliter 0.1X TE. Optimaliseer het aantal PCR-cycli en versterk de sequentiebibliotheken zoals beschreven in de tekst. Chromatine van 250.000 cellen per reactie werd verteerd met een viervoudige verdunning van MNase.De hoogste concentratie, 10 eenheden, vertoonde oververteerd chromatine dat bijna uitsluitend uit mononucleosomaal DNA bestond. De vertering van 250.000 ES-cellen van muizen met 0,625 eenheden MNase bood het meest veelbelovende startpunt voor preparatieve vergistingen in Micro-C-experimenten. Er moet echter rekening worden gehouden met een intermediaire MNaseconcentratie tussen de omstandigheden in de banen drie en vier, die overeenkomt met vijf eenheden per 1 miljoen cellen.De nabijheidsgebonden mononucleosoomband had een geschatte grootte van 300 basenparen, vergelijkbaar met die van dinucleosomen. Daarom verschoof de signaalverhouding tussen de mono- en dinucleosomale band van overwegend mononucleosomen naar dinucleosomen. De kwaliteit en kwantiteit van de voorbereide sequencingbibliotheek werden beoordeeld via minimale PCR.Visualisatie toonde één duidelijke band bij 420 basenparen en geen banden voor adapterdimeren. Hoewel beide steekproeven in deze studie hoge kaartpercentages vertoonden, had de goede steekproef een hoger percentage cis-lezingen. Een hoge mate van transchromosomale interacties duidt op willekeurige ligatiegebeurtenissen, hoewel sommige transchromosomale interacties belangrijk kunnen zijn.Bovendien had de goede steekproef een gematigd aantal voorwaarts-achterwaartse kaartleesparen, met afstanden van minder dan 500 basenparen. Dit duidde op een laag aantal dinucleosomen die niet door MNase werden gesplitst en die een vergelijkbare grootte hadden als twee geligeerde nucleosomen in de nabijheid. Een goede MNase-verteringsgraad is cruciaal voor dit experiment.Oververteerde nucleosomen zijn inefficiënt geligeerd en onderverteerd chromatine heeft een groot deel van de onverteerde dinucleosomen die de sequentiebibliotheek kunnen besmetten. Micro-C kan worden gecombineerd met een capture-benadering om de locus-specifieke genoomorganisatie met een enorm hoge resolutie in kaart te brengen.

mapping-mammalian-3d-genome-interactions-with-micro-c-xl

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

De Hi-C methode maakt het mogelijk onpartijdige, genoom-brede identificatie van chromatine interacties (1). Hi-C paren nabijheid ligatie en massaal parallelle sequencing. De resulterende gegevens kunnen worden gebruikt om de genomische architectuur studeren op meerdere schalen: eerste resultaten geïdentificeerd functies zoals chromosoom gebieden, scheiding van open en gesloten chromatine, en chromatine structuur op de megabase schaal.

Hi-C: een methode om de driedimensionale architectuur van genoom-onderzoek.

De bijbehorende chromosoom val (ACT) assay is een nieuwe onpartijdige methode voor het identificeren van lange-afstands-DNA interacties. De karakterisering van de lange reeks DNA-interacties zal ons toelaten om de relatie van de nucleaire architectuur vast te stellen om genexpressie in zowel de normale fysiologie en in zieke staten.

Associated Chromosoom Trap voor het vaststellen van lange afstand DNA-interacties

We beschrijven een robuuste en veelzijdige protocol voor de analyse nucleaire architectuur door 3D DNA FISH met direct gelabelde fluorescerende probes.

Robuuste 3D DNA FISH behulp direct gemerkt Probes

Het identificeren van de directe doelstellingen van genoom-gerichte moleculen blijft een grote uitdaging. Om te begrijpen hoe DNA-bindende moleculen die aangrijpen op de genoom, ontwikkelden we een methode die is gebaseerd op de verknoping van kleine moleculen aan chromatine isoleren (COSMIC).

Genoombrede kartering van Drug-DNA interacties in cellen met kosmische (Crosslinking van kleine moleculen te isoleren chromatine)

Dit werk beschrijft een protocol voor het genereren van hoge resolutie in situ Hi-C bibliotheken van strak geënsceneerd pre gastrulatie Drosophila melanogaster embryo's.

Generatie van genoom-brede chromatine conformatie Capture bibliotheken uit strak geënsceneerde vroege Drosophila embryo 's

3D multicolor DNA FISH vertegenwoordigt een hulpmiddel om meerdere genomische loci binnen 3D bewaarde kernen te visualiseren, ondubbelzinnig definiëren d.m.v. hun wederzijdse interacties en lokalisatie binnen de nucleaire ruimte op één celniveau. Hier wordt een stap voor stap protocol beschreven voor een breed spectrum van menselijke primaire cellen.

3D Multicolor DNA FISH Tool om nucleaire architectuur in menselijke primaire cellen te bestuderen

Nauwkeurige bepaling van eiwitbindende locaties in het genoom is belangrijk voor het begrijpen van genregulatie. Hier beschrijven we een genomische mapping methode die chromatine-immunogeprecipiteerd DNA behandelt met exonucleasevertering (ChIP-exo) gevolgd door sequencing met hoge doorvoer. Deze methode detecteert eiwit-DNA interacties met near base-pair mapping resolutie en hoge signaal-ruisverhouding bij zoogdierneuronen.

Hoge resolutie mapping van eiwit-DNA interacties in muis stamcel-afgeleide neuronen met behulp van chromatine immunoprecipitation-exonuclease (ChIP-Exo)

Hi-C 3.0 is een verbeterd Hi-C protocol dat formaldehyde en disuccinimidylglutaraat crosslinkers combineert met een cocktail van DpnII en DdeI restrictie enzymen om de signaal-ruisverhouding en de resolutie van chromatine interactie detectie te verhogen.

Chromosoomconformatie vastleggen over lengteschalen

Dit protocol beschrijft de Capture Hi-C-methode die wordt gebruikt om de 3D-organisatie van megagebaseerde gerichte genomische regio's met hoge resolutie te karakteriseren, inclusief grenzen van topologisch associërende domeinen (TAD's) en chromatine-interacties op lange afstand tussen regulerende en andere DNA-sequentie-elementen.

Ontcijferen van 3D-chromatineorganisatie met hoge resolutie via Capture Hi-C

Hier presenteren we een aanpassing van de chromosoomconformatie-capture (3C) -techniek in detail met de nadruk op betrokkenheid en leren van niet-gegradueerden.

Een A krijgen met de 3C's: chromosoomconformatie-opname voor studenten

Genexpressie wordt gereguleerd door interacties van genpromotors met distale regulerende elementen. Hier beschrijven we hoe low input Capture Hi-C (liCHi-C) de identificatie van deze interacties in zeldzame celtypen mogelijk maakt, die voorheen niet meetbaar waren.

Een geïntegreerde workflow om de promotor-centrische spatio-temporele genoomarchitectuur in schaarse celpopulaties te bestuderen

Leer Micro-C-XL voor het in kaart brengen van 3D-genoomorganisatie in zoogdiercellen met nucleosoomresolutie. Deze methode biedt een hoog signaal-ruisverhouding voor nauwkeurige chromatine-interacties.

3D-genoominteracties van zoogdieren in kaart brengen met Micro-C-XL

Meer video's verkennen