Eencellige analyse van de expressie van Pseudomonas syringae-genen in het plantenweefsel

Ons protocol biedt een zachte planteninentings- en extractiemethode waarmee bacteriepopulaties die in de bladapoplast zijn gekweekt, kunnen worden hersteld die geschikt zijn voor eencellige genexpressieanalyse zoals flowcytometrie. Deze methode maakt de extractie van een aanzienlijke hoeveelheid bacteriën uit de apoplast mogelijk zonder de monsters aanzienlijk te besmetten met plantencellulair afval. Deze geoptimaliseerde methode voor het herstel van apoplastische bacteriën kan direct of met kleine aanpassingen worden toegepast op een aantal plantaardige bacteriële systemen die bestaan uit plantpathogene bacteriën of nuttige endocytische bacteriën.

De procedure wordt gedemonstreerd door Nieves Lopez-Pagan, een promovendus van ons laboratorium. Vul om te beginnen een pot met een diameter van 10 centimeter met eerder bewaterde 1:3 vermiculiet plantensubstraatmix. Dek de pot af met een geperforeerd metalen gaas en pas het metalen gaas aan op de natte grond met behulp van een elastiekje.

Zaai vervolgens Arabidopsis-zaden in de gaten van het metalen gaas met een natte tandenstoker. Plaats drie tot vier zaden op verre plaatsen in de pot. Bedek de pot met een plastic koepel om een hoge relatieve luchtvochtigheid te behouden en incuber voor stratificatie bij vier graden Celsius gedurende 72 uur.

Breng de pot over naar een plantengroeikamer onder omstandigheden van korte dagen. Om de pot bloot te leggen, verwijdert u de plastic koepel. Zodra de zaden zijn ontkiemd, gebruikt u het pincet om de meeste zaailingen te verwijderen en één zaailing in elk van de posities van de pot te houden.

Bereid vervolgens Phaseolus vulgaris bonenplanten door de bodem van een petrischaal te bedekken met een nat stuk keukenpapier en de bonenzaden erop te leggen. Sluit de petrischaal af met chirurgische tape en incubeer drie tot vier dagen bij 28 graden Celsius. Breng de gekiemde zaden over in een pot met een diameter van 10 centimeter gevuld met natte 1:3 vermiculiet plantensubstraatmix en incubeer in een plantengroeikamer onder langdurige omgevingen.

Streep de glycerolvoorraad van Pseudomonas syringae-stam van belang van min 80 graden Celsius uit in een LB-plaat aangevuld met de juiste antibiotica. Incubeer de plaat bij 28 graden Celsius gedurende 40 tot 48 uur. Schraap de bacteriële biomassa en resuspensie in vijf milliliter 10-millimolair magnesiumchloride.

Meet de optische dichtheid op 600 nanometer en stel deze in op 0,1 door 10 millimolair magnesiumchloride toe te voegen. Voer seriële verdunningen uit in 10-millimolair magnesiumchloride om een uiteindelijke entconcentratie van vijf keer 10 tot de vijfde CFU per milliliter te krijgen. Bereid vervolgens 200 milliliter entmateriaal voor de Arabidopsis-planten en 50 milliliter voor de bonenplanten.

Voeg vóór de inenting de oppervlakteactieve stof Silwet L-77 toe aan een eindconcentratie van 0,02% voor boneninenting en 0,01% voor Arabidopsis. Voor Arabidopsis-infiltratie plaatst u twee houten stokken die een X vormen over de pot en plaatst u de pot met de voorkant naar beneden over een petrischaal met een diameter van 14 centimeter met 200 milliliter entmateriaal. Voor inenting van bonenbladeren plaatst u de planten en de entoplossing in een vacuümkamer en brengt u het blad in een conische centrifugebuis van 50 milliliter met het entmateriaal.

Geef een puls van 500 millibar gedurende 30 seconden om de bladeren te infiltreren. Giet de overtollige entoplossing af met een stuk papier en breng de plannen terug naar de bijbehorende groeikamer. Snijd vier dagen na de inenting het bovenste deel van de Arabidopsis-plant of het geënte blad van de bonenplant en plaats het in een spuit van 20 milliliter zonder naald.

Voor bonenbladeren rolt u het blad op zichzelf en laat u het abaxiale gezicht naar buiten. Voeg voldoende volume gedestilleerd water toe om het weefsel te bedekken. Plaats vervolgens de zuiger die de spuit rechtop houdt en verwijder de overtollige lucht en luchtbellen in de spuit door zachtjes op het vat te tikken totdat alle lucht zich in de buurt van de punt bevindt en, na het verwijderen van de lucht, bedek de punt van de spuitvat met paraffinefilm.

Druk nu voorzichtig op de zuiger om positieve druk te genereren totdat het weefsel donkerder wordt. Trek vervolgens aan de zuiger om negatieve druk te genereren. Verwijder de paraffinefilm en de zuiger en verzamel de vloeistof met de apoplast-geëxtraheerde bacteriën.

Bereid voor een eencellige analyse een 1,5% agarose-oplossing in gedestilleerd water. Eenmaal gesmolten, voeg je voldoende volume toe om de ruimte tussen twee microscopiedia's naast elkaar te vullen en plaats je er nog een dia op. Laat ze 15 minuten rijden en verwijder de schuif die op de bovenkant is geplaatst voorzichtig.

Snijd met een mesje het agarosekussen voor gebruik in stukjes van vijf millimeter bij vijf millimeter. Parallel centrifugeer je een millimeter van de apoplast-geëxtraheerde bacteriën. Verwijder het supernatant voorzichtig met behulp van een pipet en resuspensie de pellet in 20 microliter water om de cellen te concentreren.

Plaats een druppel van twee microliter van de geconcentreerde cellen op een afdekplaat van 0,17 millimeter en bedek de druppel met een stuk agarosepad. Visualiseer het bacteriële preparaat onder de confocale microscoop om groene fluorescerende bacteriën te identificeren met behulp van specifieke lasers. Identificeer alle bacteriën met behulp van het heldere veld en voeg beide velden samen.

Om de analyse door flowcytometrie uit te voeren, neemt u een aliquot van de apoplast-geëxtraheerde bacteriesuspensies. Analyseer met behulp van de flowcytometer en verzamel 100.000 gebeurtenissen. Expressie van hrpL GFP wordt gecontroleerd door GFP-fluorescentie.

De dot plot grafieken tonen de fluorescentie-intensiteitsverdeling van GFP versus celgrootte in de populatie, terwijl de histogrammen de fluorescentie-intensiteit van GFP versus celtellingen tonen. De hrpL ON percentages waren hoger dan de overeenkomstige percentages van hrpL OFF. Fluorescentie microscopie beelden tonen heterogene niveaus van GFP geassocieerd met de expressie van hrpL.

De bacteriën met een lage of geen GFP-fluorescentie worden waargenomen. Voor optimale resultaten, wees voorzichtig tijdens de bacterie-extractiestappen om te voorkomen dat het plantenweefsel wordt beschadigd en zo besmetting door de cellulaire inhoud van de plant wordt beperkt. De verkregen bacteriemonsters kunnen worden gebruikt voor andere doeleinden waar het verminderen van plantenverontreiniging een voordeel is, zoals nucleïnezuurextracties voor daaropvolgende bacteriële genomische of transcriptomische analyse.