Name: Orthotope implantatie van patiënt-afgeleide kankercellen bij muizen recapituleert gevorderde colorectale kanker (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T13:05:00.000+00:00
Duration: 6 min 49 s
Description: Leer orthotope implantatie van patiënt-afgeleide kankercellen in de cecumwand van immuundeficiënte muizen. Dit model bootst gevorderde colorectale kanker na met long- en levermetastasen voor therapeutische evaluaties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We danken de Cellex Foundation, het CIBERONC-netwerk en het Instituto de Salud Carlos III voor hun steun. Bovendien bedanken we ook het preklinische beeldvormingsplatform van het Vall d'Hebron Research Institute (VHIR), waar de experimenten werden uitgevoerd.

Van alle patiënten werd schriftelijke geïnformeerde toestemming verkregen. Het project werd goedgekeurd door de Commissie Onderzoeksethiek van het Universitair Ziekenhuis Vall d'Hebron, Barcelona, Spanje (goedkeuring ID: PR(IR)79/2009 PR(AG)114/2014, PR(AG)18/2018). Menselijke darmweefselmonsters bestonden uit biopsieën van niet-necrotische gebieden met primaire adenocarcinomen of levermetastasen, overeenkomend met patiënten met darm- en endeldarmkanker die tumorresectie ondergingen. De experimenten werden uitgevoerd volgens de dierenverzorgingsrichtlijn van de Europese Unie (86/609/EEG) en werden goedgekeurd door de Ethische Commissie voor Dierproeven van het VHIR-the Vall d'Hebron Research Institute (ID: 40/08 CEEA, 47/08/10 CEEA en 12/18 CEEA).
OPMERKING: Vrouwelijke NOD-SCID (NOD. CB17-Prkdcscid/NcrCrl) muizen vanaf de leeftijd van 8 weken werden gekocht bij Charles River Laboratories.
1. Afleiding van patiëntcellen
<ol><li>Tumor extractie OPMERKING: De volgende procedure wordt uitgevoerd in een biologische kast bij kamertemperatuur (RT) in de dierenfaciliteit.<ol><li>Verkrijg tumormonsters van de operaties of biopsieën van de patiënt en van PDX's die subcutaan groeien bij muizen.</li>
		<li>Bereid voor de orthotope injectie de tumorcellen voor van gevestigde subcutane PDX-tumormodellen in plaats van weefsel dat rechtstreeks van patiënten is verkregen9.</li>
		<li>Genereer PDX-tumoren door subcutaan een suspensie van 1 x 105 tumorcellen in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) (50 μL) gemengd met Matrigel-matrix (50 μL) subcutaan te inoculeren in de flank van NOD-SCID-muizen2.<ol><li>Meet de tumorgroei om de dag met een schuifmaat. OPMERKING: Belangrijk is dat ons laboratorium een biobank van meer dan 350 PDX-modellen heeft gegenereerd. De CRC-PDX-tumormodellen die in het protocol worden gebruikt, zijn gevestigde PDX-modellen in het laboratorium die meer dan drie passages bij muizen zijn geamplificeerd en de inclusie-/exclusiecriteria met een positief resultaat hebben doorstaan (tabel 1).</li>
		</ol></li>
		<li>Euthanaseer de muizen door cervicale dislocatie wanneer subcutane tumoren de maximale grootte bereiken die is vastgesteld door de CEEA (1 cm diameter), of wanneer de dieren eindpuntcriteria bereiken.</li>
		<li>Haal de tumor eruit en verwijder deze voorzichtig van de huid en het omliggende niet-tumorweefsel met een schaar en een pincet.</li>
		<li>Bewaar de geoogste tumoren in PBS bij 4 °C tot de volgende stap. OPMERKING: Dissocieer de tumoren in celsuspensie zo snel mogelijk na verwijdering van hun oorspronkelijke locatie in de laesies van de patiënt of subcutane xenotransplantaten bij muizen. De levensvatbaarheid van de cellen is 24 uur na weefselverwijdering aanzienlijk verminderd, wat resulteert in een inefficiënte implantatie bij ontvangende muizen.</li>
	</ol></li>
	<li>Cel voorbereiding OPMERKING: De volgende procedure wordt uitgevoerd in een biologische kast bij kamertemperatuur (RT) in de weefselkweekruimte.<ol><li>Dissocieer de tumoren met behulp van een mesje in een kweekplaat van 10 cm met 1 ml volledig CoCSCM 6Ab-medium (tabel 2) (om het hakken te vergemakkelijken). Plaats het homogene gedissocieerde monster in een conische buis van 15 ml.</li>
		<li>Voeg volledig CoCSCM 6Ab medium toe aan een eindvolume van 5 ml (gebruik niet meer dan 3 ml gedissocieerd monster in hetzelfde buisje). OPMERKING: Primaire CRC die bij patiënten wordt verwijderd, is van nature besmet met bacteriën en schimmels. Het is essentieel om ziekteverwekkers die aanwezig zijn in het oorspronkelijke patiëntmonster te verwijderen met behulp van een cocktail van zes antibiotica (penicilline, streptomycine, fungizone, kanamycine, gentamycine en nystatine). Injectie van tumorcellen die besmet zijn met bacteriën bij immunodeficiënte muizen kan leiden tot de dood van dieren.</li>
		<li>Incubeer met 50 μL DNase I (0,08 kU/ml) en 50 μL collagenase (1,5 mg/ml) (verteringsmedium; Tabel 2) gedurende 1 uur bij 37 °C in een celkweekincubator, op een 45°-positie. Meng de oplossing elke 15 minuten goed met een pipet van 5 ml vóór de incubatie. OPMERKING: Dissocieer het tumorweefsel en verteer het door meerdere keren te pipetteren om een eencellige oplossing te verkrijgen. Dit is essentieel voor het tellen van de cellen voordat ze in ontvangende muizen worden geïnjecteerd en dus voor het bereiken van een homogene implantatie van tumorcellen.</li>
		<li>Voeg 5 ml volledig CoCSCM 6Ab medium toe en meng goed met een pipet van 5 ml.</li>
		<li>Sorteer de oplossing met een celzeef van 100 μm met behulp van een nieuwe steriele buis van 50 ml.</li>
