Name: Implantatie en evaluatie van melanoom in het muizenvlies via optische coherentietomografie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-02T14:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 46 s
Description: Leer hoe je melanoom implanteert en evalueert in het muizenvlies met optische coherentietomografie. Deze methode maakt reproduceerbare tumoren en live beeldvorming mogelijk voor onderzoek naar uveaal melanoom.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd gedeeltelijk ondersteund door subsidie 1304/20 van de Israel Science Foundation (ISF), Israël, voor Arie Marcovich. We danken Shahar Ish-Shalom en Ady Yosipovich, van de afdeling Pathologie, Kaplan Medical Center, Rehovot, Israël, voor histologische analyse.

De experimenten in het protocol zijn goedgekeurd door de Israëlische Nationale Raad voor Dierproeven en voldoen aan de ARVO-verklaring voor het gebruik van dieren in oogheelkundig en visieonderzoek. Vrouwelijke C57BL/6-muizen, in de leeftijd van 8-10 weken, werden gebruikt voor deze studie en werden blootgesteld aan 12/12 uur licht-donkercycli. De dieren werden verkregen uit een commerciële bron (zie tabel met materialen).
1. Celkweek
<ol><li>Kweek B16LS9-cellen in RPMI 1640-medium, aangevuld met 10% foetaal runderserum, 2 mM L-glutamine, 1 mM natriumpyruvaat, 25 mM HEPES, 1% essentieel vitaminemengsel, 200 U / ml penicilline en 200 mg / ml streptomycine (zie materiaaltabel), in een bevochtigde 37 °C-incubator met 5% CO2.</li>
	<li>Oogst de cellen voor injectie bij 70% -80% samenvloeiing.</li>
</ol>2. Voorbereiding van dieren
<ol><li>Bereid een verdovingsmengsel van ketamine (75 mg/kg lichaamsgewicht) en medetomidine (0,5 mg/kg lichaamsgewicht). Verdoof de muizen door het verdovingsmengsel intraperitoneaal in een enkele injectie te injecteren.</li>
	<li>Breng topische oftalmische verdoving oxybuprocaïne (0,4%) aan op beide ogen.</li>
	<li>Verwijd de muispupillen door topisch tropicamide toe te passen (0,5%).</li>
</ol>3. Het creëren van een conjunctivale peritomie en sclerale tractus in de sub-choroïdale ruimte
<ol><li>Breng 1,4% hydroxyethylcellulose (zie materiaaltabel) aan als smeermiddel voor beide ogen om uitdroging te voorkomen. Breng 0,5% tropicamide aan op het rechteroog.</li>
	<li>Observeer het geopereerde oog van de muis onder een operatiemicroscoop (zie Materiaaltabel). Houd de oogleden open met een steriele intraoculaire tang.</li>
	<li>Houd met behulp van een intraoculaire tang het supero-temporale limbale bindvlies vast en trek naar een infra-nasale positie22. Beveilig deze positie door deze gedurende de hele procedure vast te houden (figuur 1A).</li>
	<li>Maak met behulp van een naaldpunt van 30 G een kleine (1-2 mm) conjunctivale peritomie in het dorsale-temporale gebied, ongeveer 1-2 mm achter de limbus. OPMERKING: Het gebruik van fijnere naalden kan overmatige punctie voorkomen en een betere precisie van de tumorlocatie mogelijk maken.</li>
	<li>Verwijder overtollige Tenon's capsule uit de opening van de peritomie. OPMERKING: Tenon's capsule is een laag dicht bindweefsel dat de bol van het oogomringt 22.</li>
	<li>Steek op deze locatie de naaldpunt in om door de sclera te dringen. Maak een excisie om een kanaal in de subchoroïdale ruimte te creëren totdat de bruine kleur van het vaatvlies verschijnt door de blootgestelde witte stof van de sclera (figuur 1B).</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64632/64632fig01.jpg"> Figuur 1: Inenting van tumorcellen . (A) Het superotemporale limbale bindvlies wordt vastgehouden met behulp van een intraoculaire tang en naar een infra-nasale positie getrokken. (B) De punt van een naald van 30 G wordt ingebracht om door de sclera te dringen en excisie wordt gemaakt om een spoor in de subchoroïdale ruimte te creëren. (C) Een spuit gevuld met cellen en gemonteerd met een naald van 32 G wordt in de rups ingebracht en de cellen worden geïnjecteerd. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64632/64632fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
4. Inenting van melanoomcellen
<ol><li>Resuspendeer 70.000 B16LS9-cellen in 2 μL PBS. Dit bedrag wordt geschat per oog.</li>
	<li>Laad de cellen in een steriele glazen Hamilton-spuit van 10 μL (zie materiaaltabel) gemonteerd met een stompe naald van 32 G die in een hoek van 45° is gedraaid.</li>
	<li>Steek de geladen naald van de spuit ongeveer 2 mm in de baan die in stap 3 is gemaakt.</li>
