Name: Kwantificeren van myeloperoxidase-DNA en neutrofiele elastase-DNA-complexen van neutrofiele extracellulaire vallen met behulp van een gemodificeerde sandwich-ELISA (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T12:25:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Leer een gemodificeerde sandwich-ELISA voor de kwantificering van myeloperoxidase-DNA en neutrofiele elastase-DNA-complexen uit neutrofiele extracellulaire vallen. Deze gevoelige methode ondersteunt klinisch onderzoek naar sepsis.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs bedanken Dr. Huq Muhammad Aminul voor het verlenen van hulp bij het beoordelen van het manuscript.

Deze studie werd uitgevoerd in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki en werd goedgekeurd door de institutionele beoordelingsraden van de Aichi Medical University (2017-H341, 2019-H137). Van elke deelnemer werd schriftelijke geïnformeerde toestemming verkregen.
1. Reagensbereiding
OPMERKING: Om de sandwich ELISA-test uit te voeren, worden de reagentia bereid zoals hieronder beschreven.
<ol><li>Coating buffer:<ol><li>Om een 0,1 mol/l carbonaat-bicarbonaatbuffer te maken, weegt u 10,6 g watervrij natriumcarbonaat (molecuulgewicht, 106 g/mol) en 8,4 g natriumbicarbonaat (molecuulgewicht, 84 g/mol).</li>
		<li>Voeg het toe aan ongeveer 900 ml gedestilleerd water in een bekerglas.</li>
		<li>Stel de pH van de buffer in op 9,6 door de vereiste hoeveelheid verdund zoutzuur of natriumhydroxide toe te voegen.</li>
		<li>Controleer de pH met een pH-meter.</li>
		<li>Voeg vervolgens het vereiste volume gedestilleerd water toe om een totaal volume van 1.000 ml te bereiken.</li>
		<li>Bewaar deze 0,1 mol/L carbonaat-bicarbonaatbuffer in de koelkast bij 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Blokkerende buffer:<ol><li>Voeg ongeveer 250 μL 20% natriumazide en 1 g runderserumalbumine (BSA) toe aan 70 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) bestaande uit 137 mmol/L NaCl, 8,1 mmol/L Na 2 HPO 4, 2,68 mmol/L KCl en 1,47 mol/L KH2PO 4(pH7,4) en meng voorzichtig.</li>
		<li>Voeg gedestilleerd water toe om een totaal volume van 100 ml te bereiken. De uiteindelijke concentraties van runderserumalbumine en natriumazide zijn respectievelijk 1% en 0,05%. Wacht 10 minuten en dan is de oplossing klaar voor gebruik.</li>
	</ol></li>
	<li>Wasoplossing: Bereid 0,5% t-octylfenoxypolyethoxyethanol, polyethyleenglycol tert-octylfenylether (Triton X-100) in gedestilleerd water.<ol><li>Verdun 100% Triton X-100 tot 10% met gedestilleerd water en laat de 10% oplossing 1 dag voor gebruik staan.</li>
		<li>Verdun vervolgens de 10% Triton X-100-oplossing 20-voudig met gedestilleerd water om een concentratie van 0,5% te bereiken.</li>
	</ol></li>
	<li>Verdunning van antilichamen:<ol><li>Verdun het afvangantilichaam (anti-MPO-antilichaam [1 mg/ml] of anti-NE-antilichaam [1 mg/ml]) tot 1:2.000 in de coatingbuffer (pH 9,6) vóór gebruik op dag 1 van de test (zie hieronder) en het detectieantilichaam (peroxidase-geconjugeerd anti-DNA-antilichaam) tot 1:40 met PBS vóór gebruik op dag 3 van de test (zie hieronder). OPMERKING: Verdun voor het voorlopige experiment de iso-type antilichamen (IgG-konijn [5 mg / ml] en IgG1-muiskloon Ci4 [0,5 mg / ml]) tot 1: 10.000 en 1: 1.000 in de coatingbuffer (pH 9,6).</li>
	</ol></li>
	<li>ABTS-substraatoplossing: Los afhankelijk van het aantal monsters één, twee of drie 2,2'-azino-bis (3 ethylbenzothiazoline-6-sulfonzuur (ABTS) tabletten op in 5 ml, 10 ml of 15 ml ABTS-buffer (met natriumperboraat, citroenzuur en dinatriumwaterstoffosfaat); 100 μL is nodig per monster. Bewaar de bereide oplossing bij 2-8 °C beschermd tegen licht. De oplossing is stabiel voor maximaal 3 maanden.</li>