		<li>Draai de gesorteerde cellen op 500 x g gedurende 8 minuten bij RT.</li>
		<li>Aspireer de supernatant.</li>
		<li>Resuspendeer de pellet in 3 ml 1x RBC lysisbufferoplossing.</li>
		<li>Incubeer gedurende 10 minuten bij RT.</li>
		<li>Voeg 3 ml volledig CoCSCM 6Ab medium toe, pipet het monster en draai gedurende 10 minuten op 500 x g bij RT. Zuig het supernatant op.</li>
		<li>Resuspendeer de pellet met 5-10 ml volledig CoCSCM 6Ab-medium en gebruik een cellenteller om het totale aantal cellen te berekenen.</li>
		<li>Draai de cellen gedurende 10 minuten op 500 x g bij RT en resuspendeer in 10 ml PBS.</li>
		<li>Resuspendeer de pellet tot een concentratie van 20 x 106 cellen/ml en meng goed om een homogene celsuspensie te verkrijgen.</li>
		<li>Bereid spuiten van 29 G (0,5 ml U 100 naald, 0,33 mm [29 G] x 12,7 mm) voor op blindedarminjectie in de weefselkweek (één spuit/muis). Laad 50 μL van de tumorcelsuspensie (1 x 106 cellen/injectie) in de spuit en bewaar deze op ijs. Zorg ervoor dat luchtbellen uit de celsuspensie worden verwijderd. OPMERKING: Het elimineren van luchtbellen wanneer de tumorcellen in de spuit worden geladen, is essentieel om injectie van een te groot volume in de blindedarmwand te voorkomen, wat kan leiden tot weefselbreuk en monsterverlies. Het is absoluut noodzakelijk om de celsuspensie goed te mengen bij het laden van de spuit om ongelijke tumorgrootte bij muizen in hetzelfde experiment te voorkomen.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Orthotope injectie in blindedarm
OPMERKING: De volgende procedure wordt uitgevoerd op een werkbank in een specifieke pathogeenvrije (SPF) ruimte in de dierenfaciliteit. De gebruikte apparatuur is vooraf gereinigd en gesteriliseerd. Bovendien wordt het opnieuw gesteriliseerd in een draagbare sterilisator tussen personen of zones in de dierenfaciliteit.
<ol><li>Reinig de operatieplaats door te besproeien met desinfecterend schoonmaakmiddel en af te vegen.</li>
	<li>Ontharen van de buik van de muis met behulp van een muizenontharingsmachine.</li>
	<li>Plaats de muis in rugligging. Gebruik 2% isofluraan om het dier te verdoven. Bevestig het effect van anesthesie door zachtjes in de extremiteit te knijpen en de afwezigheid van stimulatie te observeren.</li>
	<li>Breng een druppel veterinaire zalf van 50-100 μL (3 mg/g Lacryvisc) in de ogen om uitdroging tijdens de anesthesie te voorkomen.</li>
	<li>Desinfecteer de buik van de muis door meerdere keren in een cirkelvormige beweging te schrobben met chloorhexidine of povidonjodium.</li>
	<li>Maak een incisie in de lengterichting van 1 cm over de onderbuik met behulp van een operatieschaar. Scheid de huid zorgvuldig op elke plaats om het buikvlies dat zich onder de huid bevindt te presenteren.</li>
	<li>Maak een incisie van 0,5-1 cm in het buikvlies, groot genoeg om de blindedarm naar buiten te brengen. OPMERKING: Exterioriseer de blindedarm zonder de inwendige organen overmatig te manipuleren, wat de dodelijkheid van de procedure dramatisch zou kunnen verhogen.</li>
	<li>Isoleer de blindedarm zorgvuldig van de muis met behulp van een voorgesneden, steriel gaasje.</li>
	<li>Bevochtig de blindedarm gedurende de hele procedure met een zoutoplossing.</li>
	<li>Immobiliseer de blindedarm door deze voorzichtig met een tang vast te pakken en breng de naald oppervlakkig in de blindedarmwand. Vermijd haarvaten en bloedvaten op de injectieplaats. Verwijder luchtbellen uit de celsuspensie.</li>
	<li>Injecteer langzaam de hele 50 μL tumorcelsuspensie. Het duurt meestal ongeveer 10 seconden om toe te dienen. Vermijd het perforeren van het blindedarmlumen met de naald, omdat dit resulteert in de eliminatie van de tumorcelsuspensie uit het lichaam via de darmperistaltiek. OPMERKING: Het injecteren van de tumorcelsuspensie in de blindedarm van de muizen is de meest uitdagende stap van de hele procedure. In dit deel van het protocol moet een fel licht worden gebruikt dat gericht is op de injectieplaats en een vergrotende loep. Breng de naald evenwijdig aan het oppervlak van de blindedarm in. De blindedarm is een zeer kwetsbaar weefsel; Daarom moet immobilisatie van de blindedarm worden uitgevoerd met behulp van een chirurgische pincet en door lichte druk uit te oefenen om weefselbreuk te voorkomen die tot bloeding leidt. Succesvolle implantatie resulteert in een witte bel (korrel van cellen) in de blindedarmwand. Als de bel niet kan worden gevisualiseerd, kan dit erop wijzen dat de blindedarm is geperforeerd en dat de cellen zijn geëindigd in het blindedarmlumen, waardoor ze door het darmkanaal worden opgeruimd.</li>
	<li>Verwijder na de injectie langzaam de naald uit de blindedarm en oefen lichte druk uit op de injectieplaats met een applicator met wattenstaafjes, om te voorkomen dat tumorcellen ontsnappen en lichte bloedingen te verminderen.</li>
	<li>Reinig de blindedarm met een zoutoplossing om vuil te verwijderen.</li>
	<li>Breng de blindedarm terug in de buik van het dier.</li>
	<li>Sluit het buikvlies met 5/0 hechtingen.</li>
	<li>Sluit de huid van de buik met 5/0 hechtingen.</li>
	<li>Dien postoperatieve antibiotica (100 mg/kg amoxicilline of 20 mg/kg enrofloxacine) en analgetica (5 mg/ml metacam/meloxicam) toe door middel van subcutane injectie. Leg de muizen op een verwarmingskussen en houd ze daar totdat ze volledig hersteld zijn. Breng ze vervolgens terug naar de kooi met andere dieren.</li>
</ol>3. Evaluatie van orthotope tumorgroei met behulp van μCT-scanning