	<li>Injecteer 2 μL celsuspensie.</li>
	<li>Houd de naald na injectie 2-3 s op zijn plaats totdat alle vloeistof is verdwenen.</li>
	<li>Verwijder de naald door deze voorzichtig en langzaam uit te trekken om lekkage uit de baan te voorkomen (figuur 1C). OPMERKINGEN: Het aanpassen van de snelheid en kracht van injectie kan het patroon van tumorontwikkeling beïnvloeden. Er wordt voorgesteld dat deze parameters worden gekalibreerd door individuen die experimenteren om de juiste kracht en snelheid te identificeren. In voorlopige experimenten werden in totaal 70.000 cellen bepaald. Aangezien er echter variaties kunnen zijn in celkweektypen of batches of tussen muizenstammen, is kalibratie van dit aantal noodzakelijk.</li>
</ol>5. Beoordeling van de locatie van de injectie
<ol><li>Observeer het geïnjecteerde oog door OCT-scans onmiddellijk na melanoomcelinenting om het uiterlijk van netvliesloslating (RD), retinale schade en / of cellen bij het glasvocht23 te identificeren. OPMERKINGEN: Breng tropicamide, oxybuprocaïne en ethylcellulose indien nodig opnieuw aan.</li>
	<li>Classificeer op basis van de OCT-scans uit stap 5.1 de RD-patronen21 volgens: (1) lokale RD-one site van RD; (2) lekkage in het glasachtig observerend celmateriaal in het glasvocht; (3) uitgebreid RD-meerdere locaties van RD.</li>
	<li>Voorspel de tumorlokalisatie op basis van: (1) lokale RD-verwachte choroïdale tumoren; (2) lekkage in de glasvocht-verwachte tumoren in het glasvocht; (3) uitgebreide RD-verwachte variabele en gedispergeerde tumoren (figuur 2). OPMERKING: Alleen muizen met lokale RD (ongeveer 50%) zullen naar verwachting tumoren ontwikkelen die beperkt zijn tot het vaatvlies.</li>
</ol>6. Tumorgrootte voorspellen op basis van RD-hoogte
<ol><li>Meet de hoogte van lokaal RD in de OCT-scans met behulp van een OCT-segmentatie-/analysesoftware (zie materiaaltabel) en classificeer volgens de volgende groepen: klein = <300 μm; gemiddeld = 300-400 μm; groot = >400 μm.</li>
	<li>Beoordeel het volume dat de tumoren naar verwachting binnen 5 dagen na injectie zullen bereiken volgens de volgende criteria: Een kleine RD-hoogte wordt meestal waargenomen bij kleine tumoren (tumorvolume variërend van 0,0059 mm 3 tot 0,07 mm 3 met een gemiddeld volume van 0,027 ± 0,005 mm3). Een gemiddelde RD-hoogte wordt gevonden in zowel kleine als middelgrote tumoren (tumorvolume variërend van 0,015 mm 3 tot 0,15 mm 3 met een gemiddeld volume van 0,056 ± 0,016 mm3). Een grote RD-hoogte wordt geassocieerd met een breed scala aan tumorvolumes tot 0,36 mm3. OPMERKING: Het bereik van verwachte tumorgroottes werd verkregen uit de vorige resultaten en verdeeld in drie groepen kleine, middelgrote en grote tumoren.</li>
</ol>7. Postoperatieve procedures
<ol><li>Breng oftalmische ofloxacine 0,3% topisch aan.</li>
	<li>Keer de anesthesie om door atipamezoolhydrochloride (3 mg/kg) subcutaan te injecteren.</li>
	<li>Injecteer buprenorfine (0,05 mg/kg lichaamsgewicht) tweemaal daags gedurende 3 dagen subcutaan om de pijn en het lijden van dieren te verminderen.</li>
	<li>Evalueer 5 dagen na injectie van melanoomcellen de tumorgrootte door de onderstaande stappen te volgen.<ol><li>Verdoof de muizen zoals beschreven in stap 2.1. Breng tropicamide aan (0,5%).</li>
		<li>Onderzoek de ogen door longitudinale en sagittale OCT-scans en gebruik OCT-segmentatie / analysesoftware om tumorvolume en lokalisatie te meten.</li>
		<li>Bereken het tumorvolume met behulp van de formule24: V = a*b*c*6/π (a, b en c = respectievelijk lengte, breedte en hoogte).</li>
		<li>Onderzoek de tumorgrootte elke 2-3 dagen zoals beschreven in stap 7.4.1-7.4.3. OPMERKING: De procedure moet worden geoptimaliseerd als u verschillende muisstammen of cellijnen gebruikt.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Jager, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uveal+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Uveal melanoma.</a> Nature Reviews Disease Primers. 6 (1), 1-25 (2020).</li>
<li>Bustamante, P., Piquet, L., Landreville, S., Burnier, J. V. Uveal melanoma pathobiology: Metastasis to the liver. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBustamante%2C+P+%22Seminars+in+Cancer+Biology%22">Seminars in Cancer Biology</a>. 71, Academic Press. 65-85 (2021).</li>