</ol>2. Monsterverzameling en -opslag
<ol><li>Plasma-isolatie:<ol><li>Verzamel 4 ml perifere bloedmonsters in een lithium heparine bloedafnamebuis door venapunctie met een spuit van 22 G en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 4 °C op 1.600 x g .</li>
		<li>Breng het supernatant over in een 2 ml safe-lock monsterbuis.</li>
		<li>Centrifugeer het supernatant opnieuw bij 16.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C om eventuele resterende cellen te verwijderen.</li>
		<li>Verzamel het supernatant in een nieuwe safe-lock monsterbuis zonder de pellet aan de onderkant van de buis te verstoren.</li>
		<li>Bewaar het verkregen plasma bij −80 °C tot verder gebruik. OPMERKING: Om met deze test resultaten met een hoge doorvoer te verkrijgen, zijn monsters van goede kwaliteit vereist. Als plasmamonsters worden gebruikt, voert u een tweede centrifugatie uit om eventuele resterende cellen te verwijderen. Vermijd herhaaldelijk ontdooien van de monsters. Gebruik heparine als antistollingsmiddel omdat EDTA de DNase-activiteit beïnvloedt.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolatie van polymorfonucleaire neutrofielen<ol><li>Verzamel de perifere bloedmonsters in een lithium heparine bloedafnamebuis door venapunctie met een spuit van 22 G.</li>
		<li>Leg 6 ml bloed op 6 ml eenstaps polymorfen en centrifugeer de buizen gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur (RT) op 1.000 x g .</li>
		<li>Oogst de derde buffy vachtlaag met neutrofielen en was deze drie keer in fenolroodvrije RPMI-1640 op 400 x g gedurende 10 minuten bij RT.</li>
		<li>Resuspendeer de neutrofielen in fenolroodvrij RPMI-1640 met 2 mM L-glutamine aangevuld met 6% warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum en tel de cellen in het microscoopveld met een hemocytometer. OPMERKING: Deze methode levert 96% tot 98% zuiverheid met meer dan 95% levensvatbaarheid, zoals beoordeeld door trypan blauwe kleurstofuitsluiting.</li>
	</ol></li>
	<li>Activering van polymorfonucleaire neutrofielen en NETosis in vitro
	<ol><li>Verdun vers geïsoleerde polymorfonucleaire neutrofielen tot 1 × 105 cellen/ml in fenolroodvrij RPMI-1640 met 2 mM L-glutamine aangevuld met 6% warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum, en zaai ze in kweekschalen van 35 mm.</li>
		<li>Om NET's te induceren, stimuleer polymorfonucleaire neutrofielen met 25 nM PMA gedurende 4 uur bij 37 °C in 5% CO2/95% lucht.</li>
		<li>Na 4 uur incubatie verteert u de NET's gedeeltelijk door 0,6 μg/ml DNase I rechtstreeks aan de kweekschalen toe te voegen gedurende 15 minuten bij RT, en stopt u de DNase I-activiteit door 5 mM EDTA toe te voegen.</li>
		<li>Verzamel het medium dat de gesynthetiseerde NET's bevat en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 400 x g bij 4 °C om het celafval te verwijderen.</li>
		<li>Verkrijg de supernatanten uit vier gezonde controles, meng en bewaar bij −80 °C tot gebruik. OPMERKING: DNase-verteerde PMA-gestimuleerde neutrofielen verkregen uit vier gezonde controles worden gebruikt als de NET-standaard 1,14,15. Genereer een kalibratiecurve van een serieel verdunde NET-standaard met PBS en wijs de optische dichtheid (OD) waarden verkregen uit een onverdunde NET-standaard toe als 100% NET.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Testmethode
OPMERKING: De stappen voor het uitvoeren van de test worden hieronder in detail beschreven.
