Name: Eencellige analyse van de expressie van Pseudomonas syringae-genen in het plantenweefsel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Leer een geoptimaliseerde methode voor eencellige genexpressie-analyse van Pseudomonas syringae in plantaapoplast met flowcytometrie. Deze techniek minimaliseert plantverontreiniging en is toepasbaar op diverse plant-bacteriesystemen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door projectsubsidie RTI2018-095069-B-I00, gefinancierd door MCIN/AEI/10.13039/501100011033/ en door "ERDP: A way of making Europe". J.S.R. werd gefinancierd door Plan Andaluz de Investigación, Desarrollo e Innovación (PAIDI 2020). N.L.P. werd gefinancierd door Project Grant P18-RT-2398 van Plan Andaluz de Investigación, Desarrollo e Innovación.

1. Plantvoorbereiding
<ol><li>Bereid Arabidopsis Col-0 planten voor volgens de onderstaande stappen.<ol><li>Vul een pot met een diameter van 10 cm met een 1:3 vermiculiet-plantensubstraatmengsel (zie materiaaltabel), eerder bewaterd, en bedek de pot met een metalen gaas van 15 cm x 15 cm met gaten van 1,6 mm x 1,6 mm. Pas het metalen gaas aan op de natte grond met behulp van een elastiekje (figuur 1A).</li>
		<li>Zaai met een natte tandenstoker Arabidopsis-zaden in de gaten van het metalen gaas. Plaats drie tot vier zaden op verre plaatsen in de pot (figuur 1B, C).</li>
		<li>Bedek de potten met een plastic koepel om een hoge relatieve luchtvochtigheid te behouden en incuber ze gedurende 72 uur bij 4 °C voor stratificatie. OPMERKING: Stratificatie (incubatie bij hoge luchtvochtigheid en lage temperatuur, zoals beschreven) verbetert de kiemsnelheid en synchronisatie van de zaden.</li>
		<li>Breng de potten over naar een plantengroeikamer onder omstandigheden van korte dagen (8 uur licht/16 uur donker bij 21 °C, lichtintensiteit: 100 μmol·m−2·s−1, relatieve vochtigheid: 70%).</li>
		<li>Gebruik na het ontkiemen van het zaad (8-10 dagen) het pincet om de meeste zaailingen te verwijderen en houd één zaailing in elk van de posities van de pot (zes zaailingen / pot) (figuur 1D). Verwijder de plastic koepel om de potten bloot te leggen. OPMERKING: De planten zijn 4-5 weken na ontkieming klaar voor gebruik.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereid Phaseolus vulgaris bonen (cultivar Canadian Wonder) planten.<ol><li>Bedek de bodem van een petrischaaltje met een nat stuk handdoekpapier en leg de bonenpitten erop. Sluit de petrischaal af met chirurgische tape en incubeer gedurende 3-4 dagen bij 28 °C (figuur 2A).</li>
		<li>Breng de gekiemde zaden over in een pot met een diameter van 10 cm gevuld met natte 1:3 vermiculiet-plant substraatmix.</li>
		<li>Incubeer in een plantengroeikamer onder langdurige omgevingen (16 uur licht/8 uur donker bij 23 °C, lichtintensiteit: 100 μmol·m−2·s−1, relatieve vochtigheid: 70%). OPMERKING: De planten zijn 10 dagen na ontkieming klaar voor gebruik (figuur 2B).</li>
	</ol></li>
</ol>2. Inenting van Arabidopsis en bonenplanten
OPMERKING: In deze studie hebben de stammen P. syringae pv. tomaat DC3000 en P. syringae pv. phaseolicola 1448A werden gebruikt.
<ol><li>Bereid het P. syringae inoculum.<ol><li>Streep de P. syringae-stam van belang uit een glycerolvoorraad van −80 °C op een LB-plaat (10 g/L trypton, 5 g/L NaCl, 5 g/L gistextract en 16 g/L bacteriologische agar, zie tabel met materialen) aangevuld met de juiste antibiotica. Incubeer bij 28 °C gedurende 40-48 uur. OPMERKING: Het gebruik van antibiotica wordt aanbevolen als de betreffende stam een plasmide of een genomisch resistentiegen draagt. De aanbevolen antibioticaconcentraties voor P. syringae zijn als volgt: kanamycine (15 μg/ml), gentamycine (10 μg/ml), ampicilline (300 μg/ml) (zie materiaaltabel).</li>
		<li>Schraap de bacteriële biomassa eruit en resuspensie in 5 ml van 10 mM MgCl2. Meet de OD600 en stel in op 0,1 door 10 mM MgCl2 toe te voegen. OPMERKING: Een OD600 van 0,1 van een P. syringae cultuur komt overeen met 5 x 107 CFU·ml−1.</li>
		<li>Voer seriële verdunningen uit tot 10 mM MgCl2 om een uiteindelijke entconcentratie van 5 x 105 CFU·ml−1 te bereiken. Bereid 200 ml entmateriaal voor de Arabidopsis-planten en 50 ml voor de bonenplanten.</li>
		<li>Voeg vlak voor de inenting de oppervlakteactieve stof Silwett L-77 (zie materiaaltabel) toe aan een eindconcentratie van 0,02% voor boneninenting en 0,01% voor Arabidopsis. Merk op dat Silwett enigszins schadelijk is voor het Arabidopsis-weefsel.</li>
	</ol></li>
	<li>Voer vacuüminfiltratie uit.<ol><li>Voor Arabidopsis-infiltratie plaatst u twee houten stokken die een X vormen over de pot (figuur 1E) en plaatst u de pot met de voorkant naar beneden over een petrischaal met een diameter van 14 cm met het entmateriaal van 200 ml (figuur 1F).</li>
		<li>Voor inenting van bonenbladeren brengt u het blad in een conische centrifugebuis van 50 ml met het entmateriaal (figuur 2C).</li>
		<li>Steek de in de entoplossing ondergedompelde planten in een vacuümkamer (figuur 1G en figuur 2D) en geef gedurende 30 s een puls van 500 mbar om de bladeren te infiltreren. Herhaal de vacuümpuls 2-3 keer totdat het blad volledig is geïnfiltreerd (figuur 1H en figuur 2E).</li>
		<li>Giet de overtollige entoplossing af met een stuk papier en breng de planten terug naar hun overeenkomstige groeikamer.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Extractie van bacteriën uit de apoplast
