Generatie van Natural Killer Cellen uit Human Expanded Potential Stamcellen

Over significant gesproken, het genereren van NK-cellen uit een uitbreidbare bron is van cruciaal belang voor toepassingen zoals kankerimmunotherapie. Het voordeel van deze technologie is dat uitgebreide potentiële stamcellen met een bredere differentiatiecapaciteit kunnen worden gebruikt in plaats van gewone IP-cellen. Verwijder voor predifferentiatie van hEPSC's het hEPSC-medium waarin cellen werden onderhouden en voeg één milliliter DFK-medium toe.

Incubeer gedurende twee tot drie dagen bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Om de vorming van embryoïde lichamen te controleren, wast u na het verwijderen van het gebruikte DFK-medium de cellen eenmaal met één milliliter PBS. Voeg 500 microliter 0,05% trypsine toe en incubeer de plaat bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende drie tot zeven minuten, op basis van de morfologie.

Zodra het trypsine is verwijderd, en twee milliliter DFK-medium om de cellen te oogsten. Draai de cellen op 300 G gedurende drie minuten bij kamertemperatuur. Voeg na het verwijderen van het supernatant een milliliter DFK-medium en een microliter Y-27632 toe en resuspendeer de cellen door te vegen.

Tel de cellen met behulp van een hemocytometer en verdun de celsuspensie met DFK-medium en Y-27632 om 4.000 cellen per 25 microliter medium te verkrijgen. Plaats 30 tot 40 druppels celsuspensie op de dop van een petrischaaltje van 10 centimeter en giet wat PBS in de onderste schotel om verdamping van de druppels te voorkomen. Keer de dop voorzichtig om om het gerecht te bedekken en incubeer gedurende drie dagen bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.

Voor het verzamelen van de embryoïde lichamen uit de druppel, met behulp van een pipet van één milliliter met PBS, pompt u een beetje PBS in de druppel en zuigt u het medium uit, inclusief de embryoïde lichamen. Breng vervolgens deze embryoïde lichamen over in een buis van 15 milliliter en draai ze gedurende één minuut bij kamertemperatuur op 100 G. Voeg na het verwijderen van het supernatant een milliliter medium A toe.Breng de verzamelde embryoïde lichamen over naar een niet-adherente 24-well plaat en beschouw het als dag nul.

Om mesodermpatronen van de embryoïde lichamen uit te voeren, incubeer de plaat gedurende drie dagen bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide. Vervang op dag twee 500 microliter afgewerkt medium A door vers medium A van hetzelfde volume. Om hematoendotheliale specificatie van het embryoïde lichaam uit te voeren, verwijdert u 700 microliter medium A uit de put en voegt u gedurende zeven dagen hetzelfde volume medium B.Culture toe, waarbij u de halve media om de twee dagen verandert.

Om de embryoïde lichamen met patroon op een lucht / vloeistof-interface over te brengen, kantelt u de plaat enigszins zodat de embryoïde lichamen aan de onderkant aggregeren en verwijdert u met een pipet van één milliliter zoveel mogelijk van medium B. Pak nu de embryolichamen op met een pipet door het resterende medium aan te zuigen en breng ze over naar een trans-put in een 24-well plaat, om lymfoïde voorloperexpansie uit te voeren, voegt u 500 microliter NK-1-medium toe aan het onderste compartiment van de trans-put, cultuur gedurende 14 dagen, en voer om de andere dag een mediumverandering uit. Om de plaat te coaten, verdunt u het coatingmateriaal in PBS, voegt u een milliliter verdunde coatingoplossing toe aan elke put van een 12-wellsplaat en bedekt u de opening van de plaat met wikkelfolie.

Incubeer de plaat 's nachts op vier graden Celsius. Voeg 200 microliter PBS toe aan de transput en pipetteer langzaam op en neer ongeveer vijf tot zes keer om de cellen te oogsten die vrijkomen uit de organoïden. Breng de geoogste celsuspensie over in een buis van twee milliliter en draai de cellen op 500 G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.

Na het verwijderen van het supernatant, resuspenseren de cellen in een milliliter NK-1 medium. Verwijder alle coatingoplossing uit de put en was elke put van een 12-wells plaat twee keer met één milliliter PBS. Splits vervolgens de geoogste cellen in een verhouding van 1: 2 en breng de celsuspensie over op een gecoate 12-wellsplaat.

Voeg een milliliter NK-1 medium toe zodat elke put 1,5 milliliter medium heeft. Voor het veranderen van het medium, laat de cellen één tot twee minuten naar de bodem zinken. Zuig vervolgens voorzichtig 750 microliter medium uit en draai het naar beneden zoals eerder aangetoond.

Nadat u het supernatant hebt weggegooid, resuspendeert u de verkregen pellet in 750 microliter NK-1-medium door vijf tot zes keer te pipetteren en in de oorspronkelijke put over te brengen. In deze studie werden de hEPSC-afgeleide producten op het eindpunt geanalyseerd. Ongeveer 15% van de cellen die uit het 3D-kweeksysteem werden gedissocieerd uit twee batches geïnduceerd op verschillende tijdstippen waren CD3-negatief, CD56-positief en 16% van de cellen waren CD45-positief, CD-56-positief, wat in overeenstemming is met de percentages CD3-negatieve, CD56-positieve cellen die in eerdere onderzoeken werden gezien.

De percentages CD3-negatieve, CD56-positieve cellen in de cellen geoogst uit het 2D-kweeksysteem varieerden van 30 tot 6%De hEPSC-afgeleide producten tijdens dag 18-cultuur van het 2D-systeem vertoonden expressie van zowel ectopische CD56 als CD107a in 12% van de cellen na twee uur antilichaamstimulatie, en ongeveer 28% van de geoogste cellen waren CD94-positief, CD159a-positief. De in vitro differentiatieproducten werden getest op cytotoxiciteit tegen humane erythroleukemia cellen K562. Wanneer ze gedurende drie uur worden gecokweekt met tumordoelen, vertonen de gedifferentieerde producten een milde cytotoxiciteit in vergelijking met een interleukine 2-onafhankelijke permanente cellijn NK92mi-cellen.

Volgens deze methode kunnen cellen zoals T-cellen, B-cellen en erytrocyten worden gegenereerd.