<ol><li>Dag 1<ol><li>Breng in totaal 100 μl verdund anti-MPO- of anti-NE-antilichaam met 0,05 μg antilichaam aan op elk putje van de plaat, inclusief het blanco putje. OPMERKING: De coatingbuffer mag geen reinigingsmiddel bevatten, omdat de antilichamen anders mogelijk niet gelijkmatig en soepel aan de wanden van elke put binden. Om het haakeffect te voorkomen, mag de concentratie van het coatingeiwit niet hoger zijn dan 20 μg/ml, omdat concentraties boven dat niveau de meeste beschikbare plaatsen op de microtiterplaat zullen verzadigen. Het typische concentratiebereik van eiwitcoatingoplossingen is 2-10 μg / ml. Gebruik voor het voorlopige experiment verdund iso-type controle-antilichaam IgG-konijn voor coating in plaats van specifieke monoklonale antilichamen tegen MPO. Gebruik verdund iso-type controleantilichaam IgG1-muis voor coating in plaats van specifieke monoklonale antilichamen tegen NE.</li>
		<li>Bedek de plaat met een zelfklevende plastic afdekking om de verdamping van het monster te voorkomen en incuber een nacht bij 4 °C om de afvangantistoffen te kunnen binden.</li>
	</ol></li>
	<li>Dag 2<ol><li>Gooi de verdunde antilichaamoplossing uit de putjes weg en pipetteer vervolgens 300 μL wasoplossing per put en herhaal deze wasprocedure drie tot vier keer.</li>
		<li>Verwijder overtollige PBS door de plaat droog te tikken op een papieren handdoek.</li>
		<li>Blokkeer elk putje van de ELISA-plaat met 200 μL van de blokkeringsbuffer.</li>
		<li>Bedek de plaat goed met een zelfklevende plastic afdekking en incuber deze gedurende 1,5-2 uur bij RT om de putten te belemmeren.</li>
		<li>Gooi de blokkerende oplossing volledig uit de putjes en pipetteer vervolgens 300 μL wasoplossing per put en herhaal deze wasprocedure drie tot vier keer.</li>
		<li>Verwijder overtollige PBS door de plaat droog te tikken op een papieren handdoek.</li>
		<li>Breng in totaal 25 μL plasma of medium aan op elke put, behalve de lege put, en voeg 75 μL PBS toe als verdunningsmiddel om het uiteindelijke volume 100 μL te maken; voeg 100 μL PBS toe aan de lege put.</li>
		<li>Meng vervolgens de monsters op RT gedurende 10 s door de plaat op een shaker bij 250 tpm te plaatsen.</li>
		<li>Breng 2 μL 100-voudig verdund DNase I (0,03 mg/ml) aan op elk putje, inclusief het blanco putje (eindconcentratie van DNase I in het reactiemengsel: 0,6 μg/ml).</li>
		<li>Sluit de plaat af met een zelfklevende plastic afdekking en meng de monsters grondig bij RT gedurende 10 s door de plaat op een shaker bij 250 tpm te plaatsen. OPMERKING: Om de optimale omstandigheden voor DNA-vertering te beoordelen, hebben we bij het ontwikkelen van de test monsters geïncubeerd met MPO-geassocieerd DNA van patiënten met COVID-19 met 0-0,9 μg / ml DNase I gedurende 15 minuten bij RT en platen gebruikt die zijn gecoat met specifiek vangstantilichaam voor MPO of een soortgematcht iso-type controleantilichaam.</li>
		<li>Incubeer de monsters gedurende 15 minuten bij RT.</li>
		<li>Verwijder de zelfklevende plastic afdekking en breng 1 μL van 0,5 M EDTA aan op elke put om de DNase-reactie te stoppen.</li>
		<li>Sluit de plaat opnieuw met een zelfklevende plastic afdekking en schud deze gedurende 15 s op RT door deze op een schudder bij 250 tpm te plaatsen.</li>
		<li>Incubeer de plaat vervolgens een nacht bij 4 °C om de eiwitcomponenten van de NET's te laten hechten aan de afvangantistoffen.</li>
	</ol></li>
	<li>Dag 3<ol><li>Verwijder de zelfklevende plastic afdekking en gooi de oplossing uit de putjes.</li>
		<li>Gooi de oplossing volledig uit de putjes en pipetteer vervolgens 300 μL van de wasoplossing per put en herhaal deze wasprocedure drie tot vier keer.</li>
		<li>Breng in totaal 100 μL van het verdunde peroxidase-geconjugeerde anti-DNA-detectieantilichaam aan op elk putje.</li>
		<li>Sluit de plaat goed af met een zelfklevende plastic afdekking en incubeer deze gedurende 1,5 uur bij RT.</li>
		<li>Gooi de oplossing volledig uit de putjes en pipetteer vervolgens 300 μL wasoplossing per put en herhaal deze wasprocedure drie tot vier keer.</li>
		<li>Verwijder voorzichtig de resterende oplossing.</li>