<ol><li>Snijd vier dagen na inenting het bovengrondse deel van de Arabidopsis-plant of het geënte blad van de bonenplant en plaats het in een spuit van 20 ml zonder naald (figuur 2G). Voor bonenbladeren rolt u het blad op zichzelf en laat u het abaxiale gezicht naar buiten, zoals weergegeven in figuur 2F.</li>
	<li>Voeg voldoende volume gedestilleerd water toe om het weefsel te bedekken (meestal 10-15 ml).</li>
	<li>Plaats de zuiger en verwijder met de spuit in de verticale positie met de punt naar boven gericht de overtollige lucht en luchtbellen in de spuit door zachtjes op de cilinder te tikken totdat alle lucht zich in de buurt van de punt bevindt. Schuif vervolgens de zuiger om de lucht eruit te halen. Zodra er zo min mogelijk lucht in de spuit zit, bedek je de punt van het spuitvat met paraffinefilm.</li>
	<li>Druk voorzichtig op de zuiger om positieve druk te genereren totdat het weefsel donkerder wordt (figuur 1I en figuur 2H). Trek vervolgens aan de zuiger om negatieve druk te genereren (figuur 1J en figuur 2I). Herhaal deze stap 3-5 keer.</li>
	<li>Verwijder de paraffinefilm en de zuiger en vang de vloeistof op die de met apoplast geëxtraheerde bacteriën bevat, zoals in figuur 2J.</li>
</ol>4. Eencellige analyse van de apoplast-geëxtraheerde bacteriën
<ol><li>Visualiseer door confocale microscopie volgens de onderstaande stappen.<ol><li>Bereid een 1,5% agarose-oplossing in gedestilleerd water. Eenmaal gesmolten, voeg je voldoende volume toe om de ruimte tussen twee naast elkaar geplaatste microscopiedia's te vullen en plaats je er nog een dia bovenop (figuur 3). Laat ze 15 minuten drogen en verwijder voorzichtig de schuif die op de bovenkant is geplaatst. Snijd met een mesje de agarose pad vlak voor gebruik in stukjes van 5 mm x 5 mm.</li>
		<li>Centrifugeer parallel 1 ml van de apoplast-geëxtraheerde bacteriën bij 12.000 x g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur, verwijder het supernatant voorzichtig met behulp van een pipet en resuspensie de pellet in 20 μL water om de cellen te concentreren. Plaats een druppel van 2 μL van de geconcentreerde cellen op een dekplaat van 0,17 mm en bedek de druppel met een stuk van 5 mm x 5 mm van het agarosekussen dat eerder in stap 1 is verkregen, zoals weergegeven in figuur 3.</li>
		<li>Visualiseer het bacteriepreparaat onder de confocale microscoop (zie materiaaltabel). Om groen-fluorescerende bacteriën te identificeren, gebruikt u de excitatielaser bij 488 nm en een emissiefilter van 500 nm tot 550 nm. Om alle bacteriën te identificeren, gebruikt u het heldere veld en voegt u beide velden samen.</li>
		<li>Verwerk de confocale beelden met Fiji (zie Materiaaltabel). Gebruik hiervoor de MicrobeJ-plug-in om de contouren van de bacteriële cel te identificeren en de fluorescentie-intensiteit binnenin te meten. OPMERKING: Beeldacquisitie van geïsoleerde bacteriën (niet geclusterd) wordt aanbevolen voor deze analyse.</li>
	</ol></li>
	<li>Voer analyse uit met behulp van flowcytometrie.<ol><li>Neem een aliquot van de apoplast-geëxtraheerde bacteriesuspensies om te analyseren met behulp van de flow-cytometer. Verwerf 100.000 evenementen.</li>
		<li>Om onderscheid te maken tussen bacteriën en plantenresten, analyseert u de apoplast die is geëxtraheerd uit een niet-geënte plant en vergelijkt u de dot plot met de forward scatter (FSC) celgrootte versus side scatter (SSC) celgrootte met die van de apoplast-geëxtraheerde bacteriële suspensie. Om niet-fluorescerende bacteriën te identificeren, gebruikt u de apoplasten die zijn geëxtraheerd uit de planten die zijn ingeënt met niet-fluorescerende isogene bacteriën en vergelijkt u hun fluorescerende emissies.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Weigel, W. A., Dersch, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+heterogeneity%3A+A+bacterial+virulence+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Phenotypic heterogeneity: A bacterial virulence strategy.</a> Microbes and Infection. 20 (9-10), 570-577 (2018).</li>
<li>Hare, P. J., LaGree, T. J., Byrd, B. A., DeMarco, A. M., Mok, W. W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+technologies+to+study+phenotypic+heterogeneity+and+bacterial+persisters%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Single-cell technologies to study phenotypic heterogeneity and bacterial persisters.</a> Microorganisms. 9 (11), 2277(2021).</li>
<li>Mansfield, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Top+10+plant+pathogenic+bacteria+in+molecular+plant+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology.</a> Molecular Plant Pathology. 13 (6), 614-629 (2012).</li>
<li>Morris, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+life+history+of+the+plant+pathogen+Pseudomonas+syringae+is+linked+to+the+water+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">The life history of the plant pathogen Pseudomonas syringae is linked to the water cycle.</a> The ISME Journal. 2 (3), 321-334 (2008).</li>
<li>Rufián, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+microscopy+reveals+in+planta+dynamic+interactions+between+pathogenic%2C+avirulent+and+non-pathogenic+Pseudomonas+syringae+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Confocal microscopy reveals in planta dynamic interactions between pathogenic, avirulent and non-pathogenic Pseudomonas syringae strains.</a> Molecular Plant Pathology. 19 (3), 537-551 (2018).</li>
<li>Macho, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subversion+of+plant+cellular+functions+by+bacterial+type-III+effectors%3A+Beyond+suppression+of+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Subversion of plant cellular functions by bacterial type-III effectors: Beyond suppression of immunity.</a> New Phytologist. 210 (1), 51-57 (2016).</li>