OPMERKING: De volgende procedure wordt uitgevoerd in het preklinische beeldvormingsplatform (PIP) van de dierfaciliteit.
<ol><li>Voer alle dierproeven uit volgens de voorschriften van de ethische commissie van de instelling.</li>
	<li>Begin 2 weken na celinjectie met het monitoren van het tumorvolume met μCT en daarna elke week.</li>
	<li>Verdun het contrastmiddel iopamiro (300 mg/ml) vers in een zoutoplossing, in een verhouding van 3:1 voor beide doses. Dien 300 ml iopamiro toe via een orale maagsonde. OPMERKING: Vanwege het slechte wekedelencontrast van de μCT wordt een contrastmiddel aanbevolen om de gevoeligheid van de techniek te verbeteren. Het protocol omvat een orale toediening van een op jodium gebaseerd middel (iopamiro) om de intraluminale tumorbelasting af te bakenen, en een secundaire intraperitoneale toediening van hetzelfde middel om de tumorbelasting in het viscerale gezicht van de darm te definiëren. Er zijn eerder pilot-experimenten uitgevoerd om de exacte tijd te bepalen die het contrastmiddel nodig heeft om bij de blindedarm van muizen aan te komen voordat het wordt geëlimineerd. In het geval van iopamiro is het ongeveer 2 uur.</li>
	<li>Dien na 2 uur een intraperitoneale injectie toe van 300 ml eerder verdunde iopamiro. De toediening helpt bij het bepalen van de tumorlimieten in het pariëtale gezicht.</li>
	<li>Verdoof de dieren met 2% isofluraan.</li>
	<li>Nadat u hebt bevestigd dat het dier correct is verdoofd door in de voet van de muis te knijpen, plaatst u het dier in het scanbed van de μCT. De beste positie is rugligging (met de voorkant naar boven).</li>
	<li>Start in de besturingssoftware de live-modus (fluoroscopiemodus) om de buikstreek in het gezichtsveld (FOV) van de scanner te plaatsen. Beweeg daarvoor het bed naar voren en naar achteren en zijwaarts totdat de gewenste positie is bereikt. Draai de röntgenbuis en de detector 90° en beweeg het scanbed in de y-as om het dier volledig te centreren.</li>
	<li>Gebruik de volgende parameters voor de μCT-scanbeelden: 30 mm gezichtsveld, 26 s acquisitietijd, 90 kV stroomspanning en 200 μA stroomsterkte, met behulp van een FX μCT-beeldvormingssysteem.</li>
	<li>Breng de dieren terug naar hun kooien om te herstellen wanneer de scan is voltooid. Zorg voor thermische ondersteuning en bewaak de dieren totdat ze herstellen van de anesthesie voordat ze terugkeren naar de huisvesting.</li>
	<li>De μCT-acquisitie levert een bestand op van 250 Mb per scan. De aangemaakte gegevensbestanden hebben een VOX-formaat. Om ze toegankelijk te maken voor alle beeldvormingsanalysesoftware, converteert u de bestanden naar DICOM-formaat met behulp van de databasebeheersoftware van de μCT. Sla de batch gemaakte bestanden op een draagbare harde schijf op om ze te analyseren met behulp van elke computer met beschikbare beeldvormingssoftware. OPMERKING: Tijdens beeldanalyse is de blindedarm gelokaliseerd als een verwijde darm met een radiodense inhoud (iopamiro), vaak aan de linkerkant van de caudale buik. In de viscerale buiging van de blindedarm wordt een wandverdikking waargenomen in vergelijking met de aangrenzende darmgebieden. De verdikking komt overeen met tumorgroei.</li>
	<li>Zodra de tumor is gelokaliseerd, zoekt u de hoogste diameter in de verschillende weergaven (axiaal, coronaal en sagittaal). Meet deze drie assen en bereken het tumorvolume volgens de ellipsoïde formule: volume = 4/3π x (x-halve as x y-halve as x z-halve as)10.</li>
</ol>4. Therapeutische interventie bij muizen met orthotope tumoren
<ol><li>Controleer wekelijks de muizen met orthotope tumoren.</li>
	<li>Wanneer bij de meeste muizen een μCT-scansignaal van de tumor wordt gedetecteerd, voert u de volgende week nog een μCT-scan uit om de aanwezigheid van de tumor te bevestigen. OPMERKING: De tijd om de behandeling te starten is afhankelijk van het gebruikte PDX-model en varieert van 3-12 weken na inoculatie van tumorcellen in de blindedarm.</li>
	<li>Randomiseer de muizen in vier groepen: een vehiculumgroep (n = 10-15 muizen), een testgroep voor geneesmiddelen (n = 10-15 muizen), een standaardbehandelingsgroep voor chemotherapie (n = 10-15 muizen) en een combinatiebehandelingsgroep (n = 10-15 muizen).</li>
	<li>Behandel de muizen intraperitoneaal met zoutoplossing (mediumgroep), het testgeneesmiddel (20 mg/kg) (testgeneesmiddelgroep), irinotecan (50 mg/kg) (standaardzorggroep) of het testgeneesmiddel (20 mg/kg) met irinotecan (50 mg/kg) (combinatiebehandelingsgroep). Voer de toediening één keer per week uit tot het einde van het experiment.</li>
	<li>Controleer de tumorgroei wekelijks door middel van μCT-scanning in de loop van het experiment.</li>
	<li>Aan het einde van het experiment euthanaseer je de muizen door cervicale dislocatie en verzamel je levers, longen en andere mogelijke laesies in andere organen.</li>
	<li>Voeg de weefselmonsters toe aan cassettes en incubeer ze een nacht in 4% formaline. Gebruik darmweefsel van een muis zonder tumor in de blindedarm als controle.</li>
	<li>Verwijder de cassettes van formaline en incubeer met 70% ethanol gedurende ten minste 3 uur.</li>
	<li>Sluit de cassettes in met paraffine, met behulp van standaardprotocollen voor histopathologiefaciliteiten.</li>
	<li>Voer hematoxyline- en eosinekleuring (H&E) uit de blindedarm, lever en longen uit, met behulp van standaardprotocollen voor histopathologiefaciliteiten.</li>
</ol>