		<li>Breng in totaal 100 μL ABTS-substraatoplossing aan op elke put en bedek de plaat met een zelfklevende plastic afdekking.</li>
		<li>Incubeer de plaat in het donker bij RT gedurende 20-30 minuten op een shaker bij 250 tpm. OPMERKING: Controleer de plaat met intervallen van 5 minuten totdat de gewenste OD-metingen zijn verkregen.</li>
		<li>Voeg in totaal 50 μL 2 M zwavelzuur toe om de reactie te stoppen.</li>
		<li>Meng de vloeibare inhoud van de putjes door voorzichtig op de zijkant van de plaat te tikken.</li>
		<li>Schakel de microplaatlezer in en sluit deze aan op de computer.</li>
		<li>Open de softwaretoepassing op de computer.</li>
		<li>Maak op de statusbalk een nieuw experiment en geef het een naam.</li>
		<li>Stel alle volgende parameters in voor het lezen van platen: Leestype, Absorptie; Leesmodus, eindpunt; Golflengten, 2; Lm-1, 405 nm; Lm-2, 490 nm; Automatisch mixen & Blanking voor, Uit; Voorgelezen plaat, uit; Automatische kalibratie, Aan; Strips, Lees hele plaat; Kolomgolflengteprioriteit, Kolomprioriteit; Rijtuigsnelheid, Normaal; en Automatisch lezen, Uit.</li>
		<li>Plaats vervolgens de 96-putplaat met de monsters in de lade en sluit deze.</li>
		<li>Selecteer ten slotte de knop Lezen zodat de plaat onmiddellijk wordt gelezen.</li>
		<li>Lees de absorptie van elke put bij een golflengte van 405 nm met behulp van een microplaatlezer (gebruik in dit stadium een golflengte van 490 nm als referentie).</li>
		<li>Voer automatisch de absorptiewaarde van het testmedium alleen af van alle onbekende monsters en sla de gegevens op. OPMERKING: Gebruik een standaardcurve verkregen uit serieel verdunde NET-standaard om de relatieve concentratie van NET in het monster 1,14,15 te berekenen. Hier worden de eindresultaten gepresenteerd als "MPO- of NE-DNA-complexen (% van de NET-standaard)." De detectiegrens (LOD) werd als volgt berekend op basis van de standaardafwijking (SD) en de helling van de kalibratiecurve (S): LOD = 3,3(SD/S).</li>
	</ol></li>
</ol>4. Statistieken
<ol><li>Voer alle statistische analyses uit met behulp van geschikte statistische analysesoftware. Hier werd SigmaPlot v14.5 gebruikt. Percentages en continue variabelen worden weergegeven als de mediaan met het interkwartielbereik vanwege de scheve verdeling van de meeste parameters.</li>
	<li>Vergelijk de plasma MPO-DNA en NE-DNA niveaus tussen COVID-19 patiënten en gezonde controles met behulp van de Wilcoxon rank sum test. Gebruik correlatieanalyse om de relatie tussen optische dichtheid en het percentage NET-standaard te onderzoeken.</li>
</ol>

<ol><li>Sil, P., Yoo, D. G., Floyd, M., Gingerich, A., Rada, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+measurement+of+extracellular+DNA+release+and+quantitative+NET+formation+in+human+neutrophils+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">High throughput measurement of extracellular DNA release and quantitative NET formation in human neutrophils in vitro.</a> Journal of Visualized Experiments. (112), e52779(2016).</li>
<li>Yoo, D. G., Floyd, M., Winn, M., Moskowitz, S. M., Rada, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NET+formation+induced+by+Pseudomonas+aeruginosa+cystic+fibrosis+isolates+measured+as+release+of+myeloperoxidase-DNA+and+neutrophil+elastase-DNA+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Letters%22%5BJournal%5D)">NET formation induced by Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis isolates measured as release of myeloperoxidase-DNA and neutrophil elastase-DNA complexes.</a> Immunology Letters. 160 (2), 186-194 (2014).</li>
<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li>
<li>Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+in+immunity+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps in immunity and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18, 134-147 (2018).</li>
<li>Chamardani, T. M., Amiritavassoli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+NETosis+for+treatment+purposes%3A+Friend+or+foe%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Inhibition of NETosis for treatment purposes: Friend or foe.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. 477 (3), 673-688 (2022).</li>