<li>Xiao, Y., Hutcheson, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+promoter+sequence+recognized+by+a+newly+identified+alternate+sigma+factor+directs+expression+of+pathogenicity+and+host+range+determinants+in+Pseudomonas+syringae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">A single promoter sequence recognized by a newly identified alternate sigma factor directs expression of pathogenicity and host range determinants in Pseudomonas syringae.</a> Journal of Bacteriology. 176 (10), 3089-3091 (1994).</li>
<li>Rufián, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+chromosome-located+transcriptional+fusions+to+fluorescent+proteins+for+single-cell+gene+expression+analysis+in+Pseudomonas+syringae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Generating chromosome-located transcriptional fusions to fluorescent proteins for single-cell gene expression analysis in Pseudomonas syringae.</a> Methods in Molecular Biology. 1734, 183-199 (2018).</li>
<li>Rufian, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+syringae+differentiates+into+phenotypically+distinct+subpopulations+during+colonization+of+a+plant+host%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas syringae differentiates into phenotypically distinct subpopulations during colonization of a plant host.</a> Environmental Microbiology. 18 (10), 3593-3605 (2016).</li>
<li>Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+thaliana-Pseudomonas+syringae+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Arabidopsis+Book%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction.</a> Arabidopsis Book. 1, 0039(2002).</li>
<li>Fouts, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomewide+identification+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+DC3000+promoters+controlled+by+the+HrpL+alternative+sigma+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Genomewide identification of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 promoters controlled by the HrpL alternative sigma factor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (4), 2275-2280 (2002).</li>
<li>Huber, P. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHuber%2C+PJ+%22Robust+Statistics%22">Robust Statistics</a>. , Wiley. New York, NY. (1981).</li>
<li>Freed, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+screen+to+identify+promoters+conferring+high+levels+of+phenotypic+noise%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A simple screen to identify promoters conferring high levels of phenotypic noise.</a> PLoS Genetics. 4 (12), 1000307(2008).</li>
<li>Hirano, S. S., Upper, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteria+in+the+leaf+ecosystem+with+emphasis+on+Pseudomonas+syringae-a+pathogen%2C+ice+nucleus%2C+and+epiphyte%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Bacteria in the leaf ecosystem with emphasis on Pseudomonas syringae-a pathogen, ice nucleus, and epiphyte.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (3), 624-653 (2000).</li>
<li>Lindeberg, M., Myers, C. R., Collmer, A., Schneider, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roadmap+to+new+virulence+determinants+in+Pseudomonas+syringae%3A+Insights+from+comparative+genomics+and+genome+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">Roadmap to new virulence determinants in Pseudomonas syringae: Insights from comparative genomics and genome organization.</a> Molecular Plant Microbe Interactions. 21 (6), 685-700 (2008).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+leaf+infiltration+assay+for+fine+characterization+of+plant+defense+responses+using+the+Arabidopsis+thaliana-Pseudomonas+syringae+pathosystem%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Bacterial leaf infiltration assay for fine characterization of plant defense responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae pathosystem.</a> Journal of Visualized Experiments. (104), e53364(2015).</li>
<li>O'Leary, B. M., Rico, A., McCraw, S., Fones, H. N., Preston, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+infiltration-centrifugation+technique+for+extraction+of+apoplastic+fluid+from+plant+leaves+using+Phaseolus+vulgaris+as+an+example%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The infiltration-centrifugation technique for extraction of apoplastic fluid from plant leaves using Phaseolus vulgaris as an example.</a> Journal of Visualized Experiments. (94), e52113(2014).</li>
<li>Tornero, P., Dangl, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+method+for+quantifying+growth+of+phytopathogenic+bacteria+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">A high-throughput method for quantifying growth of phytopathogenic bacteria in Arabidopsis thaliana.</a> The Plant Journal. 28 (4), 475-481 (2001).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De hier gepresenteerde methode beschrijft een niet-invasieve procedure die de infiltratie van bacteriën in het bladweefsel van planten mogelijk maakt, waardoor de snelle inenting van grote volumes mogelijk is en tegelijkertijd weefselverstoring wordt geminimaliseerd. Een van de kenmerken van het P. syringae-soortencomplex is het vermogen om te overleven en zich te vermenigvuldigen in de plantenapoplast en op het plantoppervlak als epifyt14. De mogelijkheid dat de bacteriën die volgens het...

