Name: Differentiatie en beeldvorming van bruine vetcellen uit de stromale vasculaire fractie van interscapulier vetweefsel van pasgeboren muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-03T13:10:00.000+00:00
Duration: 4 min 46 s
Description: Leer de differentiatie van bruine adipocyten uit interscapulair vetweefsel van pasgeboren muizen. Dit protocol combineert immunofluorescentie en transmissie-elektronenmicroscopie voor gedetailleerde celanalyse en onderzoek naar thermogenese.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Financiering werd verstrekt door FONDECYT (1181214 en 1221146) en Anillos (ACT210039) aan VC en doctoraatsbeurzen ANID 21171743 aan AMF en ANID 21150665 aan FS. We danken Alejandro Munizaga voor zijn hulp bij de verwerking van de monsters en technisch advies voor de transmissie-elektronenmicroscopie. De illustraties zijn gemaakt met behulp van BioRender.

De dierproeven werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Pontificia Universidad Católica de Chile. P0.5 pasgeboren muizen van beide geslachten, afgeleid van een gemengde achtergrond van C57BL/6J en 129J stammen, werden gebruikt voor deze studie.
1. Weefselextractie
<ol><li>Reinig en desinfecteer de werkbank met een 70% ethanoloplossing en gebruik steriel chirurgisch materiaal.</li>
	<li>Euthanaseer P0.5 pasgeboren pups door onthoofding met een chirurgische schaar volgens een institutioneel goedgekeurd protocol.</li>
	<li>Plaats de muis in buikligging (naar beneden gericht) en maak met een scherpe schaar een incisie van 1 cm lang in de huid ter hoogte van de rug van het dier. Verwijder de schil voorzichtig. OPMERKING: Deze stap is van cruciaal belang, want als de huid niet goed wordt verwijderd, kan deze de iBAT scheuren en beschadigen en de optimale voorbereiding van de SVF verhinderen.</li>
	<li>Maak de iBAT operatief los van het karkas met behulp van een kleine schaar. OPMERKING: De iBAT wordt gevisualiseerd als twee vetlobben die onafhankelijk van elkaar kunnen worden verwijderd.</li>
	<li>Oogst beide iBAT-lobben door een tang met gebogen punt te gebruiken om de lobben onafhankelijk van elkaar te verwijderen.</li>
	<li>Plaats de twee lobben in een plastic buis met 1,5 ml steriele PBS op kamertemperatuur. Bewaar de weefsels in hun individuele buisjes totdat de weefselextractie is voltooid voor alle benodigde pups.</li>
</ol>2. Vertering van weefsel
<ol><li>Aliquot 300 μL collagenase type II digestiebuffer (0,2% type II collagenase in buffer [25 mM KHCO3, 1,2 mM MgSO4, 120 mM NaCl, 5 mM glucose, 12 mM KH2PO4, 4,8 mM KCl, 1,2 mM CaCl2, 2,5% BSA en 1% penicilline/streptomycine, bij pH 7,4]) (Tabel 1) in buisjes van 1,5 ml in een bioveiligheidskast. OPMERKING: Bereid voldoende buisjes voor voor het aantal afzonderlijke weefsels dat moet worden geëxtraheerd. In de huidige studie werden zeven buisjes gebruikt, wat overeenkomt met een nest van zeven pups.</li>
	<li>Ga naar de bank en plaats de iBAT-lobben in collagenase type II-verteringsbuffer om de extracellulaire matrix af te breken.</li>
	<li>Incubeer de iBAT-weefsels gedurende 45 minuten bij 37 °C met continu zacht schudden bij 800 tpm (figuur 1).</li>
</ol>3. Verwerking van weefsel
OPMERKING: Voer na de vertering alle volgende stappen uit in een klasse II laminaire flow weefselkweekkap.
<ol><li>Bereid twee sets plastic buisjes van 1,5 ml voor en label ze voor elk afzonderlijk monster.</li>
	<li>Verstoor de weefselsuspensie in collagenase type II digestiebuffer mechanisch door op en neer te pipetteren met behulp van een P1.000 micropipet en gefilterde tips. Gebruik voor elk monster een nieuwe tip. OPMERKING: Dit is een cruciale stap. Zorg ervoor dat het weefsel mechanisch wordt gedesaggregeerd met de punt en pipet op en neer totdat de macroscopische homogenisatie is voltooid.</li>
	<li>Haal de gedesaggregeerde weefsels door individuele celzeven van 100 μm (zie de materiaaltabel) in nieuwe buisjes van 1,5 ml.</li>
	<li>Voeg 500 μL ACK-buffer (zie de materiaaltabel) toe aan de gefilterde weefselmonsters, keer de buisjes 4-5 keer om en incubeer gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur. OPMERKING: Overschrijd de incubatietijd niet, omdat dit de cellen van belang kan beschadigen.</li>
	<li>Centrifugeer de weefselmonsters bij 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Gooi het supernatans weg door de buis om te keren en resuspendeer de pellet in 1 ml kweekmedium (DMEM-F12 met 10% FBS, 1% antibiotisch antimycoticum, pH 7,2) (zie de materiaaltabel).</li>
	<li>Leid de suspensies door een celzeef van 40 μm in nieuwe buisjes van 1,5 ml met behulp van een P1.000-micropipet en gefilterde tips.</li>
	<li>Centrifugeer de monsters bij 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. OPMERKING: De pellet komt overeen met de pre-adipocyt-bevattende SVF.</li>
	<li>Gooi het supernatans weg door de buis om te keren en reponseer de pellet opnieuw in 1 ml kweekmedium door te pipetteren.</li>
	<li>Bereid voor elk monster een buisje van 15 ml voor door 5 ml kweekmedium toe te voegen.</li>
	<li>Voeg elke geresuspendeerde pellet toe aan de overeenkomstige tube van 15 ml met 5 ml kweekmedium. Keer de buis 4-5 keer om om de celinhoud te mengen.</li>
	<li>Zaai elk monster in zes putjes van een kweekplaat met 24 putjes door 1 ml van de suspensie aan elk putje toe te voegen (figuur 1).</li>
</ol>4. Stromale vasculaire fractie (SVF) cultuur
<ol><li>Verander het kweekmedium om de dag totdat de cellen 100% samenvloeiing bereiken. OPMERKING: Tijdens deze periode worden niet-plastische aanhangende cellen verwijderd, wat resulteert in een primaire cultuur verrijkt met een preadipocyt-bevattende SVF.</li>
	<li>Wanneer de cellen 100% samenvloeiend zijn, verwijdert u het kweekmedium en wast u de cellen met 800 μL steriele PBS.</li>
	<li>Voeg 150 μL 0,25% trypsine-EDTA (zie de materiaaltabel) toe aan elk putje en plaats de kweekplaat gedurende 3 minuten in de incubator voor het losmaken van de cellen. OPMERKING: Controleer of de cellen zijn losgemaakt met behulp van een lichtmicroscoop met fasecontrast.</li>
	<li>Inactiveer de trypsine door 850 μL kweekmedium aan elk putje toe te voegen.</li>
	<li>Verzamel de cellen van de zes putjes die in stap 3.12 zijn gezaaid en breng ze over in een buisje van 15 ml.</li>
	<li>Maak het totale volume op 12 ml door 6 ml kweekmedium toe te voegen. Keer de tube 4-5 keer om om de inhoud te mengen.</li>
	<li>Zaai 1 ml van het monster in elk putje van een plaat met 12 putjes. Verander het kweekmedium om de dag totdat de cellen samenvloeien.</li>
	<li>Wanneer de cellen 100% samenvloeiend zijn, maak ze dan los met 150 μL 0,25% trypsine-EDTA volgens dezelfde incubatieomstandigheden als in stap 4.3, en zaai ze volgens de oppervlakte van het putje dat nodig is voor het experiment.</li>
	<li>Voer beeldvorming met hoge resolutie uit na het fixeren van de cellen na stap 8. OPMERKING: Een dichtheid van 35.000 cellen/cm² wordt aanbevolen voor verdere experimenten (eiwit- en totale RNA-extractie, 330.000 cellen [één putje van een plaat met 6 putjes]; immunofluorescentie [IF], 10.500 cellen [één putje van een plaat met 96 putjes]).</li>
</ol>5. Apopogene differentiatie
<ol><li>Incubeer de cellen met inductiemedium (DMEM-F12 met 10% FBS, 1% antibiotisch antimycoticum, pH 7,2, aangevuld met 500 nM dexamethason, 125 nM indomethacine, 0,5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine [IBMX], 5 μM rosiglitazon, 1 nM T3 en 20 nM insuline) (Tabel 1) gedurende 72 uur (dag 0 tot dag 2) (Figuur 2). LET OP: Het kweekmedium moet om de dag worden vervangen; De eerste mediumverandering moet dus plaatsvinden op dag 2 na de eerste inductie.</li>