<li>Rao, A. N., Kazzaz, N. M., Knight, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+neutrophil+extracellular+traps+contribute+to+the+heightened+risk+of+thrombosis+in+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Do neutrophil extracellular traps contribute to the heightened risk of thrombosis in inflammatory diseases.</a> World Journal of Cardiology. 7 (12), 829-842 (2015).</li>
<li>Sørensen, O. E., Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+-+The+dark+side+of+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps - The dark side of neutrophils.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1612-1620 (2016).</li>
<li>Abrams, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+for+neutrophil+extracellular+traps+%28NETs%29+formation+independently+predicts+disseminated+intravascular+coagulation+and+mortality+in+critically+ill+patients%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">A novel assay for neutrophil extracellular traps (NETs) formation independently predicts disseminated intravascular coagulation and mortality in critically ill patients.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 200 (7), 869-880 (2019).</li>
<li>Brinkmann, V., Goosmann, C., Kühn, L. I., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+quantification+of+in+vitro+NET+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Automatic quantification of in vitro NET formation.</a> Frontiers in Immunology. 3, 413(2012).</li>
<li>Zhao, W., Fogg, D. K., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+image-based+quantitative+method+for+the+characterization+of+NETosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel image-based quantitative method for the characterization of NETosis.</a> Journal of Immunological Methods. 423, 104-110 (2015).</li>
<li>Masuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NETosis+markers%3A+Quest+for+specific%2C+objective%2C+and+quantitative+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers.</a> Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).</li>
<li>Rada, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps.</a> Methods in Molecular Biology. 1982, 517-528 (2019).</li>
<li>Kano, H., Huq, M. A., Tsuda, M., Noguchi, H., Takeyama, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sandwich+ELISA+for+circulating+myeloperoxidase-+and+neutrophil+elastase-DNA+complexes+released+from+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Techniques+in+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Sandwich ELISA for circulating myeloperoxidase- and neutrophil elastase-DNA complexes released from neutrophil extracellular traps.</a> Advanced Techniques in Biology & Medicine. 5 (1), 1000196(2016).</li>
<li>Prevel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+markers+of+neutrophil+extracellular+trap+are+linked+to+survival+but+not+to+pulmonary+embolism+in+COVID-19-related+ARDS+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Plasma markers of neutrophil extracellular trap are linked to survival but not to pulmonary embolism in COVID-19-related ARDS patients.</a> Frontiers in Immunology. 13, 851497(2022).</li>
<li>Schechter, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.+extracellular+trap+%28NET%29+levels+in+human+plasma+are+associated+with+active+TB%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">et al. extracellular trap (NET) levels in human plasma are associated with active TB.</a> PLoS One. 12, e0182587(2017).</li>
<li>Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+elastase+and+myeloperoxidase+regulate+the+formation+of+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Cell Biology. 191 (3), 677-691 (2010).</li>
<li>Gupta, S., Chan, W., Zaal, K. J., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+real-time+imaging+technique+to+quantify+NETosis+and+distinguish+mechanisms+of+cell+death+in+human+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">A high-throughput real-time imaging technique to quantify NETosis and distinguish mechanisms of cell death in human neutrophils.</a> Journal of Immunology. 200 (2), 869-879 (2018).</li>