<ol><li>Sung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Cancer+Statistics+2020%3A+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries%5BTitle%5D)+AND+%22CA%3A+a+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA: a Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).</li>
<li>Puig, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+personalized+preclinical+model+to+evaluate+the+metastatic+potential+of+patient-derived+colon+cancer+initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A personalized preclinical model to evaluate the metastatic potential of patient-derived colon cancer initiating cells.</a> Clinical Cancer Research. 19 (24), 6787-6801 (2013).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+development+and+disease+with+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Byrne, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrogating+open+issues+in+cancer+precision+medicine+with+patient-derived+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Interrogating open issues in cancer precision medicine with patient-derived xenografts.</a> Nature Reviews. Cancer. 17 (4), 254-268 (2017).</li>
<li>Vatandoust, S., Price, T. J., Karapetis, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorectal+cancer%3A+Metastases+to+a+single+organ%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Colorectal cancer: Metastases to a single organ.</a> World Journal of Gastroenterology. 21 (41), 11767-11776 (2015).</li>
<li>Cespedes, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+microinjection+of+human+colon+cancer+cells+in+nude+mice+induces+tumor+foci+in+all+clinically+relevant+metastatic+sites%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Orthotopic microinjection of human colon cancer cells in nude mice induces tumor foci in all clinically relevant metastatic sites.</a> The American Journal of Pathology. 170 (3), 1077-1085 (2007).</li>
<li>Durkee, B. Y., Weichert, J. P., Halberg, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+animal+micro-CT+colonography%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Small animal micro-CT colonography.</a> Methods. 50 (1), 36-41 (2010).</li>
<li>Boll, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-contrast+micro-CT+colonoscopy+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Colorectal+Disease%22%5BJournal%5D)">Double-contrast micro-CT colonoscopy in live mice.</a> International Journal of Colorectal Disease. 26 (6), 721-727 (2011).</li>
<li>O'Brien, C. A., Pollett, A., Gallinger, S., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+colon+cancer+cell+capable+of+initiating+tumour+growth+in+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A human colon cancer cell capable of initiating tumour growth in immunodeficient mice.</a> Nature. 445 (7123), 106-110 (2007).</li>
<li>Jensen, M. M., Jorgensen, J. T., Binderup, T., Kjaer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+volume+in+subcutaneous+mouse+xenografts+measured+by+microCT+is+more+accurate+and+reproducible+than+determined+by+18F-FDG-microPET+or+external+caliper%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Medical+Imaging%22%5BJournal%5D)">Tumor volume in subcutaneous mouse xenografts measured by microCT is more accurate and reproducible than determined by 18F-FDG-microPET or external caliper.</a> BMC Medical Imaging. 8, 16(2008).</li>
<li>Herpers, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+patient-derived+organoid+screenings+identify+MCLA-158+as+a+therapeutic+EGFR+x+LGR5+bispecific+antibody+with+efficacy+in+epithelial+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cancer%22%5BJournal%5D)">Functional patient-derived organoid screenings identify MCLA-158 as a therapeutic EGFR x LGR5 bispecific antibody with efficacy in epithelial tumors.</a> Nature Cancer. 3 (4), 418-436 (2022).</li>
<li>Chicote, I., Camara, J. A., Palmer, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+colorectal+cancer+orthotopic+patient-derived+xenograft+models+for+cancer+and+stem+cell+research%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Advanced colorectal cancer orthotopic patient-derived xenograft models for cancer and stem cell research.</a> Methods in Molecular Biology. 2171, 321-329 (2020).</li>
</ol>

