Differentiatie en beeldvorming van bruine vetcellen uit de stromale vasculaire fractie van interscapulier vetweefsel van pasgeboren muizen

Dit protocol maakt de efficiënte en reproduceerbare differentiatie mogelijk van bruine vetocyten die belangrijke adipogene transcriptiefactoren, rijpe adipocytmarkers tot expressie brengen en thermogeen potentieel en morfologisch fenotype van rijpe bruine vetcellen hebben. Dit is een eenvoudige en reproduceerbare differentiatieprocedure in twee fasen om cellen met kenmerken van rijpe bruine adipocyten te verkrijgen uit interscapulier bruin vetweefsel van pasgeboren muizen. Dit protocol maakt het mogelijk om de activeringsmechanismen van bruin vetweefsel te bestuderen als doelwit voor de behandeling van obesitas.

Het is een model geweest voor het bepalen van de mechanismen die betrokken zijn bij de pathofysiologie van lipodystrofie. Het zal naar verwachting een uitdaging zijn om deze techniek voor de eerste keer uit te voeren. Het is essentieel om een gedetailleerd protocol te hebben en kritieke punten te benadrukken om succesvolle resultaten te hebben.

Plaats om te beginnen de geëuthanaseerde muis in buikligging en maak met een scherpe schaar een centimeter lange huidincisie in het midden van de rug van het dier. Verwijder de huid voorzichtig, maak de iBAT operatief los van het karkas met een kleine schaar. Oogst beide iBAT-lobben met een tang met kromme punt om de lobben onafhankelijk van elkaar te verwijderen.

Plaats de twee lobben in een plastic buis met 1,5 milliliter steriele PBS op kamertemperatuur. Incubeer de iBAT-weefsels in collagenase type twee spijsverteringsbuffer gedurende 45 minuten bij 37 graden Celsius met continu zacht schudden bij 800 RPM. Verstoor de weefselsuspensie in de digestiebuffer van collagenase type twee mechanisch door op en neer te pipetteren met behulp van een P1000-micropipet en filtertips.

Gebruik voor elk monster een nieuwe tip. Leid de gedesegregeerde weefsels door individuele celzeven van 100 micrometer in nieuwe buizen van 1,5 milliliter. Voeg 500 microliter ACK-buffer toe aan de gefilterde weefselmonsters.

Keer de buisjes vier tot vijf keer om en incubeer ze vier minuten bij kamertemperatuur. Leid de suspensies vervolgens door een celzeef van 40 micrometer in nieuwe buisjes van 1,5 milliliter met behulp van een P1000-micropipet en gefilterde tips. Centrifusion resuspendeert de pellet zoals beschreven in het tekstmanuscript.

Zaai vervolgens elk monster in zes putjes van een kweekplaat met 24 putjes door aan elk putje één milliliter van de suspensie toe te voegen. De ongedifferentieerde preadipocyten vertoonden zeer lage of niet-detecteerbare niveaus van ppar-gamma, C/ebp-alfa, perilipine 1 en CD36. Daarentegen waren deze markers significant hoger op dag zeven van de differentiatie.

De accumulatie van meerdere lipidedruppeltjes in de bruine preadipocyten kwam overeen met de eerder gepubliceerde resultaten. Er werd een significante toename waargenomen in de mitochondriale massamarker TOM 20 en de eiwitniveaus van het oxidatieve fosforyleringscomplex op dag zeven van de differentiatie. UCP1, een bonafide marker van dit celtype, werd niet gedetecteerd in ongedifferentieerde preadipocyten, terwijl het op dag zeven van de differentiatie substantieel tot expressie werd gebracht in rijpe bruine adipocyten.

De mitochondriën evolueerden van een langwerpige buisvorm op dag nul naar een ronde of boonachtige vorm op dag zeven. De mitochondriale inwendige structuur werd ook gewijzigd door adipogenese, wat resulteerde in een hogere dichtheid van de parallel opeengepakte crystae. Belangrijk is dat de mitochondriën nauw geassocieerd waren met lipidedruppeltjes in de gedifferentieerde bruine adipocyten, dus er kon geen waarneembare afstand worden gedetecteerd tussen het buitenmembraan van de mitochondriën en de oppervlakken van de lipidedruppels, zelfs niet met transmissie-elektronenmicroscopie met hoge resolutie.

De chirurgische verwijdering van interscapulier vetweefsel is van cruciaal belang. Een inefficiënte hoeveelheid weefsel beperkt de beschikbaarheid van cellen die gedifferentieerd zullen worden. Deze beeldvormingstechniek helpt bij het karakteriseren van de morfologie van gedifferentieerde bruine adipocyten in vitro.

Het is mogelijk om tests uit te voeren voor mitochondriale functie, bèta-androgene activering en autofagische remming.