<li>Damato, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+treatment+of+choroidal+melanoma+in+relation+to+the+prevention+of+metastatic+death-A+personal+view%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Ocular treatment of choroidal melanoma in relation to the prevention of metastatic death-A personal view.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 66, 187-199 (2018).</li>
<li>Jouhi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+small+fatal+choroidal+melanoma+study.+A+survey+by+the+European+Ophthalmic+Oncology+Group%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">The small fatal choroidal melanoma study. A survey by the European Ophthalmic Oncology Group.</a> American Journal of Ophthalmology. 202, 100-108 (2019).</li>
<li>Cao, J., Jager, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+eye+models+for+uveal+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Ocular+Oncology+and+Pathology%22%5BJournal%5D)">Animal eye models for uveal melanoma.</a> Ocular Oncology and Pathology. 1 (3), 141-150 (2015).</li>
<li>Uner, O. E., Gandrakota, N., Azarcon, C. P., Grossniklaus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+uveal+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Eye+Science%22%5BJournal%5D)">Animal models of uveal melanoma.</a> Annals of Eye Science. 7, 21-30 (2022).</li>
<li>Yang, H., Dithmar, S., Grossniklaus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon+alpha+2b+decreases+hepatic+micrometastasis+in+a+murine+model+of+ocular+melanoma+by+activation+of+intrinsic+hepatic+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Interferon alpha 2b decreases hepatic micrometastasis in a murine model of ocular melanoma by activation of intrinsic hepatic natural killer cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (7), 2056-2064 (2004).</li>
<li>Yang, H., Grossniklaus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+immunologic+and+anti-angiogenic+therapy+reduces+hepatic+micrometastases+in+a+murine+ocular+melanoma+model%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Combined immunologic and anti-angiogenic therapy reduces hepatic micrometastases in a murine ocular melanoma model.</a> Current Eye Research. 31 (6), 557-562 (2006).</li>
<li>Rusciano, D., Lorenzoni, P., Burger, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+models+of+liver+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Invasion+%26+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Murine models of liver metastasis.</a> Invasion & Metastasis. 14 (1-6), 349-361 (1994).</li>
<li>Diaz, C. E., Rusciano, D., Dithmar, S., Grossniklaus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B16LS9+melanoma+cells+spread+to+the+liver+from+the+murine+ocular+posterior+compartment+%28PC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">B16LS9 melanoma cells spread to the liver from the murine ocular posterior compartment (PC).</a> Current Eye Research. 18 (2), 125-129 (1999).</li>
<li>Rusciano, D., Lorenzoni, P., Burger, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+models+of+liver+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Invasion+%26+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Murine models of liver metastasis.</a> Invasion & Metastasis. 14 (1-6), 349-361 (1994).</li>
<li>Ashur-Fabian, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrac+delayed+the+onset+of+ocular+melanoma+in+an+orthotopic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Tetrac delayed the onset of ocular melanoma in an orthotopic mouse model.</a> Frontiers in Endocrinology. 12, 632335(2019).</li>
<li>Elia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+regulating+c-met+overexpression+in+liver-metastatic+B16-LS9+melanoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanisms regulating c-met overexpression in liver-metastatic B16-LS9 melanoma cells.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 81 (3), 477-487 (2001).</li>
<li>Harning, R., Szalay, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+metastasis+of+in+vivo+and+in+vitro+derived+syngeneic+murine+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Ocular metastasis of in vivo and in vitro derived syngeneic murine melanoma.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 28 (9), 1599-1604 (1987).</li>
