Gebruik van time-lapse microscopie en stadiumspecifieke nucleaire uitputting van eiwitten om meiose in S. cerevisiae te bestuderen

Door cellen in profase één te synchroniseren en vervolgens het doeleiwit in een bepaald stadium uit te putten, kan deze methode tijdelijk verschillende functies van specifieke eiwitten identificeren. Voorwaardelijk uitputten van eiwitten in specifieke stadia van myose voorkomt de resterende effecten die een traditionele myotische mutant in latere stadia kan hebben. Deze methode kan worden gebruikt om ontluikende gistmitose en andere organismen te bestuderen die geen nucleaire enveloppe-afbraak ondergaan.

Bovendien kan deze methode in andere organismen worden gebruikt om celcyclusgebeurtenissen voorafgaand aan de afbraak van de nucleaire enveloppe te bestuderen. Maak om te beginnen een agarpad dat zal worden gebruikt om een monolaag van cellen te maken voor beeldvorming. Snijd de dop af en gooi de dop en bodem een derde van een 1,5 milliliter microcentrifugebuis om een cilinder te maken die als mal voor de agarpad zal dienen.

Plaats de gesneden microcentrifugebuiscilinder op een schone glazen glijbaan met de bovenkant van de buis ondersteboven, zittend op de glijbaan. Maak zes milliliter van een 5% agar-oplossing in een bekerglas van 50 milliliter. Snijd de punt van de pipet af om een grotere opening te maken en pipetteer ongeveer 500 microliter gesmolten agar in de microcentrifugebuis.

Laat het op kamertemperatuur zitten totdat de agar stolt. Om gistcellen te bereiden, spint u 200 microliter van de sporulatiecultuur op 800 G gedurende twee minuten in microcentrifugebuizen van één milliliter. Gooi 180 microliter van het supernatant weg.

Resuspendeer de pellet in het resterende supernatant door de buis te draaien en te bewegen. Pipetteer zes microliter van de geconcentreerde cellen op de afdekslip in het midden van de kamer ter plaatse met ConA. Houd de cilinder vast met de agarpad en schuif deze voorzichtig van de glazen schuif.

Zorg ervoor dat de agar aan de onderkant volledig plat is en oefen met behulp van de onderkant van de pipetpunt een lichte hoeveelheid druk uit op de microcentrifugevorm, zodat de agarpad iets boven de grens van de buis wordt geduwd. Keer vervolgens de mal zodanig om dat het agarpad naar beneden naar de kamer is gericht. Gebruik een tang om het agar-pad voorzichtig bovenop de cellen en de pipetpunt te plaatsen om het agar-pad 10 tot 20 keer voorzichtig rond de kamer te schuiven om een monolaag van cellen op de afdekslip te creëren.

Houd het agarkussen 12 tot 15 minuten in de kamer. Breng vervolgens twee milliliter sporulatiecultuur over naar twee microcentrifugebuizen en draai gedurende twee minuten op 15.700 G. Nadat u het supernatant in schone microcentrifugebuizen hebt overgebracht, draait u opnieuw in dezelfde toestand en verzamelt u het supernatant om microcentrifugebuizen te reinigen.

Voeg twee milliliter van het supernatant druppelsgewijs toe aan de kamer met daarin het agarkussen. Zodra de vloeistof de bovenkant van de kamer heeft bereikt, zal de agarpad hoogstwaarschijnlijk drijven. Verwijder het agarkussen voorzichtig met een tang en gooi het weg.

Plaats een afdekslip van 24 bij 50 millimeter op de bovenkant van de kamer om verdamping tijdens de beeldvorming te voorkomen. Om de film op de microscoop te plaatsen, plaatst u de afdeksel in de schuifhouder. Bevestig de vormklei aan de zijkant van de afdekslip om deze veilig in de schuifhouder te houden.