	<li>Schakel over op onderhoudsmedium (DMEM-F12 met 10% FBS, 1% antibioticum antimycoticum, pH 7,2, aangevuld met 5 μM rosiglitazon, 1 nM T3 en 20 nM insuline) (Tabel 1) op dag 3 en houd dit onderhoudsmedium aan tot dag 7 (Figuur 2). OPMERKING: Het onderhoudsmedium moet op dag 5 en dag 7 worden vervangen. Kleine lipidedruppeltjes kunnen vanaf dag 3 van de differentiatie worden gevisualiseerd door middel van fasecontrastmicroscopie. Grote lipidedruppels zijn zichtbaar op dag 7 van de differentiatie. Differentiatieprocedures langer dan 7 dagen resulteren in celverlies door loslating, waarschijnlijk als gevolg van het hoge drijfvermogen van met lipiden beladen cellen.</li>
</ol>6. Cellulair homogenaat preparaat
<ol><li>Verwijder het kweekmedium op dag 0 en dag 7 van de differentiatie en was de cellen 3 keer met steriel PBS.</li>
	<li>Voeg na de laatste reiniging 1,3 ml steriele PBS toe aan elk putje. OPMERKING: Houd de cellen in ijs tot het reinigen van de laatste plaat.</li>
	<li>Oogst de cellen mechanisch uit een putje van een plaat met 6 putjes (~330.000 cellen) met een celschraper en doe de cellulaire suspensie in een buisje van 1,5 ml.</li>
	<li>Centrifugeer de monsters bij 2.800 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.</li>
	<li>Verwijder de PBS met een micropipet en houd de buisjes op ijs.</li>
	<li>Resuspendeer de cellulaire pellet in de Ripa-buffer met protease- en fosfataseremmers (zie de materiaaltabel) en incubeer gedurende 30 minuten op ijs. OPMERKING: Om de cellulaire pellet te lysoleren, is 70-80 μL voldoende.</li>
	<li>Centrifugeer de monsters bij 21.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C.</li>
	<li>Verwijder het supernatans voorzichtig in een buisje van 1,5 ml en gooi de pellet weg. OPMERKING: Het supernatans vertegenwoordigt het cellulaire homogenaat.</li>
	<li>Bepaal de eiwitconcentratie van het cellulaire homogenaat met behulp van bicinchoninezuur (BCA) voor de colorimetrische detectie en kwantificering van het totale eiwit18,19.</li>
</ol>7. Westelijke blotting
<ol><li>Bereid 30 μg van het cellulaire homogenaat (uit stap 6.8) en voeg de in de handel verkrijgbare SDS-PAGE-monsterlaadbuffer toe (zie de materiaaltabel).</li>
	<li>Los op in polyacrylamidegelelektroforese-SDS20 (PAGE-SDS) volgens het molecuulgewicht van elk eiwit. OPMERKING: Gebruik 10% PAGE-SDS voor PPARγ, C/EBPα, PLIN1, CD36 en UCP1, 12% PAGE-SDS voor OXPHOS en 15% PAGE-SDS voor TOM20 (zie de materiaaltabel).</li>
	<li>Breng de eiwitten elektrolytisch over op het PVDF-membraan (zie de materiaaltabel) bij 350 mA gedurende 2 uur. NOTITIE: De ijscontainer moet na 1 uur worden vervangen. Houd tijdens het hele proces de kamer op ijs.</li>
	<li>Blokkeer de membranen met 5% BSA of vetvrije melk in Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) 0,1% Tween 20 (TBS-T) gedurende 2 uur volgens de aanbevelingen uit de datasheets van de antilichamen.</li>
	<li>Incubeer met de primaire antilichamen (de antilichamen die in dit onderzoek zijn gebruikt, worden gedetailleerd beschreven in de materiaaltabel) 's nachts bij 4 °C. OPMERKING: Alle antilichamen die in dit onderzoek werden gebruikt, werden verdund tot 1:1.000 in een blokkerende oplossing.</li>
	<li>Was de membranen 3 keer met 0,1% TBS-T en incubeer ze met mierikswortelperoxidase (HRP) geconjugeerd secundair antilichaam (zie de materiaaltabel) gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Was de membranen 3 keer met 0,1%. TBS-T. Voer een laatste wasbeurt uit met 1x TBS. Bewaar de membranen in 1x TBS tot visualisatie. Bewaren voor maximaal 1 uur wordt aanbevolen.</li>
	<li>Visualiseer de membranen door chemiluminescentie20 of een andere voorkeursmethode.</li>
</ol>8. Beeldvorming met hoge resolutie
<ol><li>Voer de immunofluorescentietest uit volgens de onderstaande stappen.<ol><li>Zaai en differentieer de primaire culturen van bruine preadipocyten van P0.5 pasgeboren muizen (volgens stap 4.8) in platen met 96 putjes en een optische bodem (zie de Tabel met materialen).</li>
		<li>Fixeer de cellen op dag 0 en dag 7 van differentiatie met 4% PFA gedurende 20 minuten en was 3 keer met steriele PBS.</li>
		<li>Permeabiliseer de cellen met 0,1% Triton X-100 gedurende 15 minuten en blokkeer ze met 3% visgelatine (zie de materiaaltabel) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.</li>
		<li>3 maal wassen met steriel PBS en incuberen met PLIN1-antilichaam (1:400, zie materiaaltabel) in 1% BSA/PBS 's nachts bij 4 °C in een vochtige kamer.</li>
		<li>3 keer wassen met steriel PBS en incuberen met fluorofoorgeconjugeerd secundair antilichaam bij 1:1.000 (1% BSA/PBS) (zie de materiaaltabel) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Kleur de kernen met 1 μg/ml Hoechst 33342 en de lipidedruppels met 1 μg/ml BODIPY gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. OPMERKING: De fluorescentiebeelden zijn verkregen met behulp van een celbeeldvormingssysteem (zie de tabel met materialen). In totaal werden 9 of 16 foto's per put gemaakt met twee tot drie kanalen met een vergroting van 20x.</li>
	</ol></li>
	<li>Voer transmissie-elektronenmicroscopie uit volgens de onderstaande stappen.<ol><li>Kweek en differentieer de bruine preadipocyten in celkweekschaaltjes van 35 mm x 10 mm.</li>
		<li>Verwijder op dag 0 en dag 7 van de differentiatie het medium en fixeer de cellen gedurende 1 uur met 2,5% glutaaraldehyde in 0,1 M natriumcacodylaatbuffer, pH 7,0 (zie de materiaaltabel).</li>
		<li>Was de cellen 3 keer met 0,05 M natriumkakodylaatbuffer gedurende 10 minuten en behandel ze gedurende 15 minuten met 1% waterig osmiumtetroxide (zie de materiaaltabel).</li>
		<li>Was de cellen 3 keer met bi-gedestilleerd water gedurende 5 minuten en behandel ze gedurende 15 minuten met 1% waterig uranylacetaat (zie de materiaaltabel).</li>
		<li>Dehydrateer de cellen met een ethanolgradiënt van 30%, 50%, 70%, 95% en 100% gedurende 5 minuten per keer.</li>
		<li>Veranker de cellen vooraf in 1:1 epon/ethanol gedurende 30 minuten en vervolgens gedurende 1 uur in epon (zie de materiaaltabel). OPMERKING: De opname van cellen wordt direct in de schaal uitgevoerd door vers epon toe te voegen om de gehele monolaag van de celcultuur te bedekken. Laat de epon 24 uur polymeriseren in een oven op 60 °C.</li>
		<li>Dompel de celkweekschaal 2 minuten onder in vloeibare stikstof en breek hem vervolgens met een tang om de plastic insluiting los te maken.</li>
		<li>Lijm de insluitingssegmenten met cellen op een blok hars om fijne sneden (80 nm) evenwijdig aan het oppervlak te verkrijgen in een ultramicrotoom (zie de tabel met materialen).</li>
		<li>Kleur de sneden met 1% waterig uranylacetaat gedurende 4 minuten en loodcitraat gedurende 5 minuten, volgens Reynolds et al.21.</li>
		<li>Visualiseer de roosters in een elektronenmicroscoop (zie de Tabel met materialen).</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Luo, L., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+in+control+of+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue in control of metabolism.</a> Journal of Endocrinology. 231 (3), 77-99 (2016).</li>
