3D-genoominteracties van zoogdieren in kaart brengen met Micro-C-XL

Dit protocol is belangrijk omdat het chromosoomlussen met een hoge resolutie en andere interactiekenmerken op korte afstand laat zien. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is het in kaart brengen van de 3D-genoomorganisatie met nucleosoomresolutie met een hoge signaal-ruisverhouding. Om de MNase-titratie uit te voeren, ontdooit u een pellet van één keer 10 tot de zesde cellen gedurende 10 minuten op ijs, en resuspendeert u de cellen in 500 microliter DPBS en incubeert u de celsuspensie gedurende 20 minuten op ijs.

Verzamel de cellen door centrifugeren bij 10.000 G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur en verwijder het supernatant. Resuspendeer de gepelleteerde cellen in 500 microliter MB Number one buffer. Ontdooi een injectieflacon van 20 eenheden per microliter MNase en verdun deze met 10 millimolair Tris voor de verteringsomstandigheden zoals beschreven in de tekst.

Voeg met de juiste tijdsintervallen van 10 tot 20 seconden een microliter van de eerste MNase-digestieoplossing toe aan een van de vier monsterbuizen, vortex en incubeer in een ThermoMixer bij 37 graden Celsius gedurende 10 minuten bij 800 RPM. Ga door met het toevoegen van één microliter van de resterende MNase-verdunningen aan de andere celaliquots. Stop de MNase-vertering door 200 microliter vers bereide stopbuffer toe te voegen aan elke buis in dezelfde volgorde en hetzelfde tijdsinterval waarin de MNase is toegevoegd.

Incubeer gedurende twee uur bij 65 graden Celsius. Voeg 500 microliter PCI toe aan elk monster en meng grondig door vortexen. Centrifugeer bij 19.800 G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur om de fasen te scheiden.

En breng de waterige fase over naar nieuwe buizen. Zuiver het DNA met behulp van een in de handel verkrijgbare DNA-zuiveringskit volgens de instructies van de fabrikant en eluer de monsters in 12 microliter elutiebuffer. Voeg twee tot vijf microliter laadkleurstof toe aan het gezuiverde DNA-monster.

Voer de monsters uit op een 1,5%agarose-gel en kies de beste mate van vertering voor het experiment. Een optimale verteringsgraad vertoont weinig tot geen subnucleosomale fragmenten en een verhouding van 70 tot 90% mono tot dinucleosoom. In deze representatieve steekproef werd een intermediaire verteringsgraad tussen de drie en vier banen geselecteerd voor vervolgexperimenten.

Op basis van de MNase-titratie verteert u het chromatine door de juiste hoeveelheid MNase toe te voegen aan elk monsteraliquot. Meng goed en incubeer in de ThermoMixer op 37 graden Celsius, 800 RPM gedurende 10 minuten. Stop de MNase-vergisting door 1,6 microliter 0,5 molaire EGTA toe te voegen aan elk aliquot en incubeer gedurende 10 minuten in een ThermoMixer bij 65 graden Celsius met 800 RPM schudden.

Verzamel het monster door centrifugeren bij 10.000 g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur en gooi het supernatant weg. Resuspendeer de celpellet in 500 microliter 1X NEB-buffer 2.1. Poolmonsters die overeenkomen met een invoer van vijf keer 10 naar de zesde cel of minder voor verdere verwerking.

Voordat u overgaat tot de nabijheidsligatie, moet u 10% van het monster overbrengen als invoercontrole om het MNase-verteringsniveau te controleren. Voeg 150 microliter 10 millimolaire Tris, 25 microliter 10%SDS en 25 microliter 20 milligram per milliliter proteïnase K toe aan de spijsverteringscontrole en incubeer een nacht bij 65 graden Celsius. Verzamel het resterende monster door centrifugeren bij 10.000 G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius en gooi het supernatant weg.

Resuspendeer de pellet in 90 microliter vers bereide Micro-C master mix één, en incubeer in een ThermoMixer op 37 graden Celsius, 800 RPM gedurende 15 minuten. Voeg 10 microliter van vijf eenheden per microliter Klenow-fragment toe en incubeer in een ThermoMixer. Voeg vervolgens 100 microliter vers bereide Micro-C mastermix twee toe.

Incubeer gedurende 45 minuten bij 25 graden Celsius, 800 RPM, en blus de enzymatische reactie met EDTA zoals beschreven in de tekst. Incubeer in een Thermo Mixer gedurende 20 minuten op 65 graden Celsius, 800 RPM. Verzamel het monster door centrifugeren bij 10.000 G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius en gooi het supernatant weg.