<li>Ezra-Elia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+an+in+vivo+imaging+system+be+used+to+determine+localization+and+biodistribution+of+AAV5-mediated+gene+expression+following+subretinal+and+intravitreal+delivery+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Can an in vivo imaging system be used to determine localization and biodistribution of AAV5-mediated gene expression following subretinal and intravitreal delivery in mice.</a> Experimental Eye Research. 176, 227-234 (2018).</li>
<li>Notting, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+bioluminescent+imaging+of+human+uveal+melanoma+in+a+new+mouse+model+of+local+tumor+growth+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Whole-body bioluminescent imaging of human uveal melanoma in a new mouse model of local tumor growth and metastasis.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (5), 1581-1587 (2005).</li>
<li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-vivo+xenograft+murine+human+uveal+melanoma+model+develops+hepatic+micrometastases%5BTitle%5D)+AND+%22Melanoma+Research%22%5BJournal%5D)">In-vivo xenograft murine human uveal melanoma model develops hepatic micrometastases.</a> Melanoma Research. 18 (2), 95-103 (2008).</li>
<li>Murthy, R. K., Haji, S., Sambhav, K., Grover, S., Chalam, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+applications+of+spectral+domain+optical+coherence+tomography+in+retinal+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Journal%22%5BJournal%5D)">Clinical applications of spectral domain optical coherence tomography in retinal diseases.</a> Biomedical Journal. 39 (2), 107-120 (2016).</li>
<li>Drexler, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrahigh-resolution+ophthalmic+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Ultrahigh-resolution ophthalmic optical coherence tomography.</a> Nature Medicine. 7 (4), 502-507 (2001).</li>
<li>Ochakovski, G. A., Fischer, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotyping+of+mouse+models+with+OCT%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Phenotyping of mouse models with OCT.</a> Methods in Molecular Biology. 1834, 285-291 (2019).</li>
<li>Zaks, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-vivo+imaging+for+assessing+tumor+growth+in+mouse+models+of+ocular+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">In-vivo imaging for assessing tumor growth in mouse models of ocular melanoma.</a> Experimental Eye Research. 204, 108431(2021).</li>
<li>Brar, V. S. American Academy of Ophthalmology 2022-2023 BCSC. 2. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrar%2C+VS+%22Fundamentals+and+principles+of+ophthalmology%22">Fundamentals and principles of ophthalmology</a>. , (2022).</li>
<li>Duker, J. S., Waheed, N. K., Goldman, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDuker%2C+JS+%22Handbook+of+Retinal+OCT%3A+Optical+Coherence+Tomography%2C+2nd+Edition%22">Handbook of Retinal OCT: Optical Coherence Tomography, 2nd Edition</a>. , Elsevier Health Sciences. (2021).</li>
<li>Tomayko, M. M., Reynolds, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+subcutaneous+tumor+size+in+athymic+%28nude%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Chemotherapy+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Determination of subcutaneous tumor size in athymic (nude) mice.</a> Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 24 (3), 148-154 (1989).</li>
<li>Richards, J. R., Yoo, J. H., Shin, D., Odelberg, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+uveal+melanoma%3A+Strengths%2C+weaknesses%2C+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+%26+Melanoma+Research%22%5BJournal%5D)">Mouse models of uveal melanoma: Strengths, weaknesses, and future directions.</a> Pigment Cell & Melanoma Research. 33 (2), 264(2020).</li>
<li>Chen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoacoustic+molecular+imaging-escorted+adipose+photodynamic-browning+synergy+for+fighting+obesity+with+virus-like+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Photoacoustic molecular imaging-escorted adipose photodynamic-browning synergy for fighting obesity with virus-like complexes.</a> Nature Nanotechnology. 16 (4), 455-465 (2021).</li>
<li>Yu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+visualization+of+early+cancer+hepatic+micrometastasis+and+intraoperative+image-guided+surgery+by+photoacoustic+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">Label-free visualization of early cancer hepatic micrometastasis and intraoperative image-guided surgery by photoacoustic imaging.</a> Journal of Nuclear Medicine. 61 (7), 1079-1085 (2020).</li>
</ol>