<li>Gaspar, R. C., Pauli, J. R., Shulman, G. I., Muñoz, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+update+on+brown+adipose+tissue+biology%3A+A+discussion+of+recent+findings%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">An update on brown adipose tissue biology: A discussion of recent findings.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 320 (3), 488-495 (2021).</li>
<li>Richard, D., Picard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brown+fat+biology+and+thermogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Brown fat biology and thermogenesis.</a> Frontiers in Bioscience. 16, 1233-1260 (2011).</li>
<li>Rosenwald, M., Wolfrum, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+and+definition+of+brite+versus+white+and+classical+brown+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Adipocyte%22%5BJournal%5D)">The origin and definition of brite versus white and classical brown adipocytes.</a> Adipocyte. 3 (1), 4-9 (2014).</li>
<li>Smorlesi, A., Frontini, A., Giordano, A., Cinti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adipose+organ%3A+White-brown+adipocyte+plasticity+and+metabolic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Obesity+Reviews%22%5BJournal%5D)">The adipose organ: White-brown adipocyte plasticity and metabolic inflammation.</a> Obesity Reviews. 13, Suppl 2 83-96 (2012).</li>
<li>Townsend, K., Tseng, Y. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brown+adipose+tissue%3A+Recent+insights+into+development%2C+metabolic+function+and+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Adipocyte%22%5BJournal%5D)">Brown adipose tissue: Recent insights into development, metabolic function and therapeutic potential.</a> Adipocyte. 1 (1), 13-24 (2012).</li>
<li>Benador, I. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+bound+to+lipid+droplets+have+unique+bioenergetics%2C+composition%2C+and+dynamics+that+support+lipid+droplet+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Mitochondria bound to lipid droplets have unique bioenergetics, composition, and dynamics that support lipid droplet expansion.</a> Cell Metabolism. 27 (4), 869-885 (2018).</li>
<li>Benador, I. Y., Veliova, M., Liesa, M., Shirihai, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+bound+to+lipid+droplets%3A+Where+mitochondrial+dynamics+regulate+lipid+storage+and+utilization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Mitochondria bound to lipid droplets: Where mitochondrial dynamics regulate lipid storage and utilization.</a> Cell Metabolism. 29 (4), 827-835 (2019).</li>
<li>Lee, P., Swarbrick, M. M., Ho, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brown+adipose+tissue+in+adult+humans%3A+A+metabolic+renaissance%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">Brown adipose tissue in adult humans: A metabolic renaissance.</a> Endocrine Reviews. 34 (3), 413-438 (2013).</li>
<li>Han, S., Sun, H. M., Hwang, K. C., Kim, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stromal+vascular+fraction+cells%3A+Update+on+clinical+utility+and+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Eukaryotic+Gene+Expression%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stromal vascular fraction cells: Update on clinical utility and efficacy.</a> Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 25 (2), 145-152 (2015).</li>
<li>Klein, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta%283%29-adrenergic+stimulation+differentially+inhibits+insulin+signaling+and+decreases+insulin-induced+glucose+uptake+in+brown+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Beta(3)-adrenergic stimulation differentially inhibits insulin signaling and decreases insulin-induced glucose uptake in brown adipocytes.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (3), 34795-34802 (1999).</li>
<li>Gaom, W., Kong, X., Yang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+primary+culture%2C+and+differentiation+of+preadipocytes+from+mouse+brown+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation, primary culture, and differentiation of preadipocytes from mouse brown adipose tissue.</a> Methods in Molecular Biology. 1566, 3-8 (2017).</li>
<li>Rocha, A. L., Guerra, B. A., Boucher, J., Mori, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+to+induce+brown%2Fbeige+adipocyte+differentiation+from+murine+preadipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">A Method to induce brown/beige adipocyte differentiation from murine preadipocytes.</a> Bio-protocol. 11 (24), 4265(2021).</li>
<li>Galmozzi, A., Kok, B. P., Saez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+differentiation+of+primary+white+and+brown+preadipocytes+from+newborn+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and differentiation of primary white and brown preadipocytes from newborn mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (167), e62005(2021).</li>
<li>Tapia, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+AGPAT2+impairs+brown+adipogenesis%2C+increases+IFN+stimulated+gene+expression+and+alters+mitochondrial+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolism%22%5BJournal%5D)">Absence of AGPAT2 impairs brown adipogenesis, increases IFN stimulated gene expression and alters mitochondrial morphology.</a> Metabolism. 111, 154341(2020).</li>
<li>González-Hódar, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+caveolae+in+AGPAT2+lacking+adipocytes+is+independent+of+changes+in+cholesterol+or+sphingolipid+levels%3A+A+whole+cell+and+plasma+membrane+lipidomic+analysis+of+adipogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Molecular+Basis+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Decreased caveolae in AGPAT2 lacking adipocytes is independent of changes in cholesterol or sphingolipid levels: A whole cell and plasma membrane lipidomic analysis of adipogenesis.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1867 (9), 166167(2021).</li>
<li>Fernández-Galilea, M., Tapia, P., Cautivo, K., Morselli, E., Cortés, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AGPAT2+deficiency+impairs+adipogenic+differentiation+in+primary+cultured+preadipocytes+in+a+non-autophagy+or+apoptosis+dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">AGPAT2 deficiency impairs adipogenic differentiation in primary cultured preadipocytes in a non-autophagy or apoptosis dependent mechanism.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 467 (1), 39-45 (2015).</li>
<li>Walker, J. M. The bicinchoninic acid (BCA) assay for protein quantitation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWalker%2C+JM+%22The+Protein+Protocols+Handbook%22">The Protein Protocols Handbook</a>. , Humana Press. Totowa, NJ. 11-15 (2009).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).</li>
<li>Kurien, B. T., Scofield, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blotting%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Western blotting.</a> Methods. 38 (4), 283-293 (2006).</li>
<li>Reynolds, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+lead+citrate+at+high+pH+as+an+electron-opaque+stain+in+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in electron microscopy.</a> Journal of Cell Biology. 17 (1), 208-212 (1963).</li>
<li>Ghaben, A. L., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipogenesis+and+metabolic+health%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Adipogenesis and metabolic health.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (4), 242-258 (2019).</li>