Open de software voor het verkrijgen van afbeeldingen. Gebruik grove en fijne instelknoppen om de cellen scherp te stellen met behulp van DIC of helder veld. Klik in het hoofdmenu van de software voor het verwerven van afbeeldingen op Bestand, selecteer Verwerven en er verschijnen vier vensters.

Klik in het venster resolve 3D op het erlenmeyerpictogram. Hiermee wordt een venster geopend met de titel Experiment uitvoeren ontwerpen, dat de besturingselementen bevat voor het instellen van een experiment om een time-lapse-film in te stellen. Ga op het tabblad Ontwerp naar het tabblad Secties.

Selecteer het vakje naast Z-sectie en stel de optische sectieafstand in op één micrometer en het aantal optische secties op vijf. Klik vervolgens op het tabblad Kanalen op het pluspictogram en selecteer het juiste kanaal. Selecteer vervolgens het vakje naast Referentieafbeelding en stel de Z-positie in op het midden van het voorbeeld in het vervolgkeuzemenu.

Selecteer een waarde van transmissie en belichtingstijd in het vervolgkeuzemenu. Schakel op het tabblad Time-lapse het selectievakje naast Time-lapse in en voer waarden voor minuten en uren in om het tijdsinterval van beeldacquisitie te identificeren. Schakel het selectievakje naast Focus behouden met ultieme focus in om fasedrift tijdens de film te voorkomen.

En selecteer op het tabblad Punten het vakje naast Lijst met toegangspunten bezoeken. Klik in het hoofdmenu op Beeld en selecteer Puntenlijst. Verplaats het werkgebied naar een gebied van de kamer dat een monolaag van cellen toont.

Klik op Punt markeren in het venster Puntenlijst. Verplaats het werkgebied om 25 tot 30 punten te selecteren zonder enige overlap om te voorkomen dat de cellen overbelichten en elk veld tijdens elke tijdcursus afbeeldt. Selecteer in het venster Puntenlijst de optie Alles kalibreren om de uiteindelijke focus voor elk punt in te stellen.

Sla het bestand op het tabblad Uitvoeren op de juiste bestemming op de computer op. Selecteer in het venster Experiment uitvoeren de knop Afspelen om de film te starten. Open de Fiji-software.

Open de kanalen DIC en mCherry. Verkrijg een enkele maximale intensiteitsprojectie van het mCherry-kanaal door op Afbeelding te klikken, gevolgd door Stacks en Z Project en selecteer Maximale intensiteit in het vervolgkeuzemenu. Als u de DIC- en mCherry-kanalen in één afbeelding wilt samenvoegen, klikt u op Afbeelding, Kleur en selecteert u Kanalen samenvoegen.

Volg een enkele cel door meiose. Noteer na de voltooiing van meiose II het aantal DNA-massa's. In wildtype cellen met de ankerachtergrond zijn er meestal vier DNA-massa's aan het einde van meiose II, die de vier producten van meiose vertegenwoordigen.

In een klein deel van de cellen zijn slechts drie massa's zichtbaar na meiose II.Wanneer Ctf19-FRB is verankerd op het moment van afgifte van profase I, vertoont ongeveer 47% van de cellen meer dan vier DNA-massa's na voltooiing van meiose, wat wijst op een defect in de aanhechting van kinetochoren en microtubuli. Met verankering van Ctf19-FRB, hetzij na kinetochore assemblage maar vóór meiose I, of na meiose II, vertoont ongeveer 16% van de cellen extra DNA-massa's. Een van de belangrijkste onderdelen van dit protocol is om het supernatant druppelsgewijs aan je kamer toe te voegen om te voorkomen dat je monolaag wordt verstoord.

Noteer bovendien de tijd die nodig is om u voor te bereiden op beeldvorming om het in uw analyse te overwegen. Door fluorescerend verpakte eiwitten te veranderen, kan deze procedure worden gebruikt om de vragen te beantwoorden over de duur van de celcyclus, chromosoomsegregatie, eiwitrijkdom en eiwitlokalisatie.