Marcovich A.L.: Steba Biotech (P), Yeda Weizmann (P), EyeYon Medical (C, P), Mor Isum (P). c) = adviseur; (P) = Octrooi. Alle andere auteurs hebben geen tegenstrijdige belangen.

Uveaal melanoom is een verwoestende ziekte waarvoor nieuwe therapeutische benaderingen hard nodig zijn. Onderzoek naar uveaal melanoom en mogelijke behandelingen wordt echter beperkt door de technische uitdagingen van uveaal melanoom diermodellen 1,25. Oculaire tumoren, die worden geïnduceerd door intraoculaire injectie van kankercellen, zijn zeer variabel in zowel lokalisatie als grootte, waarschijnlijk vanwege de kleine afmetingen van het muizenoog. Een dergeli...

Uveaal melanoom (UM) is de meest voorkomende intraoculaire primaire maligniteit bij volwassenen. Ongeveer 90% van de oculaire melanomen is afkomstig van melanocyten in het vaatvliesgebied van het uveale kanaal1. UM is een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit, omdat naar schatting bijna 50% van de patiënten gemetastaseerde ziekte ontwikkelt, waarbij de lever de belangrijkste plaats van metastase is2. Vroege behandeling van primaire laesies kan de kans op metastasen verminderen, maar geen enkele effectieve behandeling voorkomt de vorming van metastasen3.
De standaardbehandeling van uveaal melanoom omvat bestralingstherapie, die gepaard gaat met verlies van gezichtsvermogen als gevolg van optische neuropathie, retinopathie, droge ogen syndroom en cataract. Chirurgische resectie wordt meestal uitgesteld totdat de groei van de laesie wordt herkend en gekarakteriseerd. Een dergelijke vertraging kan echter de ontwikkeling van gemetastaseerde ziekten mogelijkmaken 4. In sommige gevallen is nutteloze enucleatie vereist. Natuurlijk brengt deze radicale procedure het gezichtsvermogen in gevaar en resulteert het in dramatische esthetische achteruitgang.
Er zijn veel inspanningen geleverd aan het ontwikkelen van experimentele modellen om uveaal melanoom te bestuderen. Preklinische diermodellen die een nauwkeurige beoordeling van deze maligniteit mogelijk maken, zijn essentieel voor het onderzoeken van nieuwe diagnostische en therapeutische strategieën voor uveaal melanoom. Experimentele diermodellen van oculair melanoom zijn voornamelijk gebaseerd op de inenting van tumorcellen bij muizen, ratten en konijnen 5,6. Muismodellen zijn kosteneffectief en worden veel gebruikt voor melanoomstudies vanwege hun snelle reproductiesnelheid en hoge genoomgelijkenis met mensen. De murine cutane melanoom cellijn B16 wordt vaak gebruikt om C57BL6-muizen te enten en syngenetische tumoren te induceren. Bij gebruik van dit model om uveaal melanoom te induceren, moeten tumordragende ogen meestal 7-14 dagen na inenting worden geënucleeerd. Verder is B16 een zeer invasief model. De immuunbevoorrechte aard van het oog ondersteunt metastase en metastasen kunnen meestal 3-4 weken na inenting van tumorcellen worden gedetecteerd. Subculturen van de oorspronkelijke B16-lijn vertonen verschillende metastatische eigenschappen6. De Queens melanoomlijn heeft bijvoorbeeld een hoge metastatische snelheidvan 7,8. De B16LS9-cellijn heeft dendritische celmorfologie en is afgeleid van levermetastasen van C57BL / 6-muizen geïnjecteerd met de ouderlijke cutane melanoomlijn B16F19. Wanneer ze in het achterste compartiment van het oog worden geïnjecteerd, bleken deze cellen intraoculaire tumoren te vormen, die histologisch lijken op menselijk uveaal melanoom en leverspecifieke metastasen vormen in C57BL / 6, maar niet Balb / C, muizen10,11,12. Genetisch worden de cellen gekenmerkt door een hogere expressie van het c-met proto-oncogen, dat fungeert als een cellulaire receptor voor hepatocytengroeifactor13. B16F10, de10e passage van de ouderlijke B16, daarentegen metastaseert voornamelijk naar de longen wanneer intraoculair14. Zowel B16F10 als B16LS9 zijn gepigmenteerd12.
Verschillende belangrijke uitdagingen beperken het succes van murine uveale melanoommodellen. Ten eerste kan tumorcelreflux leiden tot extraoculair of subconjunctivaal melanoom. Ten tweede is de tumorgroei na intraoculaire inenting van melanoomcellen vaak zeer variabel, wat problemen oplevert bij het evalueren van de behandeling en voortgang. Een andere grote moeilijkheid is het beperkte vermogen om tumorgroei in vivo te volgen. Hoewel bioluminescente beeldvorming, zoals van luciferase tot expressie brengende tumoren, vaak wordt gebruikt om de groei van oculaire tumorente controleren 15,16, kan het geen informatie geven over de intraoculaire locatie van de tumor. Daarom wordt de evaluatie van de tumor meestal uitgevoerd na enucleatie van het oog10,17. Dit beperkt het vermogen om tumorprogressie en respons op behandelingen uitgebreid te karakteriseren aanzienlijk. Een andere belangrijke hindernis bij het bestuderen van uveaal melanoom is de moeilijkheid om laesies bij gepigmenteerde muizen te volgen. Nieuwe benaderingen, die deze moeilijkheden overwinnen, zijn nodig om het onderzoek naar uveaal melanoom in diermodellen te bevorderen.
Optische coherentietomografie (OCT) biedt onderscheidende mogelijkheden om diep in de verschillende delen van het oog in hoge resolutie te beelden, wat ongeëvenaard is door andere methoden, waaronder echografie18,19. OCT-beeldvorming is gebruikt in diermodellen om verschillende oogziekten te bestuderen20. Onlangs werd OCT-beeldvorming aangetoond als niet-invasief middel om intraoculaire tumorgroei te evalueren21. Het hier beschreven protocol toont de implantatie van melanoomcellen in het muriene vaatvlies en het gebruik van OCT om intraoculaire tumorlokalisatie en -grootte te voorspellen op het moment van celinenting.