<li>Ambele, M. A., Dhanraj, P., Giles, R., Pepper, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipogenesis%3A+A+complex+interplay+of+multiple+molecular+determinants+and+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Adipogenesis: A complex interplay of multiple molecular determinants and pathways.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (12), 4283(2020).</li>
<li>Lefterova, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PPAR%CE%B3+and+C%2FEBP+factors+orchestrate+adipocyte+biology+via+adjacent+binding+on+a+genome-wide+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">PPARγ and C/EBP factors orchestrate adipocyte biology via adjacent binding on a genome-wide scale.</a> Genes & Development. 22 (21), 2941-2952 (2008).</li>
<li>Ntambi, J. M., Young-Cheul, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocyte+differentiation+and+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Adipocyte differentiation and gene expression.</a> The Journal of Nutrition. 130 (12), (2000).</li>
<li>Itabe, H., Yamaguchi, T., Nimura, S., Sasabe, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perilipins%3A+A+diversity+of+intracellular+lipid+droplet+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Lipids+in+Health+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Perilipins: A diversity of intracellular lipid droplet proteins.</a> Lipids in Health and Disease. 16, 83(2017).</li>
<li>Christiaens, V., Van Hul, M., Lijnen, H. R., Scroyen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD36+promotes+adipocyte+differentiation+and+adipogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+General+Subjects%22%5BJournal%5D)">CD36 promotes adipocyte differentiation and adipogenesis.</a> Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects. 1820 (7), 949-956 (2012).</li>
<li>Carobbio, S., Rosen, B., Vidal-Puig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipogenesis%3A+New+insights+into+brown+adipose+tissue+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Adipogenesis: New insights into brown adipose tissue differentiation.</a> Journal of Molecular Endocrinology. 51 (3), 75-85 (2013).</li>
<li>Ricquier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncoupling+protein+1+of+brown+adipocytes%2C+the+only+uncoupler%3A+A+historical+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Uncoupling protein 1 of brown adipocytes, the only uncoupler: A historical perspective.</a> Frontiers in Endocrinology. 2, 85-91 (2011).</li>
<li>Cui, L., Mirza, A. H., Zhang, S., Liang, B., Liu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplets+and+mitochondria+are+anchored+during+brown+adipocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+%26+Cell%22%5BJournal%5D)">Lipid droplets and mitochondria are anchored during brown adipocyte differentiation.</a> Protein & Cell. 10 (12), 921-926 (2019).</li>
<li>Hao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indomethacin+enhances+brown+fat+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Indomethacin enhances brown fat activity.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 365 (3), 467-475 (2018).</li>
<li>Lehmann, J. M., Lenhard, J. M., Oliver, B. B., Ringold, G. M., Kliewer, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisome+proliferator-activated+receptors+alpha+and+gamma+are+activated+by+indomethacin+and+other+non-steroidal+anti-inflammatory+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Peroxisome proliferator-activated receptors alpha and gamma are activated by indomethacin and other non-steroidal anti-inflammatory drugs.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (6), 3406-3410 (1997).</li>
<li>Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+methods+of+adipogenic+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).</li>
<li>Wilson-Fritch, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+remodeling+in+adipose+tissue+associated+with+obesity+and+treatment+with+rosiglitazone%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial remodeling in adipose tissue associated with obesity and treatment with rosiglitazone.</a> The Journal of Clinical Investigation. 114 (9), 1281-1289 (2004).</li>
<li>Cannon, B., Nedergaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brown+adipose+tissue%3A+Function+and+physiological+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Brown adipose tissue: Function and physiological significance.</a> Physiological Reviews. 84 (1), 277-359 (2004).</li>
<li>Ohno, H., Shinoda, K., Spiegelman, B. M., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PPARgamma+agonists+induce+a+white-to-brown+fat+conversion+through+stabilization+of+PRDM16+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">PPARgamma agonists induce a white-to-brown fat conversion through stabilization of PRDM16 protein.</a> Cell Metabolism. 15 (3), 395-404 (2012).</li>
<li>Merlin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rosiglitazone+and+a+%CE%B23-adrenoceptor+agonist+are+both+required+for+functional+browning+of+white+adipocytes+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Rosiglitazone and a β3-adrenoceptor agonist are both required for functional browning of white adipocytes in culture.</a> Frontiers in Endocrinology. 9, 249(2018).</li>
<li>Fayyad, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rosiglitazone+enhances+browning+adipocytes+in+association+with+MAPK+and+PI3-K+pathways+during+the+differentiation+of+telomerase-transformed+mesenchymal+stromal+cells+into+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Rosiglitazone enhances browning adipocytes in association with MAPK and PI3-K pathways during the differentiation of telomerase-transformed mesenchymal stromal cells into adipocytes.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (7), 1618-1633 (2019).</li>
<li>Zennaro, M. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hibernoma+development+in+transgenic+mice+identifies+brown+adipose+tissue+as+a+novel+target+of+aldosterone+action%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Hibernoma development in transgenic mice identifies brown adipose tissue as a novel target of aldosterone action.</a> The Journal of Clinical Investigation. 101 (6), 1254-1260 (1998).</li>
<li>Klaus, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+novel+brown+adipocyte+cell+line+HIB+1B.+Adrenergic+pathways+involved+in+regulation+of+uncoupling+protein+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Characterization of the novel brown adipocyte cell line HIB 1B. Adrenergic pathways involved in regulation of uncoupling protein gene expression.</a> Journal of Cell Science. 107 (1), 313-319 (1994).</li>
<li>Guennoun, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+molecular+characterization+of+human+adipocytes+reveals+a+transient+brown+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Comprehensive molecular characterization of human adipocytes reveals a transient brown phenotype.</a> Journal of Translational Medicine. 13, 135(2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het huidige protocol is een eenvoudige en reproduceerbare differentiatieprocedure in twee fasen (figuur 2) voor het genereren van cellen met de moleculaire en morfologische kenmerken van rijpe bruine adipocyten. Het chirurgisch oogsten van de iBAT is de eerste cruciale stap, omdat weefselscheuren de levensvatbaarheid van het uitgangsmateriaal ernstig beperkt. Weefselverwerking is ook van cruciaal belang omdat een homogene celsuspensie die vrij is van puin de hoeveelheid SVF die kan worden ge...