<li>Li, M., Lin, C., Leso, A., Nefedova, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+citrullinated+histone+H3+bound+DNA+for+detection+of+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Quantification of citrullinated histone H3 bound DNA for detection of neutrophil extracellular traps.</a> Cancers. 12 (11), 3424(2020).</li>
<li>Thålin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+citrullinated+histones%3A+Development+of+an+improved+assay+to+reliably+quantify+nucleosomal+H3Cit+in+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Quantification of citrullinated histones: Development of an improved assay to reliably quantify nucleosomal H3Cit in human plasma.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (10), 2732-2743 (2020).</li>
<li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAD4+is+essential+for+antibacterial+innate+immunity+mediated+by+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1853-1862 (2010).</li>
<li>Zuo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+in+COVID-19%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps in COVID-19.</a> JCI Insight. 5 (11), e138999(2020).</li>
<li>Masso-Silva, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+peripheral+blood+neutrophil+activation+phenotypes+and+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+critically+ill+Coronavirus+disease+2019+%28COVID-19%29+patients%3A+A+case+series+and+review+of+the+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Increased peripheral blood neutrophil activation phenotypes and neutrophil extracellular trap formation in critically ill Coronavirus disease 2019 (COVID-19) patients: A case series and review of the literature.</a> Clinical Infectious Diseases. 74 (3), 479-489 (2022).</li>
<li>Gong, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+potential+biomarkers+and+immune+features+of+sepsis+using+bioinformatics+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mediators+of+Inflammation%22%5BJournal%5D)">Identification of potential biomarkers and immune features of sepsis using bioinformatics analysis.</a> Mediators of Inflammation. 2020, 3432587(2020).</li>
<li>Almansa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+correlates+of+organ+failure+extent+in+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infection%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic correlates of organ failure extent in sepsis.</a> Journal of Infection. 70 (5), 445-456 (2015).</li>
</ol>

Alle gegevens die tijdens dit onderzoek zijn gegenereerd en/of geanalyseerd, zijn opgenomen in dit gepubliceerde artikel. De auteurs verklaren dat ze geen tegenstrijdige belangen hebben.

We hebben een sandwich ELISA-methode beschreven waarbij MPO of NE bindt aan één plaats van het vangantilichaam tijdens de eerste incubatie van monsters die MPO-DNA- of NE-DNA-complexen bevatten. Na het wassen wordt de "sandwich" voltooid door de monsters te incuberen met een peroxidase-geassocieerd anti-DNA monoklonaal antilichaam. Na de verwijdering van ongebonden secundair antilichaam wordt het gebonden peroxidaseconjugaat gedetecteerd door de toevoeging van een chromogeen ABTS-peroxidasesubstraat, dat een oplosbaar ei...

Dit artikel schetst een methode om de vorming van neutrofiele extracellulaire val (NET) in biologische vloeistoffen te kwantificeren met behulp van sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) om complexen van myeloperoxidase (MPO) en neutrofiele elastase (NE) te detecteren met DNA 1,2. NET's bestaan uit een DNA-ruggengraat versierd met antimicrobiële proteasen afkomstig van neutrofiele korrels 3,4. Zowel MPO-DNA- als NE-DNA-complexen zijn belangrijke en specifieke componenten van NET's en worden vrijgegeven in de extracellulaire ruimte als afbraakproducten van NETs 3,4.
Naast hun belangrijke fysiologische rol in antimicrobiële afweer3, hebben NET's ook verschillende pathologische effecten4,5, waaronder de bevordering van trombogenese6 en de verergering van sepsis7. Dienovereenkomstig hebben NET's de laatste tijd aandacht gekregen. Niettemin is de in vivo kwantificering van NET's een uitdaging gebleken vanwege het ontbreken van een gevoelige, betrouwbare kwantitatieve testmethode.