Pathogene bacteriën vertonen verschillen in verschillende fenotypen, wat aanleiding geeft tot de vorming van subpopulaties binnen genetisch identieke populaties. Dit fenomeen staat bekend als fenotypische heterogeniteit en is voorgesteld als een aanpassingsstrategie tijdens interacties tussen bacteriënen gastheer 1. Recente ontwikkelingen in de optische resolutie van confocale microscopen, flowcytometrie en microfluïdica, gecombineerd met fluorescerende eiwitten, hebben eencellige analyses van bacteriële populaties bevorderd2.
De Gram-negatieve Pseudomonas syringae is een archetypische plantpathogene bacterie vanwege zowel zijn academische als economische belang3. De levenscyclus van P. syringae is gekoppeld aan de watercyclus4. P. syringae komt de intercellulaire ruimtes tussen de mesofylcellen, de apoplast van het plantenblad, binnen via natuurlijke openingen zoals huidmondjes of wonden5. Eenmaal in de apoplast vertrouwt P. syringae op het type III-secretiesysteem (T3SS) en de type III-getransloceerde effectoren (T3E) om de immuniteit van planten te onderdrukken en de cellulaire functies van planten te manipuleren ten behoeve van de ziekteverwekker6. De expressie van T3SS en T3E is afhankelijk van de hoofdregulator HrpL, een alternatieve sigmafactor die zich bindt aan de hrp-boxmotieven in het promotorgebied van dedoelgenen 7. 
Door chromosoom-gelokaliseerde transcriptionele fusies te genereren naar fluorescerende eiwitgenen stroomafwaarts van het gen van belang, kan men genexpressie volgen op basis van de fluorescentieniveaus die worden uitgezonden op het niveau van één cel8. Met behulp van deze methode is vastgesteld dat de expressie van hrpL heterogeen is, zowel binnen bacterieculturen die in het laboratorium worden gekweekt als binnen bacteriepopulaties die zijn hersteld uit de plant apoplast 8,9. Hoewel genexpressieanalyse op eencellig niveau meestal wordt uitgevoerd in bacterieculturen die in laboratoriummedia worden gekweekt, kunnen dergelijke analyses ook worden uitgevoerd op bacteriepopulaties die in de plant groeien, waardoor waardevolle informatie wordt verkregen over de vorming van subpopulaties in de natuurlijke context. Een mogelijke beperking voor de analyse van bacteriële populaties die uit de plant worden geëxtraheerd, is dat klassieke inentingsmethoden door infiltratie van de spuitdruk in de apoplast, gevolgd door bacteriële extractie door maceratie van het bladweefsel, meestal een grote hoeveelheid cellulair plantenresten genereren die de stroomafwaartse analyse verstoort10. Het meeste cellulaire puin bestaat uit autofluorescerende fragmenten van chloroplasten die overlappen met GFP-fluorescentie, wat resulteert in misleidende resultaten.
Het huidige protocol beschrijft het proces van het analyseren van heterogeniteit van eencellige genexpressie in twee modelpathosystemen: die gevormd door de P. syringae pv. tomatenstam DC3000 en Arabidopsis thaliana (Col-0), en de andere door de P. syringae pv. phaseolicola stam 1448A en bonenplanten (Phaseolus vulgaris cultivar Canadian Wonder). Een inentingsmethode wordt voorgesteld op basis van vacuüminfiltratie met behulp van een vacuümkamer en een pomp, wat resulteert in een snelle en schadevrije methode om hele bladeren te infiltreren. Bovendien wordt, als een verbetering van conventionele protocollen, een zachtere methode gebruikt om de bacteriële populatie uit de apoplast te extraheren die weefselverstoring aanzienlijk vermindert, gebaseerd op de extractie van apoplastische vloeistof door cycli van positieve en negatieve druk toe te passen met behulp van een kleine hoeveelheid volume in een spuit.