In de afgelopen decennia zijn er veel nieuwe antikankertherapieën ontwikkeld en getest bij patiënten met verschillende tumortypes, waaronder colorectale kanker (CRC). Hoewel in veel gevallen veelbelovende resultaten in preklinische modellen zijn waargenomen, is de therapeutische werkzaamheid bij patiënten met gevorderde gemetastaseerde CRC vaak beperkt. Daarom is er dringend behoefte aan preklinische modellen die het mogelijk maken om de werkzaamheid van nieuwe therapeutische geneesmiddelen te testen in een klinisch rele...

Colorectale kanker (CRC) is wereldwijd de tweede belangrijkste doodsoorzaak doorkanker1. Het vermogen om in vitro of in vivo tumormodellen te genereren die zijn afgeleid van tumorcellen van individuele patiënten, heeft de precisiegeneeskunde in de oncologie geavanceerd. In het afgelopen decennium zijn van patiënten afgeleide organoïden (BOB's) of xenotransplantaten (PDX'en) door veel onderzoeksgroepen over de hele wereld gebruikt2. BOB's zijn meercellige in vitro structuren die lijken op de kenmerken van het oorspronkelijke tumorweefsel en zichzelf kunnen organiseren en vernieuwen3. Deze veelbelovende in vitro modellen kunnen met succes worden gebruikt voor het screenen van geneesmiddelen en het faciliteren van translationeel onderzoek. Aan de andere kant geven PDX-modellen getrouw het oorspronkelijke CRC weer op alle relevante niveaus, van histologie tot moleculaire eigenschappen en geneesmiddelrespons 2,4.
In vivo PDX-modellen worden meestal gekweekt als subcutane tumoren in immunodeficiënte muizen. Met behulp van deze aanpak zijn PDX'en de gouden standaard geworden in kankeronderzoek, met name voor het bestuderen van de gevoeligheid of resistentie van geneesmiddelen. CRC-gerelateerde sterfgevallen worden echter meestal geassocieerd met de aanwezigheid van gemetastaseerde laesies in de lever, de longen of de peritoneale holte, en geen van de twee benaderingen (PDO of PDX) kan de geavanceerde klinische setting recapituleren. Bovendien is aangetoond dat de specifieke plaats van tumorgroei belangrijke biologische kenmerken bepaalt die van invloed zijn op de werkzaamheid van geneesmiddelen en de prognose van de ziekte2. Daarom is er dringend behoefte aan het opstellen van preklinische modellen die kunnen worden gebruikt om de werkzaamheid van geneesmiddelen tegen kanker in een klinisch relevante gemetastaseerde setting te beoordelen6.
Microcomputertomografie (μCT)-scanners kunnen functioneren als verkleinde klinische CT-scanners, die primaire tumor- en metastasebeeldvorming bij muizen bieden met een geschaalde beeldresolutie die evenredig is met die van CT-beelden van kankerpatiënten7. Om het slechte wekedelencontrast van de μCT-techniek tegen te gaan, kunnen radiologische jodiumhoudende contrastmiddelen worden gebruikt om het contrast te verbeteren en de tumorbelasting te evalueren. Met behulp van een dubbele contrastbenadering wordt oraal en intraperitoneaal jodium op verschillende tijdstippen toegediend. Het contrast dat oraal wordt toegediend, helpt bij het bepalen van de grenzen tussen tumorweefsel en blindedarm in de darm.  Aan de andere kant maakt het intraperitoneaal toegediende contrast het mogelijk om de externe limieten van de tumormassa te identificeren, die vaak groeit en het peritoneum binnendringt8.
Het manuscript beschrijft een protocol om orthotope implantatie uit te voeren van kankercellen van patiënten in de blindedarmwand van immunodeficiënte muizen, en de methodologie om de groei van darmtumoren te volgen met behulp van μCT-scanning. Het huidige manuscript laat zien dat het model het klinische scenario van gevorderde darmtumoren en gemetastaseerde ziekte bij CRC-patiënten recapituleert die niet kunnen worden bestudeerd met behulp van PDO- of PDXO-modellen. Aangezien orthotope PDX-modellen van CRC het klinische scenario van CRC-patiënten samenvatten, concluderen we dat ze tot nu toe de beste zijn voor het testen van de werkzaamheid van antitumorale geneesmiddelen bij gevorderde darmtumoren en gemetastaseerde ziekte.