Er zijn enkele methoden beschikbaar, waaronder de directe meting van NET's door fluorescentiemicroscopie8,9 en flowcytometrie 10 en de indirecte meting van circulerend celvrij DNA, nucleosomen en citrullinated histon H3, maar elke methode heeft zijn eigen voordelen en beperkingen11. Hoewel de immunofluorescentiemicroscopische methode specifiek is voor NET's en duidelijk de lokalisatie en mate van NET-vorming laat zien, zijn monsters beperkt tot biopsieweefsel en uitgescheiden materialen. Bovendien moet deze methode worden uitgevoerd door bekwame onderzoekers en duurt het lang voordat resultaten worden verkregen. Het meten van circulerende niveaus van NET-gerelateerde componenten door middel van flowcytometrie is eenvoudig en levert snel resultaten op; De methode is echter niet specifiek voor NET's12.
Wij13 en anderen1,2 hebben een zeer gevoelige en betrouwbare test ontwikkeld om de circulerende NET-componenten, MPO-geconjugeerd of NE-geconjugeerd DNA, in menselijk plasma te meten met een gemodificeerde ELISA-techniek die specifieke antilichamen voor MPO of NE gebruikt als de vangstantistoffen en een DNA-specifiek detectieantilichaam. Deze test kan ook ex vivo worden gebruikt om NET-componenten te identificeren in celkweeksupernatanten die vrijkomen door geactiveerde neutrofielen als reactie op phorbol 12-myristate 13-acetaat (PMA) stimulatie.

<table><tbody><tr><td>1-Step Polymorphs</td><td>Accurate Chemical and Scientific Corporation</td><td>AN221725</td><td>Isolation van PMN's uit menselijk bloed.</td></tr><tr><td>96-well microtiter plate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>467466</td><td>platte bodem</td></tr><tr><td>ABTS buffer oplossing</td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>11 204 530 001</td><td>Bevat natriumperboraat, citroenzuur en dinatriumwaterstoffosfaat. </td></tr><tr><td>ABTS tabletten</td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>11 204 521 001&nbsp;</td><td>Elke tablet bevat 5 mg ABTS substraat en 60 mg voermiddelen.</td></tr><tr><td>Zelfklevende plastic afdekking, Axygen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14222348</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MPO antilichaam</td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>&nbsp;07-496-I</td><td>Bewaar bij 2-8 &deg;C. stabiel gedurende 1 jaar. Gastheersoort is konijn.</td></tr><tr><td>Anti-NE antilichaam, clone AHN-10</td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>MABS461</td><td>Bewaar bij 2-8 &deg;C. stabiel gedurende 1 jaar. Gastheersoort is muis.</td></tr><tr><td>Rundserum albumine</td><td>Biomedical Science</td><td>BR-220700081</td><td>Albumine uit bovine fractie V. Bewaar bij 2&ndash;8 &deg;C. stabiel gedurende 2 jaar.</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>New England BioLabs</td><td>M0303M</td><td>Bewaar bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>IgG, konijn, Isotype Control</td><td>GENETEX, Inc.</td><td>GTX35035</td><td>Bewaar als geconcentreerde oplossing bij 2&ndash;8 &deg;C.</td></tr><tr><td>IgG1, muis Isotype Control, clone Ci4</td><td>Merck&nbsp;</td><td>MABC002</td><td>Bewaar als geconcentreerde oplossing bij 2&ndash;8 &deg;C.</td></tr><tr><td>Lithium heparine bloedafnamebuisje</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microplate mixer</td><td>As one corporation</td><td>NS-P</td><td></td></tr><tr><td>Microplate Reader</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax 190&nbsp;</td><td>Elke microplate plate reader die golflengten van 405&ndash;490 nm kan lezen kan gebruiken.</td></tr><tr><td>Microplate reader toepassing</td><td>Molecular Devices</td><td>SoftMax pro</td><td></td></tr><tr><td>Peroxidase-geconjugeerd anti-DNA antilichaam, Cell death Detection ELISA</td><td>Roche Diagnostics</td><td>1154467500</td><td>&nbsp;fles 2. Bewaar bij 2&ndash;8 &deg;C. stabiel gedurende 1 jaar.