Wit en bruin vetweefsel verschillen in hun anatomische locatie, cellulaire oorsprong, functie, morfologie en totale massa. Wit vetweefsel (WAT) is het belangrijkste fysiologische energiereservoir van het lichaam en slaat grote hoeveelheden triacylglycerol (TAG) op in zeer gespecialiseerde cellen die een enkele gigantische lipidedruppel hebben die het grootste deel van hun cellulaire volume in beslag neemt. TAG-lipolyse maakt vrije vetzuren vrij, die in de systemische circulatie terechtkomen om te voldoen aan de energiebehoefte tijdens het vasten of andere toestanden van negatieve energiebalans. Bovendien scheidt de WAT eiwit- en lipideproducten af, respectievelijk adipokines en lipokines genaamd, die metabole, immuun- en reproductieve regulerende functies hebben, waardoor de WAT het grootste endocriene weefsel inhet lichaam is.
Bruin vetweefsel (BAT) is een veel kleiner orgaan waarvan de belangrijkste fysiologische functie niet-rillende thermogenese is om onderkoeling te voorkomen. Bij muizen en pasgeboren mensen is BAT een goed gedefinieerd orgaan dat zich in de interscapulaire ruimte bevindt. Volwassen mensen missen interscapulaire BAT (iBAT); niettemin ontwikkelen ze clusters van bruine adipocytachtige cellen die zijn geïntegreerd in depots die anders voornamelijk uit WAT bestaan. Deze "bruin-in-witte" (brite) adipocyten delen morfologische en moleculaire kenmerken met klassieke iBAT-adipocyten, maar ze hebben een andere cellulaire oorsprong 3,4.
In tegenstelling tot witte vetcellen hebben bruine vetcellen meerdere kleine lipidedruppeltjes en overvloedige mitochondriën5. Ontkoppelingseiwit 1 (UCP1, ook bekend als thermogenine) wordt op unieke wijze tot expressie gebracht door bruine en brite adipocyten en bemiddelt protonlekkage in het binnenste mitochondriale membraan (IMM), waardoor elektronentransport wordt losgekoppeld van ATP-synthese en warmte wordt gegenereerd. Niet-rillende thermogenese in BAT wordt geactiveerd door noradrenaline (NE), dat wordt vrijgegeven uit de sympathische terminals in de BAT als reactie op koudestimulatie6. NE bindt zich aan bèta-adrenoceptoren (meestal bèta 3) op het oppervlak van bruine adipocyten en activeert een intracellulaire cAMP-gemedieerde signaalcascade. Dit resulteert in TAG-lipolyse, de bèta-oxidatie van mitochondriale vetzuren en warmteontwikkeling bij activering van UCP13. De nauwe functionele relatie tussen lipidedruppels en mitochondriën in bruine adipocyten heeft structurele parallellen, zoals de interactie tussen deze organellen in gebieden die groot zijn en zeer nauw fysiek contact hebben 7,8.
iBAT heeft een overvloed aan bloedvaten en sympathische terminals9. Deze structuren, samen met de preadipocyten, immuuncellen, fibroblasten en extracellulaire matrixmoleculen, vormen de vetstromale vasculaire fractie (SVF)10. Van veel protocollen is gemeld dat ze rijpe adipocyten genereren uit preadipocyten 11,12,13,14,15 (aanvullende tabel 1); Niettemin vertonen ze extreme variaties in weefselverwerking en de samenstelling van de differentiatiecultuurmedia. Het hierin beschreven protocol maakt de efficiënte en reproduceerbare differentiatie mogelijk van bruine adipocyten die (1) de belangrijkste adipogene transcriptiefactoren peroxisoomproliferator-geactiveerde receptor gamma (PPARγ) en CCAAT/enhancer-bindend eiwit alfa (C/EBPα) tot expressie brengen, (2) de rijpe adipocytmarkers perilipine1 (PLIN1) en clusterdeterminant 36 (CD36) tot expressie brengen, (3) overvloedige lipidedruppeltjes accumuleren, (4) een hoge mitochondriale massa hebben en een hoge overvloed aan OXPHOS-complexen, (5) thermogeen potentieel hebben, zoals bepaald door hoge niveaus van UCP1, en (6) mitochondriale morfologische veranderingen hebben die verband houden met het fenotype van rijpe bruine adipocyten. Deze methodologie wordt gebruikt voor het bestuderen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan gegeneraliseerde lipodystrofie 15,16,17.