<table><tbody><tr><td>10 &mu;L glazen spuit (Hamilton Co., Bonaduz, Zwitserland)</td><td>Hamilton</td><td>721711</td><td></td></tr><tr><td>30 G naalden</td><td>BD Microbalance</td><td>2025-01</td><td></td></tr><tr><td>Atipamezole hydrochloride</td><td>Orion Pharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B16LS9 cellen</td><td>van Hans Grossniklaus USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfine&nbsp;</td><td>richter pharma</td><td>102047</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 vrouwelijke muizen</td><td>Envigo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Essentiële vitaminemix</td><td>satorius</td><td>01-025-1A</td><td></td></tr><tr><td>Foetaal bovien serum</td><td>rhenium</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>satorius</td><td>03-025-1B</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyethylcellulose 1,4% oogdruppels</td><td>Fisher Pharmaceutical</td><td>390862</td><td></td></tr><tr><td>InSight OCT segmentatiesoftware&nbsp;</td><td>Phoenix Micron, Inc&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>bremer pharma GMBH (medimarket)</td><td>17889</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>satorius</td><td>03-020-1B</td><td></td></tr><tr><td>Medetomidine&nbsp;</td><td>zoetis (vetmarket)</td><td>102532</td><td></td></tr><tr><td>Ofloxacine 0,3% oogdruppels</td><td>allergan</td><td>E92170</td><td></td></tr><tr><td>Optische coherentietomografie&nbsp;</td><td>Phoenix Micron, Inc&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oxybuprocaïne 0,4%</td><td>Fisher Pharmaceutical</td><td>393050</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-streptomycine-amfotericine</td><td>satorius</td><td>03-033-1B</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)&nbsp;</td><td>satorius</td><td>02-023-1a</td><td></td></tr><tr><td>RPMI celmedia</td><td>satorius</td><td>01-104-1A</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyrovaat</td><td>satorius</td><td>03-042-1B</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische microscoop</td><td>Zeiss</td><td>OPMI-6 CFC</td><td></td></tr><tr><td>Tropicamide 0,5%</td><td>Fisher Pharmaceutical</td><td>390723</td><td></td></tr></tbody></table>

implantatie en evaluatie van melanoom in het muizenvlies via optische coherentietomografie

Implantation and Evaluation of Melanoma in the Murine Choroid via Optical Coherence Tomography

Het opzetten van experimentele choroïdale melanoommodellen is een uitdaging in termen van het vermogen om tumoren op de juiste lokalisatie te induceren. Bovendien beperken moeilijkheden bij het observeren van posterieure choroïdale melanoom in vivo de tumorlocatie en groei-evaluatie in realtime. De hier beschreven aanpak optimaliseert technieken voor het vaststellen van choroïdaal melanoom bij muizen via een meerstaps subchoroïdale B16LS9-celinjectieprocedure. Om precisie mogelijk te maken bij het injecteren in de kleine afmetingen van de muis uvea, wordt de volledige procedure uitgevoerd onder een microscoop. Eerst wordt een conjunctivale peritomie gevormd in het dorsale-temporale gebied van het oog. Vervolgens wordt een kanaal in de subchoroïdale ruimte gecreëerd door een naald door de blootgestelde sclera te steken. Dit wordt gevolgd door het inbrengen van een stompe naald in het kanaal en de injectie van melanoomcellen in het vaatvlies. Onmiddellijk na injectie wordt niet-invasieve optische coherentietomografie (OCT) beeldvorming gebruikt om de locatie en voortgang van de tumor te bepalen. Retinale loslating wordt geëvalueerd als een voorspeller van tumorplaats en -grootte. De gepresenteerde methode maakt de reproduceerbare inductie van vaatvlies-gelokaliseerd melanoom bij muizen en de live beeldvorming van tumorgroei-evaluatie mogelijk. Als zodanig biedt het een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van intraoculaire tumoren.

Ogen werden via OCT onderzocht onmiddellijk na injectie van de B16LS9-cellen. Lokale netvliesloslating werd waargenomen na injectie. De muizen vertoonden drie patronen van RD: brandpunt (figuur 2, bovenste paneel), lekkage naar het glasvocht (figuur 2, middenpaneel) en verlengd RD (figuur 2, onderste paneel). Verlengde RD wordt waarschijnlijk veroorzaakt door schade door de injectie. Er was een verband tussen het patroon va...

Het huidige protocol beschrijft de implantatie en evaluatie van melanoom in het muriene vaatvlies met behulp van optische coherentietomografie.

Implantatie en evaluatie van melanoom in het muizenvlies via optische coherentietomografie

Establishing experimental choroidal melanoma models is challenging in terms of the ability to induce tumors at the correct localization. In addition, ...