Resuspendeer het monster in 500 microliter vers bereide Micro-C master mix drie en incubeer gedurende 2,5 uur bij kamertemperatuur bij 15 tot 20 RPM. Herhaal het centrifugeren en verwijder het supernatant. Resuspendeer het monster vervolgens in 200 microliter vers bereide Micro-C master mix four, en incubeer in een ThermoMixer ingesteld op 37 graden Celsius gedurende 15 minuten bij 800 RPM.

Voeg voor omgekeerde verknoping en deproteïnenatie 25 microliter van 20 milligram per microliter proteïnase K en 25 microliter 10% SDS toe aan het monster, en incubeer 's nachts bij 65 graden Celsius met intermitterend mengen. Voeg 500 microliter PCI toe aan de monsters en invoerregeling en meng vervolgens door middel van vortexen. Scheid de fasen door centrifugeren bij 19.800 G gedurende vijf minuten en breng de bovenste waterige fase over in een nieuwe buis.

Concentreer het DNA en elute de monsters in 30 microliter en de invoercontroles in 15 microliter. Voer een 1,5%agarose-gel uit om de mononucleosomen en dinucleosomen te scheiden. Snijd de DNA-fragmenten met een dinucleosomale grootte weg en extraheer het DNA zoals beschreven in de tekst.

Voeg 150 microliter vooraf voorbereide kralen toe aan 150 microliter van het monster en incubeer bij kamertemperatuur. Plaats de buisjes in een geschikte magneet en wacht tot de oplossing helder is. Verwijder het supernatans en suspendeer de korrels in 300 microliter 1X TBW, en herhaal deze stap.

Herhaal de magnetische scheiding en nadat de oplossing is verdwenen, verwijdert u het supernatans en resuspendeert u de kralen in 100 microliter 0.1X TE. Herhaal en resuspendeer in 50 microliter 0,1X TE. Breng de oplossing over in PCR-buisjes en voer de DNA-manipulatie uit zoals beschreven in de tekst. Nadat de ligatie van de adapter is voltooid, wast u het monster in 1X TBW, gooit u het supernatans weg en resuspendeert u de korrels in 20 microliter 0.1X TE. Optimaliseer het aantal PCR-cycli en versterk de sequentiebibliotheken zoals beschreven in de tekst. Chromatine van 250.000 cellen per reactie werd verteerd met een viervoudige verdunning van MNase.

De hoogste concentratie, 10 eenheden, vertoonde oververteerd chromatine dat bijna uitsluitend uit mononucleosomaal DNA bestond. De vertering van 250.000 ES-cellen van muizen met 0,625 eenheden MNase bood het meest veelbelovende startpunt voor preparatieve vergistingen in Micro-C-experimenten. Er moet echter rekening worden gehouden met een intermediaire MNaseconcentratie tussen de omstandigheden in de banen drie en vier, die overeenkomt met vijf eenheden per 1 miljoen cellen.

De nabijheidsgebonden mononucleosoomband had een geschatte grootte van 300 basenparen, vergelijkbaar met die van dinucleosomen. Daarom verschoof de signaalverhouding tussen de mono- en dinucleosomale band van overwegend mononucleosomen naar dinucleosomen. De kwaliteit en kwantiteit van de voorbereide sequencingbibliotheek werden beoordeeld via minimale PCR.

Visualisatie toonde één duidelijke band bij 420 basenparen en geen banden voor adapterdimeren. Hoewel beide steekproeven in deze studie hoge kaartpercentages vertoonden, had de goede steekproef een hoger percentage cis-lezingen. Een hoge mate van transchromosomale interacties duidt op willekeurige ligatiegebeurtenissen, hoewel sommige transchromosomale interacties belangrijk kunnen zijn.

Bovendien had de goede steekproef een gematigd aantal voorwaarts-achterwaartse kaartleesparen, met afstanden van minder dan 500 basenparen. Dit duidde op een laag aantal dinucleosomen die niet door MNase werden gesplitst en die een vergelijkbare grootte hadden als twee geligeerde nucleosomen in de nabijheid. Een goede MNase-verteringsgraad is cruciaal voor dit experiment.

Oververteerde nucleosomen zijn inefficiënt geligeerd en onderverteerd chromatine heeft een groot deel van de onverteerde dinucleosomen die de sequentiebibliotheek kunnen besmetten. Micro-C kan worden gecombineerd met een capture-benadering om de locus-specifieke genoomorganisatie met een enorm hoge resolutie in kaart te brengen.