<table><tbody><tr><td>10x Tris/Glycine Buffer</td><td>BioRad</td><td>1610734</td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde Aqueous Solution</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)</td><td>Calbiochem</td><td>410957</td><td></td></tr><tr><td>40% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1</td><td>BioRad</td><td>1610148</td><td></td></tr><tr><td>6-well plate&nbsp;</td><td>SPL Life Science&nbsp;</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>96 well optical black w/lid cell culture sterile</td><td>Thermo Scientific</td><td>165305</td><td></td></tr><tr><td>AccuRuler RGB Plus Pre-stained Protein Ladder&nbsp;</td><td>Maestrogen</td><td>02102-250</td><td></td></tr><tr><td>ACK lysing buffer&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>A10492-01</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Persulfate&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>1610700</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-antimycotic</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>7076</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody&nbsp;&nbsp;</td><td>Cell Signaling</td><td>7074</td><td></td></tr><tr><td>Blotting-grade blocker&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>170-6404</td><td></td></tr><tr><td>BODIPY 493/503&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>D3922</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A1470</td><td></td></tr><tr><td>C/EBP&alpha; antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>2295</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Calbiochem&nbsp;</td><td>208291</td><td></td></tr><tr><td>CD36 antibody</td><td>Invitrogen</td><td>PA1-16813</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainer 100 &micro;m, nylon</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainer 40 &micro;m, nylon</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase type II</td><td>Gibco</td><td>17101-015</td><td></td></tr><tr><td>Cytation 5 Cell Imaging Multimode Reader</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dexamethasone&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, powder</td><td>Gibco</td><td>12500062</td><td></td></tr><tr><td>EMBed-812 EMBEDDING KIT (Epon)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>14120</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol absolute</td><td>Merck&nbsp;</td><td>100983&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin from cold water fish skin</td><td>Sigma</td><td>G7041</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>15023-021</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde 25% Aqueous Solution</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>16210</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594</td><td>Life Technologies</td><td>A11012</td><td></td></tr><tr><td>Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail 100X&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>78427</td><td></td></tr><tr><td>Halt Protease Inhibitor Cocktail 100X&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>78429</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33258</td><td>Invitrogen</td><td>H1398</td><td></td></tr><tr><td>Immun-Blot PVDF Membrane&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>1620177</td><td></td></tr><tr><td>Indomethacin&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>I7378&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Insulin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>I3536</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Calbiochem&nbsp;</td><td>529552</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Calbiochem</td><td>529568</td><td></td></tr><tr><td>KHCO3</td><td>Sigma</td><td>60339</td><td></td></tr><tr><td>Lane Marker Reducing Sample Buffer&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>39000</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>MilliQ water sterile&nbsp;</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Mitoprofile Total OXPHOS Rodent WB antibody Cocktail</td><td>Abcam&nbsp;</td><td>MS604</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck&nbsp;</td><td>1064041000</td><td></td></tr><tr><td>OmniPur&nbsp;10x PBS Liquid Concentrate</td><td>Calbiochem</td><td>6505-OP</td><td></td></tr><tr><td>Osmium Tetroxide&nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19100</td><td></td></tr><tr><td>Perilipin 1 antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>9349</td><td></td></tr><tr><td>PPAR&gamma; (81B8) antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>2443</td><td></td></tr><tr><td>RIPA buffer lysis&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>89901</td><td></td></tr><tr><td>Rosiglitazone</td><td>Merck</td><td>557366</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Cacpdylate</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>12300</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>1610301</td><td></td></tr><tr><td>T3</td><td>Sigma</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>Talos F200C G2</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TEMED&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>1610800</td><td></td></tr><tr><td>TOM20 antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>42406</td><td></td></tr><tr><td>Tris Buffered Saline (TBS-10X)</td><td>Cell Signaling</td><td>12498</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,25%)</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20, Molecular Biology Grade</td><td>Promega&nbsp;</td><td>H5152</td><td></td></tr><tr><td>UCP1 antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>14670</td><td></td></tr><tr><td>Ultracut R</td><td>Leica&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Uranyl Acetate</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>Westar Sun&nbsp;</td><td>Cyanagen</td><td>XLS063</td><td></td></tr><tr><td>Westar Supernova&nbsp;</td><td>Cyanagen</td><td>XLS3</td><td></td></tr></tbody></table>