Het vaststellen van tumoren als het achterste deel van het oog is een uitdaging. Deze methode maakt de inductie van reproduceerbare choroïdale melanoomtumoren bij muizen en live beeldvorming van tumorgroei voor evaluatie mogelijk. Dit protocol maakt gebruik van OCT live beeldvorming om de locatie van de tumoren al op het moment van tumorcelinenting te beoordelen en om tumorgroei bij levende dieren te volgen.Uveaal melanoom is een verwoestende ziekte met bijna 50% van de metastase. Het ontwikkelen van experimentele modellen is de sleutel tot het bevorderen van onderzoek gericht op nieuwe therapeutische mogelijkheden. Een voordeel van deze methode is dat de onmiddellijke beoordeling van het succes van injectie het mogelijk maakt om studiegroepen met homogene tumoren te bereiken en deze continu te volgen door live beeldvorming.Om tumorprogressie te onderzoeken. Injecteren in de ogen van de kleine muis vereist oefening. De mogelijkheid om de geïnjecteerde cellen te visualiseren, stelt u in staat om uw succes onmiddellijk te beoordelen en indien nodig met meer muizen te herhalen.Dr. Dimitri Gaber van het Ophthalmology Research Laboratory in het Kaplan Medical Center zal de procedure demonstreren. Breng om te beginnen 0,4% topisch oftalmisch anestheticum, Oxybuprocaïne aan op beide ogen van de verdoofde muis. Breng vervolgens topisch 0,5% tropicamide aan op beide ogen voor het verwijden van de pupillen, gevolgd door 1,4% hydroxyethylcellulose als glijmiddel om uitdroging van de ogen te voorkomen.Observeer één oog van de muis onder een operatiemicroscoop. Houd de oogleden open met een steriele intraoculaire tang. Houd vervolgens het superieure temporale limbo-bindvlies vast en trek naar een infra-nasale positie.Beveilig deze positie door het limbo-bindvlies gedurende de hele procedure vast te houden. Maak met behulp van een naaldpunt van 30 gauge een kleine conjunctivale peritomie in het dorsale temporale gebied ongeveer één tot twee millimeter achter de limbus. Verwijder de overtollige pezencapsule uit de opening van de peritomie.Steek de naaldpunt in om de sclera te penetreren en creëer een spoor in de subchoroïdale ruimte totdat de bruine kleur van het vaatvlies verschijnt door de blootgestelde witte stof van de sclera. Laad de cellen in een steriele glazen Hamilton-spuit van 10 microliter gemonteerd met een stompe naald van 32 gauge gedraaid in een hoek van 45 graden. Steek de naald van de geladen spuit ongeveer twee millimeter in het gecreëerde kanaal en injecteer twee microliter van de celsuspensie.Houd de naald na injectie twee tot drie seconden op zijn plaats totdat alle vloeistof is verdwenen. Verwijder de naald door deze voorzichtig uit te trekken om lekkage uit het kanaal te voorkomen. Observeer onmiddellijk na de inenting van de melanoomcel het geïnjecteerde oog van het dier door OCT-scans.Classificeer op basis van de scans de netvliesloslating of RD-patronen volgens drie categorieën: lokaal RD, Lekkage in het glasvocht of Uitgebreid RD. Open een OCT-segmentatieanalysesoftware om de tumorgrootte te voorspellen op basis van RD-hoogte. Meet de hoogte van lokale RD in de OCT-scans en classificeer ze in drie groepen. Breng in de postoperatieve fase 0,3% van Ofloxacine topisch aan.De OCT-gebaseerde voorspelling van tumorgroei na subchoroïdale celinjectie is weergegeven in deze figuur. De muizen vertoonden drie patronen van RD, Focal, Leakage To The Vitreous en Extended RD. Er was een verband tussen het patroon van RD onmiddellijk na injectie en de lokalisatie van de tumoren vijf dagen na injectie. Focale RD was geassocieerd met de tumorcelgroei die beperkt was tot het vaatvlies.Observatie van cellen in het glasvocht na injectie bij dieren met Focal RD wees echter op tumorgroei in de vitreale holte en het vaatvlies. wanneer Extended RD werd waargenomen na injectie, werden tumoren na vijf dagen verspreid over het vaatvlies en glasvocht. Het bereik van tumorgroottes geïnduceerd in dit model kan worden onderverdeeld in klein, gemiddeld en groot.Hier worden representatieve beelden getoond van de OCT-meting van RD-hoogte na injectie, en het bijbehorende fundusbeeld, een horizontale OCT-scan van de tumorhoogte en -breedte op dag vijf na injectie, en het bijbehorende fundusbeeld, en de overeenkomstige H &E gekleurde oogsectie die vergelijkbare tumormetingen laat zien. Tumorvolumemetingen van muizen die onmiddellijk na celinjectie kleine, middelgrote of grote RD vertoonden, worden hier gepresenteerd. Het aanpassen van de kracht van de injectie kan de grootte en locatie van de tumor beïnvloeden.Het is belangrijk om dit te kalibreren en het patroon van geïnduceerde netvliesloslating door OCT na injectie te evalueren. Live beeldvorming van choroïdale tumoren is een belangrijk experimenteel hulpmiddel dat het mogelijk maakt om het effect van verschillende factoren of potentiële therapieën op tumorprogressie te onderzoeken.

