Het genereren en afbeelden van muis en menselijke epitheliale organoïden uit normaal en tumor borstweefsel zonder passaging
11 november 2022
Dit protocol bespreekt een aanpak voor het genereren van epitheliale organoïden uit primair normaal en tumor borstweefsel door middel van differentiële centrifugatie. Verder zijn instructies opgenomen voor driedimensionale kweek en immunofluorescente beeldvorming van ingebedde organoïden.
Dit protocol is belangrijk voor de productie van geheugenepitheelorganoïden die worden gegenereerd zonder te passeren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat organoïden na enzymatische spijsvertering kunnen worden geïsoleerd uit borst- en geheugenweefsel van mens en muis. We voeren een reeks differentiële centrifugatiestappen uit die epitheliale organoïden isoleren zonder cellen te hoeven passeren.
Een persoon die deze techniek uitvoert, kan uitdagingen tegenkomen bij het inbedden van de weefsels in collageen of matrix en ze in een 96-putplaat te plaatsen. Bovendien is het gebruik van goed gepolymeriseerd collageen en het plateren van stabiele koepels de sleutel tot het zien van invasie. Om te beginnen, verzamel het borstweefsel van een geëuthanaseerde muis door muizenpoten te slingeren en vier naalden van 19 gauge te gebruiken, de muis bij de poten vast te pinnen op een plank bedekt met een absorberende pad met de ventrale kant naar boven gericht.
Spray met 70% ethanol om de vacht glad te maken en de huid te ontsmetten en uitwerpselen weg te vegen met een gaasje of tissue. Begin net boven het anogenitale gebied, knip omhoog vanaf de middellijn met een chirurgische schaar en zorg ervoor dat u niet door het peritoneum prikt. Bij het bereiken van de kin, maak laterale sneden door beide sleutelbeenderen en langs de achterpoten en speld de huid van de muis strak op het bord om borstvetkussens bloot te leggen.
Na het lokaliseren van de inguinale en thoracale borstvetkussens op wilde muizen, gebruikt u een tang om het borstvetkussen te verhogen. Maak met behulp van het stompe uiteinde van een scherpe stompe schaar een zak onder het borstvetkussen weg van de huid en knip het borstvetkussen in één compleet stuk weg. Zodra borstvetkussens zijn verwijderd, spoelt u ze in PBS voordat u ze in een steriele weefselkweekschaal plaatst en vervolgens snel overbrengt naar een weefselkweekkap.
Hak de borsttumoren fijn met een scalpel van nummer 10 of nummer 11 om het weefsel los te maken totdat het een pasta-achtige consistentie bereikt. Breng het gehakte weefsel over in een conische buis met 10 tot 30 milliliter collagenase-oplossing met behulp van een scalpel. Om ervoor te zorgen dat al het weefsel wordt verzameld, pipetteer je één milliliter collagenase-oplossing op de weefselkweekplaat en terug in de conische buis.
Plaats de conische buis in een benchtop schuddende incubator totdat het weefsel stringy wordt en de collagenase-oplossing troebel wordt. Draai 50 milliliter oplossing gedurende vijf tot 10 minuten bij 1.500 tpm. Zuig supernatant aan en voeg 12 milliliter van het basale medium toe en meng door drie tot vier keer op en neer te pipetteren of draai de pols voorzichtig terwijl je de buis 15 keer vasthoudt.
Nogmaals, spin aspiraat supernatant af, voeg basaal medium toe en meng door pipetteren of buisrotatie zoals eerder aangetoond. Zodra de zwaarste weefselfragmenten zich op de bodem nestelen, verzamelt u het supernatant met een serologische pipet en brengt u het over naar een conische buis van 15 milliliter. Zorg er na elke centrifugatie voor dat de pellet steeds ondoorzichtiger wordt.
Aliquot geschikte suspensie van organoïden in microcentrifugebuizen volgens de organoïdendichtheid ten opzichte van de hoeveelheid BECM per put. Centrifugeer de microcentrifugebuizen gedurende 10 minuten bij 300 G bij kamertemperatuur en gooi het supernatant uit de buizen. Verplaats de buizen met organoïde pellets naar ijs en voeg het juiste volume BECM toe aan elke microcentrifugebuis.