<table><tbody><tr><td>REAGENT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Apo-Transferrin</td><td>MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.</td><td>T1147-500MG</td><td></td></tr><tr><td>B27 Supplement</td><td>Life Technologies S.A (Spain)</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhexidine Aqueous Solution 2%</td><td>DH MATERIAL M&Eacute;DICO, S.L.</td><td>1111696250</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.</td><td>C0130-500MG</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.</td><td>G6152</td><td></td></tr><tr><td>DMEM /F12&nbsp;</td><td>LIFE TECHNOLOGIES S.A.</td><td>21331-020</td><td></td></tr><tr><td>DNase I&nbsp;&nbsp;</td><td>MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.</td><td>D4263-5VL</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>PEPRO TECH EC LTD.</td><td>AF-100-15-500 &micro;g</td><td></td></tr><tr><td>FGF basic</td><td>PEPRO TECH EC LTD.</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>Life Technologies S.A (Spain)</td><td>15290026</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>LIFE TECHNOLOGIES S.A.</td><td>15750037</td><td></td></tr><tr><td>Heparin Sodium Salt</td><td>MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.</td><td>H4784-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.</td><td>I9278-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Iopamiro</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane&nbsp;</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>LIFE TECHNOLOGIES S.A.</td><td>15160047</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>LIFE TECHNOLOGIES S.A.</td><td>25030032</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Matrix</td><td>CULTEK, S.L.U.</td><td>356235/356234/354234</td><td></td></tr><tr><td>Metacam, 5 mg/mL</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Non-essential amino acids</td><td>LIFE TECHNOLOGIES S.A.</td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td>Nystatin</td><td>MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.</td><td>N4014-50MG</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Life Technologies S.A (Spain)</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS), sterile</td><td>Labclinics S.A</td><td>L0615-500</td><td></td></tr><tr><td>Progesterone</td><td>MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.</td><td>P0130-25G</td><td></td></tr><tr><td>Putrescine</td><td>MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.</td><td>P5780-5G</td><td></td></tr><tr><td>RBC Lysis Buffer&nbsp;</td><td>Labclinics S.A</td><td>00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>LIFE TECHNOLOGIES S.A.</td><td>11360039</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Selenite</td><td>MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.</td><td>S5261-25G</td><td></td></tr><tr><td>ESSENTIAL SUPPLIES</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>8 weeks-old NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl mice</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>BD Micro-Fine 0.5 ml U 100 needle 0.33 mm (29G) x 12.7 mm&nbsp;</td><td>BECTON DICKINSON, S.A.U.</td><td>320926</td><td></td></tr><tr><td>Blade #24</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainer 100 &micro;m</td><td>Cultek, SLU</td><td>45352360</td><td></td></tr><tr><td>Forceps and Surgical scissors</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Heating pad</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Lacryvisc, 3 mg/g, ophthalmic gel</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Surfasafe</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Suture PROLENE 5-0&nbsp;</td><td>JOHNSON&amp;JOHNSON S, A.</td><td>8720H</td><td></td></tr><tr><td>EQUIPMENT/SOFTWARE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quantum FX &micro;CT Imaging system</td><td>Perkin Elmer</td><td>Perkin Elmer</td><td>http://www.perkinelmer.com/es/product/quantum-gx-instrument-120-240-cls140083</td></tr></tbody></table>

orthotope implantatie van patiënt-afgeleide kankercellen bij muizen recapituleert gevorderde colorectale kanker