<table><tbody><tr><td>0.17 mm coverslip</td><td></td><td></td><td>Geen speciale vereisten</td></tr><tr><td>1.6 x 1.6 mm metal mesh</td><td>Buzifu</td><td></td><td>Fiberglas zeef</td></tr><tr><td>10 cm diameter potten</td><td></td><td></td><td>Geen speciale vereisten</td></tr><tr><td>140 mm Petri schotels</td><td></td><td></td><td>Geen speciale vereisten</td></tr><tr><td>20 mL spuit</td><td></td><td></td><td>Geen speciale vereisten</td></tr><tr><td>50 mL conische buisjes</td><td>Sarstedt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Merk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ampicilline natrium</td><td>GoldBio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacteriologische agar</td><td>Roko</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocale microscoop Stellaris</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSVerse celanalyzer</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gentamicilline sulfaat</td><td>Duchefa</td><td>G-0124</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin monosulfaat</td><td>Phytotechnology</td><td>K378</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Merk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Pechiney Plastic Packaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plantensubstraat</td><td></td><td></td><td>Geen speciale vereisten</td></tr><tr><td>Silwet L-77</td><td>Cromton Europe Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tandenstokers</td><td></td><td></td><td>Geen speciale vereisten</td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Merk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pincet</td><td></td><td></td><td>Geen speciale vereisten</td></tr><tr><td>Vacuumkamer 25 cm diameter</td><td>Kartell</td><td>554</td><td></td></tr><tr><td>Vacuumpomp</td><td>GAST</td><td>DOA-P504-BN</td><td></td></tr><tr><td>Vermiculiet</td><td></td><td></td><td>Geen speciale vereisten</td></tr><tr><td>Gist Extract</td><td>Merk</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