Pipet voorzichtig op en neer om de organoïden in BECM te resuspenderen en zorg ervoor dat er geen bubbels worden geproduceerd. Pipet langzaam en voorzichtig de BECM hangende organoïden op het platingoppervlak en vul alle lege putten met PBS om de luchtvochtigheid te behouden. Plaats de plaat gedurende een uur in een incubator van 37 graden Celsius om BECM te laten stollen en vervolgens af te dekken met het juiste volume media.
Om de collageenoplossing te bereiden, combineert u 375 microliter van 10 keer de concentratie DMEM, 100 microliter van één normaal natriumhydroxide en drie milliliter rattenstaartcollageen I-oplossing in een conische buis van 15 milliliter. Pipetmengsel, zorg ervoor dat er geen bubbels worden gemaakt en titreer de oplossing tot een pH van 7,2 tot 7,4 met een kleine hoeveelheid natriumhydroxide of 10 keer de concentratie DMEM indien nodig. Bedek de bodem van de putjes met de minimale hoeveelheid collageen die nodig is om de bodem van de put volledig te bedekken door een kleine hoeveelheid collageen te plaatsen en de plaat van links naar rechts te wiegen om te coaten.
Laat de collageenonderlagen gedurende 30 minuten tot twee uur op 37 graden Celsius zetten. Aliquot de juiste suspensie van organoïden in microcentrifugebuizen volgens de organoïdendichtheid ten opzichte van de hoeveelheid collageen per put. Bewaar de collageenoplossing bij vier graden Celsius en controleer de polymerisatie door elke 10 minuten onder een microscoop te controleren op vezelvorming.
Centrifugeer de microcentrifugebuizen gedurende 10 minuten bij 300 G bij kamertemperatuur en gooi het supernatant uit de buizen. Verplaats de organoïde pellets naar ijs en voeg het juiste volume collageen toe aan elke microcentrifugebuis. Pipet voorzichtig op en neer om organoïden in collageen te resuspenderen en zorg ervoor dat er geen bubbels worden geproduceerd.
Pipetteer langzaam en voorzichtig de collageen gesuspendeerde organoïden op het platingoppervlak. De immunofluorescente beelden van ingebedde organoïden in ofwel kelder extracellulaire matrix of collageen werden verkregen om de overeenkomsten tussen soorten weefselsamenstelling te bestuderen. Organoïden ingebed in collageenmatrix kunnen worden gebruikt voor een invasietest en worden geanalyseerd door de uitbreiding van ranken te volgen die zich vertakken van de organoïde zelf, hetzij door membraantomaatetikettering of falloïdekleuring van actine.
Ten slotte tonen hematoxyline- en eosinekleuring van paraffine-ingebedde organoïden aan dat organoïden dezelfde histologie van borstkanker behouden. Het is cruciaal om BECM en collageen koud te houden tijdens het pipetteren van gelled koepels om voortijdige polymerisatie te voorkomen. Bovendien zal langdurige fixatie van koepels in PFA leiden tot gelled oplossing bij het uitvoeren van immunofluorescente kleuring.
Organoïden kunnen ook worden gebruikt in in vitro en in vivo procedures zoals medicijnschermen en muismodellen van metastase. Deze methoden kunnen inzicht geven in de therapeutische gevoeligheid van tumorweefsel, metastatische eigenschappen en immuuninteracties.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een aanpak voor het genereren van epitheliale organoïden uit primair normaal en tumorale borstweefsel via differentiële centrifugatie. Verder zijn er instructies opgenomen voor driedimensionale kweek en immunofluorescentie-imaging van ingebedde organoïden.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Organoïdtechnologie
Achtergrond
- Organoïden zijn 3D-structuren die de architectuur en functie van organen nabootsen.
- Dit protocol maakt de isolatie van organoïden mogelijk uit zowel menselijk als muis mammair weefsel.
- De techniek voorkomt de noodzaak van het passeren van cellen, wat de celkenmerken kan veranderen.
- Het inbedden van weefsels in collageen is cruciaal voor een succesvolle organoïdenkweek.
Doel van de studie
- Om een betrouwbare methode te bieden voor het genereren van epitheliale organoïden uit mammaweefsels.
- Om de studie naar het gedrag van normaal en tumorigenisch mammaweefsel te faciliteren.
- Om het begrip van de biologie van de mamma-klier te verbeteren via organoïde-modellen.
Gebruikte methoden
- Verzamelen van borstweefsel van geëuthanaseerde muizen.
- Enzymatische digestie om epitheelcellen te isoleren.