implantation-evaluation-melanoma-murine-choroid-via-optical-coherence

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

This video demonstrates an in vivo imaging technique for detecting and quantifying eye inflammation in a mouse model of post-infectious uveitis. The technique, known as optical coherence tomography (OCT), generates high-resolution cross-sectional images of the eye for assessing disease progression.

Optical Coherence Tomography Imaging for Assessing Uveitis in a Mouse Model

Source: Jagodzinska, J., et. al.,  Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo. J. Vis. Exp. (2017)  In this video, we demonstrate the use of spectral-domain optical coherence tomography (SD-OCT) to image retinal layers and assess structural changes in a genetically modified mouse model with optic neuropathy.

In Vivo Imaging of the Mouse Retina Using Optical Coherence Tomography

We hebben een corticaal orthotope glioblastoom model vastgesteld muizen intravitale twee-foton microscopie dat de biofysische beperkingen recapituleert beginsel zullen spelen tijdens de groei van de tumor. Een chronische glazen venster vervangen van de schedel boven de tumor kan de follow-up van de progressie van de tumor na verloop van tijd door twee-foton microscopie.

Een orthotope Glioblastoma Muis Model Handhaving Brain Parenchymale fysieke beperkingen en geschikt voor intravitale twee-foton microscopie

We beschrijven een niet-invasieve dierlijke beeldvormingsplatform die de detectie, kwantificering en monitoring van de groei en recidief van ovariumkanker mogelijk maakt. Dit intra-peritoneale xenograftmodel bootst het klinische profiel van patiënten met ovariumkanker na.

Muizenmodel voor Non-invasieve beeldvorming te detecteren en Monitor Eierstokkanker Herhaling

Dit manuscript wordt een protocol voor de beeldvorming in vivo van het netvlies van de muis met hoge resolutie spectrale domein optische coherentie tomografie (SD-OCT) beschreven. Het richt zich op netvlies peesknoopcellen (regering van Cambodja) in de peripapillary regio, met verschillende scannen en kwantificeren van de aanpak beschreven.

Optische coherentie tomografie: Beeldvorming muis retinale Ganglion cellen In Vivo

Hier presenteren we het nut van longitudinale in vivo imaging in de follow-up van de morfologische veranderingen van laser-geïnduceerde choroidal neovascularization in muizen.

In Vivo Multimodale beeldvorming en analyse van Laser-geïnduceerde Choroidal Neovascularization muismodel

De volgende procedure beschrijft een methode voor ruimtelijke en temporele controle van melanocytische tumor initiatie in muizen dorsale huid, met behulp van een genetisch gemanipuleerde muismodel. Dit protocol beschrijft macroscopische en microscopische cutane melanoom initiatie.

Ruimtelijke en temporele controle van muizen melanoom initiatie van mutant melanocyt stamcellen

Hier beschrijven we een in vivo beeldvormingstechniek met behulp van optische coherentietomografie om de diagnose en kwantitatieve meting van retinopathie bij muizen te vergemakkelijken.

Toepassing van optische coherentietomografie op een muismodel van retinopathie

Het huidige protocol schetst de stappen voor het in vivo uitlijnen van optische coherentietomografie-vezelgrafiebeelden (vis-OCTF) in vivo met ex vivo confocale beelden van hetzelfde netvlies van muizen met het oog op het verifiëren van de waargenomen morfologie van de axonbundel van retinale ganglioncellen in de in vivo beelden.

Uitlijning van optische coherentietomografievezelgrammen in zichtbaar licht met confocale beelden van hetzelfde netvlies van de muis

We beschrijven een methode met behulp van doelgerichte perifere bestraling om vermoeidheid-achtig gedrag in muizen te induceren. De geselecteerde niet-dodelijke bestralingsdosis leidt tot een week lang verlaging van de vrijwillige-wiel draait activiteit.

Een muismodel van vermoeidheid geïnduceerd door Peripheral Bestraling

Leer hoe je melanoom implanteert en evalueert in het muizenvlies met optische coherentietomografie. Deze methode maakt reproduceerbare tumoren en live beeldvorming mogelijk voor onderzoek naar uveaal melanoom.

Implantatie en evaluatie van melanoom in het muizenvlies via optische coherentietomografie

Meer video's verkennen