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

In het afgelopen decennium zijn meer geavanceerde preklinische modellen voor colorectale kanker (CRC) ontwikkeld met behulp van kankercellen van patiënten en 3D-tumoroïden. Aangezien tumororganoïden afkomstig van patiënten de kenmerken van de oorspronkelijke tumor kunnen behouden, maken deze betrouwbare preklinische modellen screening van kankergeneesmiddelen en de studie van resistentiemechanismen voor geneesmiddelen mogelijk. CRC-gerelateerde sterfte bij patiënten wordt echter meestal geassocieerd met de aanwezigheid van gemetastaseerde ziekte. Het is daarom essentieel om de werkzaamheid van antikankertherapieën te evalueren in relevante in vivo modellen die de belangrijkste moleculaire kenmerken van menselijke kankermetastasen echt samenvatten. We hebben een orthotopisch model opgesteld op basis van de injectie van CRC-kankercellen rechtstreeks in de blindedarmwand van muizen. Deze tumorcellen ontwikkelen primaire tumoren in de blindedarm die uitzaaien naar de lever en longen, wat vaak wordt waargenomen bij patiënten met gevorderde CRC. Dit CRC-muismodel kan worden gebruikt om geneesmiddelresponsen te evalueren die worden gecontroleerd door microcomputertomografie (μCT), een klinisch relevante kleinschalige beeldvormingsmethode die gemakkelijk primaire tumoren of metastasen bij patiënten kan identificeren. Hier beschrijven we de chirurgische ingreep en de vereiste methodologie om kankercellen van patiënten te implanteren in de blindedarmwand van immunodeficiënte muizen.

Muizen die orthotopisch waren geïmplanteerd met kankercellen van de patiënt werden wekelijks gecontroleerd door middel van μCT-scans. Aan het einde van het experiment werden de dieren geëuthanaseerd. Darmen, ceca (figuur 1A,B), levers, longen en andere mogelijke laesies werden verzameld, opgenomen in een cassette en 's nachts gefixeerd met 4% formaline. Darmweefsel van een muis zonder tumor in de blindedarm werd gebruikt als controle (Figuur 1C)...

Dit protocol beschrijft de orthotope implantatie van kankercellen van patiënten in de blindedarmwand van immunodeficiënte muizen. Het model recapituleert gevorderde uitgezaaide ziekte van colorectale kanker en maakt de evaluatie van nieuwe therapeutische geneesmiddelen mogelijk in een klinisch relevant scenario van long- en levermetastasen.

Orthotope implantatie van patiënt-afgeleide kankercellen bij muizen recapituleert gevorderde colorectale kanker

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...

Dit protocol beschrijft de orthotope implantatie van kankercellen van patiënten in de blindedarmwand van immunodeficiënte muizen. Dit model recapituleert gevorderde colorectale kanker gemetastaseerde ziekte. Het orthotope colorectale kankermodel dat hier wordt gepresenteerd, recapituleert het klinische scenario van gevorderde darmtumoren en gemetastaseerde ziekte bij patiënten met colorectale kanker die niet kunnen worden bestudeerd met behulp van van patiënten afgeleide organoïden of van patiënten afgeleide xenotransplantaatmodellen.Van een geëuthanaseerde muis haalt u de tumor eruit door deze voorzichtig van de huid en het omliggende niet-tumorweefsel te verwijderen met een schaar en een pincet. Plaats de geoogste tumoren in PBS bij vier graden Celsius. Dissocieer met een mes de tumoren in een kweekplaat van 10 centimeter met een millimeter medium.Plaats het homogene gedissocieerde monster in een conische buis van 15 milliliter. Voeg vervolgens het medium toe tot een laatste volume van vijf milliliter. Voeg vervolgens het digestiemedium toe aan de buis.Plaats de buis gedurende een uur op een hoek van 45 graden in een celkweekincubator bij 37 graden Celsius. Meng tijdens de incuba

orthotopic-implantation-patient-derived-cancer-cells-mice

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Twee technieken kunnen worden gebruikt om dit model te stellen: injectie van een kankercel suspensie in de blindedarmkeutels muur of transplantatie van een stukje van subcutane tumor op de blindedarm. Dit model is handig voor het bestuderen van de natuurlijke progressie van colorectale kanker en testen van nieuwe therapeutische middelen tegen colorectale kanker.