eencellige analyse van de expressie van pseudomonas syringae-genen in het plantenweefsel

Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue

Een overvloed aan pathogene micro-organismen vallen voortdurend planten aan. Het Pseudomonas syringae-soortencomplex omvat Gram-negatieve plantpathogene bacteriën van bijzonder belang voor een groot aantal gastheren. P. syringae komt de plant binnen vanaf het bladoppervlak en vermenigvuldigt zich snel binnen de apoplast en vormt microkolonies die de intercellulaire ruimte bezetten. De constitutieve expressie van fluorescerende eiwitten door de bacteriën maakt visualisatie van de microkolonies mogelijk en monitoring van de ontwikkeling van de infectie op microscopisch niveau. Recente ontwikkelingen in eencellige analyse hebben de grote complexiteit aangetoond die wordt bereikt door klonale isogene bacteriële populaties. Deze complexiteit, fenotypische heterogeniteit genoemd, is het gevolg van cel-tot-cel verschillen in genexpressie (niet gekoppeld aan genetische verschillen) tussen de bacteriële gemeenschap. Om de expressie van individuele loci op eencellig niveau te analyseren, zijn transcriptionele fusies met fluorescerende eiwitten op grote schaal gebruikt. Onder stressomstandigheden, zoals die optreden tijdens de kolonisatie van de apoplast van de plant, differentieert P. syringae in verschillende subpopulaties op basis van de heterogene expressie van belangrijke virulentiegenen (d.w.z. het Hrp type III-secretiesysteem). Eencellige analyse van een bepaalde P. syringae-populatie hersteld uit plantenweefsel is echter een uitdaging vanwege het cellulaire puin dat vrijkomt tijdens de mechanische verstoring die inherent is aan de inentings- en bacteriële extractieprocessen. Het huidige rapport beschrijft een methode die is ontwikkeld om de expressie van P. syringae-genen van belang op eencellig niveau te volgen tijdens de kolonisatie van Arabidopsis en bonenplanten. De bereiding van de planten en de bacteriële suspensies die worden gebruikt voor inenting met behulp van een vacuümkamer worden beschreven. Het herstel van endofytische bacteriën uit geïnfecteerde bladeren door apoplastische vloeistofextractie wordt hier ook uitgelegd. Zowel de bacteriële inentings- als de bacteriële extractiemethoden zijn empirisch geoptimaliseerd om schade aan planten en bacteriële cellen te minimaliseren, wat resulteert in bacteriële preparaten die optimaal zijn voor microscopie en flowcytometrie-analyse.