- Differentiële centrifugatie om organoïden te scheiden.
- Inbedding van organoïden in collageen voor 3D-cultuur.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle generatie van organoïden zonder celpassages.
- Demonstratie van stabiele koepelvorming in collageenmatrices.
- Visualisatie van organoïden-invasie via immunofluorescente beeldvorming.
- Inzichten in het gedrag van normale versus tumorale mammaire organoïden.
Conclusies
- Dit protocol biedt een robuuste methode voor het bestuderen van de biologie van het mamma-epitheel.
- Organoïden kunnen dienen als waardevolle modellen voor kankeronderzoek.
- De techniek kan worden aangepast voor diverse weefseltypen buiten de melkklieren.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Snelle generatie en beeldvorming van muis- en menselijke mammaire epitheliale organoïden zonder passaging maakt een getrouwe modellering van de architectuur van normaal en tumorweefsel mogelijk. Dit gestroomlijnde protocol ondersteunt translationeel onderzoek door weefselspecifieke kenmerken te behouden en downstream-analyses van interacties in de tumormicro-omgeving te vergemakkelijken. De aanpak vergroot het voorspellende vertrouwen in vroege ontdekking en preklinische oncologie-pipelines door robuuste ex vivo modellering van celgedrag en therapeutische respons mogelijk te maken.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt directe ondervraging van de biologie van tumor- en normaal weefsel mogelijk in een fysiologisch relevante 3D-context.
- Ondersteunt mechanistische risicoreductie door het behoud van natuurlijke cel-cel- en cel-matrixinteracties.
- Faciliteert functionele target-validatie via ex vivo modellering van invasie en immuuninteracties.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Biedt gestandaardiseerde organoïde-preparaten die geschikt zijn voor kwantitatieve invasie- en co-cultuurassays.
- Verbetert de reproduceerbaarheid van de assay door variabiliteit als gevolg van celpassages te elimineren.
- Maakt schaalbare preparatie van organoïden mogelijk voor compoundscreening en fenotypische analyse.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij ziekterelateerde systemen voor het modelleren van de tumormicro-omgeving en metastatisch gedrag.
- Ondersteunt de ontdekking van translationele biomarkers via immunofluorescentie- en histologische analyses.
- Faciliteert risico-gecorrigeerde voortgang door ex vivo druggevoeligheid en metastasering te modelleren.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit protocol is geïntegreerd in het continuüm van ontdekking naar preklinisch onderzoek door een snelle, reproduceerbare methode te bieden voor het genereren van organoïden rechtstreeks uit primair weefsel, ter ondersteuning van zowel mechanistische studies als translationele assays.
- Discovery-biologie: Maakt hypothesetoetsing van tumoren-stroma- en immuuninteracties mogelijk in een gecontroleerde 3D-omgeving.
- Screening: Levert assay-klare organoïden voor studies naar invasie, co-cultuur en medicijnrespons.
- Analyses: Ondersteunt kwantitatieve beeldvorming en histologische read-outs voor comparatieve analyse.
- Translationeel onderzoek: Slaat een brug tussen discovery en preklinische validatie door metastatisch en immuungedrag ex vivo te modelleren.
- Herbruikbaarheid binnen ondernemingen: Biedt een herbruikbaar platform voor diverse weefselbronnen en downstream-applicaties.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit in oncologisch onderzoek in een vroeg stadium.
- Operationele waarde: Stroomlijnt workflows door passageren te elimineren en de bereiding van organoïden te standaardiseren.
- Strategische waarde: Verbetert de kwaliteit van go/no-go-beslissingen en de kapitaalefficiëntie door robuuste ex vivo modellering mogelijk te maken.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risicogecorrigeerde prioritering en het verder ontwikkelen van oncologische activa.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in weefseldissociatie, 3D-kweek en beeldvormingstechnieken.
- Toegang tot centrifugatie, weefselkweek en infrastructuur voor immunofluorescentie-beeldvorming is noodzakelijk.
- Vereist standaardisatie van inbeddings- en uitplaatprocedures tussen teams voor reproduceerbaarheid.
- Aanpasbaar voor zowel muis- als menselijke weefselbronnen, met aandacht voor de polymerisatiecondities van de matrix.
- Zorgvuldige hantering van collageen en BECM is essentieel om voortijdige polymerisatie te voorkomen en de betrouwbaarheid van de assay te waarborgen.