differentiatie en beeldvorming van bruine vetcellen uit de stromale vasculaire fractie van interscapulier vetweefsel van pasgeboren muizen

Differentiation and Imaging of Brown Adipocytes from the Stromal Vascular Fraction of Interscapular Adipose Tissue from Newborn Mice

Bruin vetweefsel (BAT) komt alleen voor bij zoogdieren en heeft een thermogene functie. Bruine vetcellen worden gekenmerkt door een multiloculair cytoplasma met meerdere lipidedruppeltjes, een centrale kern, een hoog mitochondriaal gehalte en de expressie van ontkoppelingseiwit 1 (UCP1). BAT is voorgesteld als een potentieel therapeutisch doelwit voor obesitas en de daarmee samenhangende stofwisselingsstoornissen vanwege het vermogen om metabolische energie af te voeren als warmte. Om de functie en regulatie van de BAT te onderzoeken, is het kweken van bruine adipocyten onmisbaar. Het huidige protocol optimaliseert weefselverwerking en celdifferentiatie voor het kweken van bruine vetcellen van pasgeboren muizen. Daarnaast worden procedures getoond voor de beeldvorming van gedifferentieerde adipocyten met zowel confocale immunofluorescentie als transmissie-elektronenmicroscopie. In de bruine vetcellen die zijn gedifferentieerd met de hierin beschreven technieken, blijven de belangrijkste bepalende kenmerken van klassieke BAT behouden, waaronder hoge UCP1-niveaus, verhoogde mitochondriale massa en zeer nauw fysiek contact tussen de lipidedruppeltjes en mitochondriën, waardoor deze methode een waardevol hulpmiddel is voor BAT-studies.

Adipogenese wordt gereguleerd door een netwerk van transcriptiefactoren die verantwoordelijk zijn voor zowel de expressie van belangrijke eiwitten die de vorming en het functioneren van bruine adipocyten induceren22, waaronder klassieke adipogene regulatoren zoals PPARγ en C/EBPα 23,24,25, evenals markers van rijpe adipocyten 26,27. Door het teste...

Preadipocyten worden geïsoleerd uit de stromale vasculaire fractie van interscapulier bruin vetweefsel van pasgeboren muizen en gedifferentieerd tot cellen die lipidedruppeltjes accumuleren, moleculaire markers tot expressie brengen en de mitochondriale morfologie van volwassen bruine vetcellen vertonen. Deze cellen worden verder geanalyseerd door middel van immunofluorescentie en transmissie-elektronenmicroscopie.

Differentiatie en beeldvorming van bruine vetcellen uit de stromale vasculaire fractie van interscapulier vetweefsel van pasgeboren muizen

Brown adipose tissue (BAT) is only present in mammals and has a thermogenic function. Brown adipocytes are characterized by a multilocular cytoplasm with ...

Dit protocol maakt de efficiënte en reproduceerbare differentiatie mogelijk van bruine vetocyten die belangrijke adipogene transcriptiefactoren, rijpe adipocytmarkers tot expressie brengen en thermogeen potentieel en morfologisch fenotype van rijpe bruine vetcellen hebben. Dit is een eenvoudige en reproduceerbare differentiatieprocedure in twee fasen om cellen met kenmerken van rijpe bruine adipocyten te verkrijgen uit interscapulier bruin vetweefsel van pasgeboren muizen. Dit protocol maakt het mogelijk om de activeringsmechanismen van bruin vetweefsel te bestuderen als doelwit voor de behandeling van obesitas.Het is een model geweest voor het bepalen van de mechanismen die betrokken zijn bij de pathofysiologie van lipodystrofie. Het zal naar verwachting een uitdaging zijn om deze techniek voor de eerste keer uit te voeren. Het is essentieel om een gedetailleerd protocol te hebben en kritieke punten te benadrukken om succesvolle resultaten te hebben.Plaats om te beginnen de geëuthanaseerde muis in buikligging en maak met een scherpe schaar een centimeter lange huidincisie in het midden van de rug van het dier. Verwijder de huid voorzichtig, maak de iBAT operatief los van het karkas met een kleine schaar. Oogst beide iBAT-lobben met een tang met kromme punt om de lobben onafhankelijk van elkaar te verwijderen.Plaats de twee lobben in een plastic buis met 1,5 milliliter steriele PBS op kamertemperatuur. Incubeer de iBAT-weefsels in collagenase type twee spijsverteringsbuffer gedurende 45 minuten bij 37 graden Celsius met continu zacht schudden bij 800 RPM. Verstoor de weefselsuspensie in de digestiebuffer van collagenase type twee mechanisch door op en neer te pipetteren met behulp van een P1000-micropipet en filtertips.Gebruik voor elk monster een nieuwe tip. Leid de gedesegregeerde weefsels door individuele celzeven van 100 micrometer in nieuwe buizen van 1,5 milliliter. Voeg 500 microliter ACK-buffer toe aan de gefilterde weefselmonsters.Keer de buisjes vier tot vijf keer om en incubeer ze vier minuten bij kamertemperatuur. Leid de suspensies vervolgens door een celzeef van 40 micrometer in nieuwe buisjes van 1,5 milliliter met behulp van een P1000-micropipet en gefilterde tips. Centrifusion resuspendeert de pellet zoals beschreven in het tekstmanuscript.Zaai vervolgens elk monster in zes putjes van een kweekplaat met 24 putjes door aan elk putje één milliliter van de suspensie toe te voegen. De ongedifferentieerde preadipocyten vertoonden zeer lage of niet-detecteerbare niveaus van ppar-gamma, C/ebp-alfa, perilipine 1 en CD36. Daarentegen waren deze markers significant hoger op dag zeven van de differentiatie.De accumulatie van meerdere lipidedruppeltjes in de bruine preadipocyten kwam overeen met de eerder gepubliceerde resultaten. Er werd een significante toename waargenomen in de mitochondriale massamarker TOM 20 en de eiwitniveaus van het oxidatieve fosforyleringscomplex op dag zeven van de differentiatie. UCP1, een bonafide marker van dit celtype, werd niet gedetecteerd in ongedifferentieerde preadipocyten, terwijl het op dag zeven van de differentiatie substantieel tot expressie werd gebracht in rijpe bruine adipocyten.De mitochondriën evolueerden van een langwerpige buisvorm op dag nul naar een ronde of boonachtige vorm op dag zeven. De mitochondriale inwendige structuur werd ook gewijzigd door adipogenese, wat resulteerde in een hogere dichtheid van de parallel opeengepakte crystae. Belangrijk is dat de mitochondriën nauw geassocieerd waren met lipidedruppeltjes in de gedifferentieerde bruine adipocyten, dus er kon geen waarneembare afstand worden gedetecteerd tussen het buitenmembraan van de mitochondriën en de oppervlakken van de lipidedruppels, zelfs niet met transmissie-elektronenmicroscopie met hoge resolutie.De chirurgische verwijdering van interscapulier vetweefsel is van cruciaal belang. Een inefficiënte hoeveelheid weefsel beperkt de beschikbaarheid van cellen die gedifferentieerd zullen worden. Deze beeldvormingstechniek helpt bij het karakteriseren van de morfologie van gedifferentieerde bruine adipocyten in vitro.Het is mogelijk om tests uit te voeren voor mitochondriale functie, bèta-androgene activering en autofagische remming.