De expressie van het type III secretiesysteem is essentieel voor de bacteriegroei in de plant. De tijdige expressie van T3SS-genen wordt bereikt door ingewikkelde regulatie, met als middelpunt de extracytoplasmatische functie (ECF) sigmafactor HrpL, de belangrijkste activator van de expressie van T3SS-gerelateerde genen11. Een analyse van de expressie van hrpL werd eerder uitgevoerd met behulp van een chromosoom-gelokaliseerde transcriptionele fusie naar een downstream promotorloos gf...

Het huidige protocol beschrijft een methode die eencellige genexpressieanalyse mogelijk maakt op Pseudomonas syringae-populaties die in de apoplast van de plant worden gekweekt.

Eencellige analyse van de expressie van Pseudomonas syringae-genen in het plantenweefsel

A plethora of pathogenic microorganisms constantly attack plants. The Pseudomonas syringae species complex encompasses Gram-negative plant-pathogenic ...

Ons protocol biedt een zachte planteninentings- en extractiemethode waarmee bacteriepopulaties die in de bladapoplast zijn gekweekt, kunnen worden hersteld die geschikt zijn voor eencellige genexpressieanalyse zoals flowcytometrie. Deze methode maakt de extractie van een aanzienlijke hoeveelheid bacteriën uit de apoplast mogelijk zonder de monsters aanzienlijk te besmetten met plantencellulair afval. Deze geoptimaliseerde methode voor het herstel van apoplastische bacteriën kan direct of met kleine aanpassingen worden toegepast op een aantal plantaardige bacteriële systemen die bestaan uit plantpathogene bacteriën of nuttige endocytische bacteriën.De procedure wordt gedemonstreerd door Nieves Lopez-Pagan, een promovendus van ons laboratorium. Vul om te beginnen een pot met een diameter van 10 centimeter met eerder bewaterde 1:3 vermiculiet plantensubstraatmix. Dek de pot af met een geperforeerd metalen gaas en pas het metalen gaas aan op de natte grond met behulp van een elastiekje.Zaai vervolgens Arabidopsis-zaden in de gaten van het metalen gaas met een natte tandenstoker. Plaats drie tot vier zaden op verre plaatsen in de pot. Bedek de pot met een plastic koepel om een hoge relatieve luchtvochtigheid te behouden en incuber voor stratificatie bij vier graden Celsius gedurende 72 uur.Breng de pot over naar een plantengroeikamer onder omstandigheden van korte dagen. Om de pot bloot te leggen, verwijdert u de plastic koepel. Zodra de zaden zijn ontkiemd, gebruikt u het pincet om de meeste zaailingen te verwijderen en één zaailing in elk van de posities van de pot te houden.Bereid vervolgens Phaseolus vulgaris bonenplanten door de bodem van een petrischaal te bedekken met een nat stuk keukenpapier en de bonenzaden erop te leggen. Sluit de petrischaal af met chirurgische tape en incubeer drie tot vier dagen bij 28 graden Celsius. Breng de gekiemde zaden over in een pot met een diameter van 10 centimeter gevuld met natte 1:3 vermiculiet plantensubstraatmix en incubeer in een plantengroeikamer onder langdurige omgevingen.Streep de glycerolvoorraad van Pseudomonas syringae-stam van belang van min 80 graden Celsius uit in een LB-plaat aangevuld met de juiste antibiotica. Incubeer de plaat bij 28 graden Celsius gedurende 40 tot 48 uur. Schraap de bacteriële biomassa en resuspensie in vijf milliliter 10-millimolair magnesiumchloride.Meet de optische dichtheid op 600 nanometer en stel deze in op 0,1 door 10 millimolair magnesiumchloride toe te voegen. Voer seriële verdunningen uit in 10-millimolair magnesiumchloride om een uiteindelijke entconcentratie van vijf keer 10 tot de vijfde CFU per milliliter te krijgen. Bereid vervolgens 200 milliliter entmateriaal voor de Arabidopsis-planten en 50 milliliter voor de bonenplanten.Voeg vóór de inenting de oppervlakteactieve stof Silwet L-77 toe aan een eindconcentratie van 0,02% voor boneninenting en 0,01% voor Arabidopsis. Voor Arabidopsis-infiltratie plaatst u twee houten stokken die een X vormen over de pot en plaatst u de pot met de voorkant naar beneden over een petrischaal met een diameter van 14 centimeter met 200 milliliter entmateriaal. Voor inenting van bonenbladeren plaatst u de planten en de entoplossing in een vacuümkamer en brengt u het blad in een conische centrifugebuis van 50 milliliter met het entmateriaal.Geef een puls van 500 millibar gedurende 30 seconden om de bladeren te infiltreren. Giet de overtollige entoplossing af met een stuk papier en breng de plannen terug naar de bijbehorende groeikamer. Snijd vier dagen na de inenting het bovenste deel van de Arabidopsis-plant of het geënte blad van de bonenplant en plaats het in een spuit van 20 milliliter zonder naald.Voor bonenbladeren rolt u het blad op zichzelf en laat u het abaxiale gezicht naar buiten. Voeg voldoende volume gedestilleerd water toe om het weefsel te bedekken. Plaats vervolgens de zuiger die de spuit rechtop houdt en verwijder de overtollige lucht en luchtbellen in de spuit door zachtjes op het vat te tikken totdat alle lucht zich in de buurt van de punt bevindt en, na het verwijderen van de lucht, bedek de punt van de spuitvat met paraffinefilm.Druk nu voorzichtig op de zuiger om positieve druk te genereren totdat het weefsel donkerder wordt. Trek vervolgens aan de zuiger om negatieve druk te genereren. Verwijder de paraffinefilm en de zuiger en verzamel de vloeistof met de apoplast-geëxtraheerde bacteriën.Bereid voor een eencellige analyse een 1,5% agarose-oplossing in gedestilleerd water. Eenmaal gesmolten, voeg je voldoende volume toe om de ruimte tussen twee microscopiedia's naast elkaar te vullen en plaats je er nog een dia op. Laat ze 15 minuten rijden en verwijder de schuif die op de bovenkant is geplaatst voorzichtig.Snijd met een mesje het agarosekussen voor gebruik in stukjes van vijf millimeter bij vijf millimeter. Parallel centrifugeer je een millimeter van de apoplast-geëxtraheerde bacteriën. Verwijder het supernatant voorzichtig met behulp van een pipet en resuspensie de pellet in 20 microliter water om de cellen te concentreren.Plaats een druppel van twee microliter van de geconcentreerde cellen op een afdekplaat van 0,17 millimeter en bedek de druppel met een stuk agarosepad. Visualiseer het bacteriële preparaat onder de confocale microscoop om groene fluorescerende bacteriën te identificeren met behulp van specifieke lasers. Identificeer alle bacteriën met behulp van het heldere veld en voeg beide velden samen.Om de analyse door flowcytometrie uit te voeren, neemt u een aliquot van de apoplast-geëxtraheerde bacteriesuspensies. Analyseer met behulp van de flowcytometer en verzamel 100.000 gebeurtenissen. Expressie van hrpL GFP wordt gecontroleerd door GFP-fluorescentie.De dot plot grafieken tonen de fluorescentie-intensiteitsverdeling van GFP versus celgrootte in de populatie, terwijl de histogrammen de fluorescentie-intensiteit van GFP versus celtellingen tonen. De hrpL ON percentages waren hoger dan de overeenkomstige percentages van hrpL OFF. Fluorescentie microscopie beelden tonen heterogene niveaus van GFP geassocieerd met de expressie van hrpL.De bacteriën met een lage of geen GFP-fluorescentie worden waargenomen. Voor optimale resultaten, wees voorzichtig tijdens de bacterie-extractiestappen om te voorkomen dat het plantenweefsel wordt beschadigd en zo besmetting door de cellulaire inhoud van de plant wordt beperkt. De verkregen bacteriemonsters kunnen worden gebruikt voor andere doeleinden waar het verminderen van plantenverontreiniging een voordeel is, zoals nucleïnezuurextracties voor daaropvolgende bacteriële genomische of transcriptomische analyse.

single-cell-analysis-expression-pseudomonas-syringae-genes-within

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De moleculaire basis van ruimtelijke-specifieke fytochroom reacties wordt onderzocht met behulp van transgene planten die weefsel-en orgaan-specifieke fytochroom gebreken vertonen. De isolatie van specifieke cellen vertonen geïnduceerde fytochroom chromofoor uitputting door middel van fluorescentie-Activated Cell Sorting gevolgd door middel van microarray-analyses wordt gebruikt om genen die betrokken zijn bij de ruimtelijke-specifieke fytochroom reacties te identificeren.