Orthotope Muis Model van colorectale kanker

De video toont de orthotopische inentingstechniek voor borstkanker in een muismodel. Deze techniek produceert een hoge tumorigenesesnelheid met minder variabiliteit in tumorgrootte en vorm in vergelijking met subcutane of niet-chirurgische injectie.

Orthotopische injectie: weefselspecifieke kankercellen implanteren in een volwassen muis

This video describes the protocol to establish a spontaneous metastasis mouse model of colorectal cancer patient-derived xenografts or PDXs. These xenograft models partially mimic the features of human carcinomas and understand the critical aspects of human malignancies, including invasion and metastasis.

Spontaneous Metastasis Mouse Models: A Platform to Study the Metastatic Potential of Orthotopically Injected Colorectal Cancer Cells

The video describes the technique for intracecal injection of cancerous cells to develop an orthotopic mouse model with highly uniform tumors. Therefore, the orthotopic mouse model allows realistic simulation of metastasis, providing a valuable tool to study the phenotype changes during tumor growth and dissemination.

Intracecal Tumor Cell Injection: A Technique to Deliver Cancer Cells for Establishing Orthotopic Colorectal Cancer Mouse Model

Het vermogen van metastaserende klonen om verre locaties te koloniseren, hangt af van hun proliferatievermogen en/of hun vermogen om te overleven in de micro-omgeving van de gastheer zonder significante proliferatie. Hier presenteren we een diermodel dat kwantitatieve visualisatie van beide typen leverkolonisatie door metastaserende klonen mogelijk maakt.

Geavanceerde diermodel van colorectale metastase in de lever: Imaging technieken en eigenschappen van gemetastaseerde Clones

We beschrijven de oprichting van orthotopische colorectale tumoren via injectie van tumorcellen of organoïden in de cecum van muizen en de daaropvolgende isolatie van circulerende tumorcellen (CTC's) uit dit model.

Isolatie van circulerende tumorcellen in een orthotopische muismodel van colorectale kanker

Een protocol voor de oprichting van een genetisch gemanipuleerde muismodel van colorectale kanker door middel van segmentale adeno-cre infectie en zijn bewaking via hoge resolutie colonoscopie wordt gepresenteerd.

Een genetisch ontwikkeld muis model van sporadische colorectale kanker

Om zeer gevoelige detectie van de verspreiden menselijke colorectaal carcinoom (CRC) cellen koloniseren van weefsels, tonen we hierin een protocol voor efficiënte transductie van groen fluorescent proteïne (GFP) lentivirale deeltjes in PDX-afgeleide CRC organoid cellen voorafgaand aan hun injectie in ontvangende muizen, met stereo-fluorescentie microscopische observatie.

Hoog-gevoeligheids detectie van micrometastasen gegenereerd door GFP Lentivirus-getransduceerde Organoids gekweekt uit een patiënt-afgeleide dikke darm Tumor

Hier presenteren we een protocol om het implantaat van borstkankercellen in de borstklier vet pad in een eenvoudige, minder invasief, en gemakkelijk te bedienen manier, en deze orthotopic borst kanker muismodel met een juiste borstklier vet pad omgeving kan worden gebruikt voor het onderzoeken van verschillende aspecten van kanker.

Orthotopic injectie van borstkankercellen in de borstklier vet Pad muizen

Dit protocol beschrijft de generatie van door patiënten afgeleide orthotopic xenotransplantaatmodellen is-modellen door intra-vesisch bijbrengen van hoogwaardige urotheelcelcarcinoom cellen of intra-rectale injectie van colorectale kankercellen in niet-zwaarlijvige diabetische/ernstige gecombineerde immunodeficiëntie (NOD/SCID) muizen voor primaire tumorgroei en spontane metastasen onder invloed van lymfeklier stromale cellen, die de progressie van humane gemetastaseerde ziekten nabootst.

Patiënt-afgeleide Orthotopic xenograft modellen voor humaan Urotheelcelcarcinoom en colorectale kanker tumor groei en spontane metastasen

Portale ader injectie van colorectale kanker (CRC) organoïden genereert stroma-rijke levermetastase. Dit muismodel van CRC-levermetastase vertegenwoordigt een nuttig hulpmiddel om tumor-stroma-interacties te bestuderen en nieuwe stroma-gerichte therapieën te ontwikkelen, zoals adeno-geassocieerde virus-gemedieerde gentherapieën.

Portale ader injectie van colorectale kanker organoïden om de levermetastase stroma te bestuderen

Leer orthotope implantatie van patiënt-afgeleide kankercellen in de cecumwand van immuundeficiënte muizen. Dit model bootst gevorderde colorectale kanker na met long- en levermetastasen voor therapeutische evaluaties.

Orthotope implantatie van patiënt-afgeleide kankercellen bij muizen recapituleert gevorderde colorectale kanker

Meer video's verkennen