differentiation-imaging-brown-adipocytes-from-stromal-vascular

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Werkwijze van functionele beeldvorming van muis bruin vetweefsel (BAT) beschreven waarin koud-gestimuleerde opname van 18F-Fluorodeoxyglucose (FDG) in BAT niet-invasief gemeten met een gestandaardiseerd protocol micro-PET/CT. Deze methode is robuust en gevoelig zijn voor verschillen in BAT activiteiten in muismodellen detecteren.

Functionele Beeldvorming van bruin vet in Muizen met FDG micro-PET/CT

Primaire witte preadipocyten geïsoleerd van wit vetweefsel in muizen kunnen worden onderscheiden in beige / brite cellen. Hier wordt gepresenteerd is een betrouwbare cellulaire modelsysteem om de moleculaire regulatie van "bruinen" van wit vet te bestuderen.

Isolatie en differentiatie van Stroma vasculaire cellen te Beige / Brite Cellen

In dit videoverslag tonen we de toepassing van Cerenkov Luminescentie Beeldvorming (CLI) voor interscapulair bruin vetweefsel bij muizen onder geactiveerde en depressieve omstandigheden.

Cerenkov luminescentiebeeldvorming van interscapular Brown VetWeefsel

De hier gepresenteerde methode gebruikt 18F-Fluorodeoxyglucose (18F-FDG) positron emissie tomografie / computertomografie (PET-CT) en vet-water gescheiden magnetische resonantie beeldvorming (MRI), elk afgetast na 2 uur blootstelling aan thermisch (24 ° C ) en koude omstandigheden (17 ° C) om bruin vetweefsel (BAT) bij volwassen proefpersonen kaart.

Human Brown VetWeefsel Depots automatisch gesegmenteerd op basis van Positron Emissie Tomografie / Computed Tomography en geregistreerde Magnetic Resonance Images

Dit rapport beschrijft een protocol voor de gelijktijdige isolatie van primaire bruine en witte preadipocyten van pasgeboren muizen. Geïsoleerde cellen kunnen in cultuur worden gekweekt en worden geïnduceerd om zich te onderscheiden in volgroeide witte en bruine adipocyten. De methode maakt genetische, moleculaire en functionele karakterisering van primaire vetcellen in cultuur mogelijk.

Isolatie en differentiatie van primaire witte en bruine preadipocyten van pasgeboren muizen

Deze studie beschrijft een nieuwe methode voor het isoleren van muizenbruine adipocyten voor gen- en eiwitexpressieanalyse.

Het isoleren van bruine adipocyten uit murine interscapulair bruin vetweefsel voor gen- en eiwitexpressieanalyse

Functionele beeldvorming en kwantificering van thermogene vetdepots bij muizen met behulp van een micro-PET / MR-beeldvormingsgebaseerde benadering.

Visualisatie en kwantificering van bruine en beige vetweefsels bij muizen met behulp van [18F] FDG Micro-PET / MR Imaging

Hier presenteren we een protocol voor het meten van bruine vetweefselactiviteit na een maaltijd bij mensen en proefdieren.

Infraroodthermografie voor de detectie van veranderingen in de activiteit van bruin vetweefsel

Dit protocol beschrijft de semi-geautomatiseerde isolatie van de stromale vasculaire fractie (SVF) uit muizenvetweefsel om preadipocyten te verkrijgen en adipocytendifferentiatie in vitro te bereiken. Het gebruik van een weefseldissociator voor collagenasevertering vermindert experimentele variatie en verhoogt de reproduceerbaarheid.

Semi-geautomatiseerde isolatie van de stromale vasculaire fractie uit muizenwit vetweefsel met behulp van een weefseldissociator

Hier bieden we een praktische procedure voor het ontleden en uitvoeren van histologische en genexpressie-analyses van supraclaviculair bruin vetweefsel bij muizen.

Dissectie, histologische verwerking en genexpressieanalyse van supraclaviculaire bruine vetweefsel bij muizen

Leer de differentiatie van bruine adipocyten uit interscapulair vetweefsel van pasgeboren muizen. Dit protocol combineert immunofluorescentie en transmissie-elektronenmicroscopie voor gedetailleerde celanalyse en onderzoek naar thermogenese.

Differentiatie en beeldvorming van bruine vetcellen uit de stromale vasculaire fractie van interscapulier vetweefsel van pasgeboren muizen (Video) | JoVE Journal

Differentiatie en beeldvorming van bruine vetcellen uit de stromale vasculaire fractie van interscapulier vetweefsel van pasgeboren muizen

Meer video's verkennen