Onderzoeken Tissue-en orgel-specifieke fytochroom Reacties met behulp van FACS-assisted Cell-type-specifieke expressie profilering in Arabidopsis thaliana</em

Kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR) is een doeltreffend instrument om mRNA niveaus te diagnosticeren in verschillende insecten weefsels en ontwikkelingsstadia. In dit rapport tonen we het gebruik van de qRT-PCR na te gaan mRNA niveaus in de verschillende weefsels en larvale ontwikkelingsstadia van de invasieve soorten insecten, smaragd as boor.

Analyse van genexpressie in Emerald Ash Borer ( Agrilus planipennis) Met behulp van kwantitatieve Real Time-PCR

Cel specifieke analyse van<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Bladeren met fluorescentie-geactiveerde celsortering

Source: Lee, H. et. al., Split Green Fluorescent Protein System to Visualize Effectors Delivered from Bacteria During Infection. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates a method for monitoring bacterial infection and effector protein delivery in plant cells using split superfolder green fluorescent protein (sfGFP) complementation combined with confocal microscopy. The approach enables precise visualization of effector translocation into the host cell cytosol.

Monitoring Bacterial Infection and Effector Protein Delivery in Plant Cells

Source: Rufián, J. S., et al, Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue. J. Vis. Exp. (2022)This video demonstrates a syringe-based pressure method for extracting apoplastic bacteria, which proliferate and form microcolonies within the apoplast, the intercellular space between plant cells. The method yields debris-free bacterial samples suitable for downstream single-cell analysis.

Extraction of Apoplastic Bacteria Using a Syringe-Based Pressure Method

Source: Rufián, J. S., et al. Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue. J. Vis. Exp. (2022).This video demonstrates a method for analyzing gene expression in plant-extracted pathogenic bacteria at the single-cell level using a fluorescently tagged transcription factor. Confocal imaging reveals heterogeneity in virulence gene expression, highlighting functional diversity within a clonal bacterial population.

Single-Cell Analysis of Gene Expression from Plant-Extracted Pathogens

Source: Liu, X., et al. Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates a method to assess the bacterial load in Arabidopsis thaliana leaves infected with Pseudomonas syringae. Leaf discs from infected leaves are homogenized, serially diluted, and plated onto nutrient-rich agar to promote bacterial colony formation. Colony counts are then used to...

Assessing Pseudomonas syringae Infection Load in Arabidopsis thaliana Leaves

Kwantificering van ziekteverwekkergroei is een krachtig hulpmiddel om verschillende Arabidopsis thaliana (hierna: Arabidopsis) immuunresponsen te karakteriseren. De hier beschreven methode presenteert een geoptimaliseerde spuitinfiltratie-assay om de groei van Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 in volwassen Arabidopsis-bladeren te kwantificeren.

Bacteriële Leaf Infiltratie Assay voor Beeldende karakterisatie van Plant Defense Reacties met behulp van de<em&gt; Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae</em&gt; Pathosystem

Het doel van het hier gepresenteerde protocol is het bestuderen van de reactie van de transcriptomic van endosphere-geïsoleerde Bacillus mycoides op aardappel wortel exsudaat. Deze methode vereenvoudigt de identificatie van belangrijke bacteriële genen die betrokken zijn in plant-microbe interacties en is in principe van toepassing op andere endofyten en planten, met kleine aanpassingen.

Plant-Microbe interactie: Transcriptionele reactie van Bacillus Mycoides op aardappel wortel exsudaat

Fluorescerende eiwit gebaseerde benaderingen te controleren effectoren uitgescheiden door bacteriën in de cellen van de gastheer zijn uitdagend. Dit is te wijten aan de incompatibiliteit tussen fluorescente proteïnen en het type III secretie systeem. Hier, wordt een geoptimaliseerde split superfolder GFP-systeem gebruikt voor visualisatie van effectoren uitgescheiden door bacteriën in de fabriek van de gastheercel.

Split groen Fluorescent proteïne systeem te visualiseren effectoren verlost van bacteriën tijdens de infectie

Hier presenteren we een aangepaste screeningmethode die uitgebreid kan worden gebruikt om RNA-uitschakelingssuppressors in plantenpathogenen snel te screenen.

Screening en identificatie van RNA Silencing Suppressors van secreted effectors of Plant Pathogens

Leer een geoptimaliseerde methode voor eencellige genexpressie-analyse van Pseudomonas syringae in plantaapoplast met flowcytometrie. Deze techniek minimaliseert plantverontreiniging en is toepasbaar op diverse plant-bacteriesystemen.

Eencellige analyse van de expressie van Pseudomonas syringae-genen in het plantenweefsel

Meer video's verkennen