</td></tr><tr><td>Phorbol 12-myristaat 13-acetaat</td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>P8139</td><td>Activering van PMN's uit menselijk bloed.</td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde oplossing</td><td>Takara Bio</td><td>T9181</td><td>Bewaar bij kamertemperatuur. Stabiel gedurende 6 maanden.</td></tr><tr><td>SigmaPlot v14.5</td><td>&nbsp;Systat Software Inc. San Jose, CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natriumaziet</td><td>Fujifilm Wako Chemicals</td><td>190-14901</td><td>Bewaar bij kamertemperatuur.</td></tr><tr><td>t-Octylfenoxypolyethoxyethanol, Polyethyleenglycol tert-octylfenylether</td><td>Fujifilm Wako Chemicals</td><td>9002-93-1</td><td>Bewaar bij kamertemperatuur.</td></tr></tbody></table>

kwantificeren van myeloperoxidase-dna en neutrofiele elastase-dna-complexen van neutrofiele extracellulaire vallen met behulp van een gemodificeerde sandwich-elisa

Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA

Bepaalde stimuli, zoals micro-organismen, zorgen ervoor dat neutrofielen neutrofiele extracellulaire vallen (NET's) vrijgeven, die in feite webachtige structuren zijn die zijn samengesteld uit DNA met korreleiwitten, zoals myeloperoxidase (MPO) en neutrofiele elastase (NE), en cytoplasmatische en cytoskeletale eiwitten. Hoewel de belangstelling voor NET's de laatste tijd is toegenomen, is er geen gevoelige, betrouwbare testmethode beschikbaar voor het meten van NET's in klinische omgevingen. Dit artikel beschrijft een gemodificeerde sandwichenzym-gebonden immunosorbenttest om twee componenten van circulerende NET's, MPO-DNA en NE-DNA-complexen, kwantitatief te meten, die specifieke componenten van NET's zijn en in de extracellulaire ruimte worden vrijgegeven als afbraakproducten van NET's. De test gebruikt specifieke monoklonale antilichamen voor MPO of NE als de vangstantistoffen en een DNA-specifiek detectieantilichaam. MPO of NE bindt aan één plaats van het vangantilichaam tijdens de eerste incubatie van monsters die MPO-DNA of NE-DNA-complexen bevatten. Deze assay toont een goede lineariteit en een hoge inter-assay en intra-assay precisie. We gebruikten het bij 16 patiënten met COVID-19 met bijbehorend acuut respiratoir distress-syndroom en vonden dat de plasmaconcentraties van MPO-DNA en NE-DNA significant hoger waren dan in het plasma verkregen uit gezonde controles. Deze detectietest is een betrouwbare, zeer gevoelige en nuttige methode voor het onderzoeken van de kenmerken van NET's in menselijk plasma en kweeksupernatanten.

Deze methode gebruikte een sandwich ELISA met anti-MPO, anti-NE en anti-DNA monoklonale antilichamen om MPO-geassocieerd en NE-geassocieerd DNA te meten (figuur 1). Bij deze methode werden de putjes van een microtiterplaat gecoat met een MPO-specifiek of NE-specifiek monoklonaal antilichaam om DNA-geassocieerd MPO en DNA-geassocieerd NE te vangen, evenals niet-DNA-geassocieerde MPO en NE. Om de intra-assay coëfficiënt van variabiliteit (CV) te berekenen, werden dubbele metingen uitgevoerd bi...

We presenteren een protocol voor een gemodificeerde sandwich enzym-gebonden immunosorbent assay techniek om kwantitatief twee componenten van neutrofiele extracellulaire val restanten, myeloperoxidase geconjugeerd-DNA en neutrofiele elastase geconjugeerd-DNA complexen, afgeleid van geactiveerde neutrofielen.

Kwantificeren van myeloperoxidase-DNA en neutrofiele elastase-DNA-complexen van neutrofiele extracellulaire vallen met behulp van een gemodificeerde sandwich-ELISA

Certain stimuli, such as microorganisms, cause neutrophils to release neutrophil extracellular traps (NETs), which are basically web-like structures ...

NET's hebben de laatste tijd de aandacht getrokken, maar het kwantificeren van NET's in vivo is een uitdaging gebleken. Dit protocol biedt een wenselijke, zeer gevoelige en waardevolle methode voor het onderzoeken van de kenmerken van NET's in klinische omgevingen. Deze techniek moet zich uitstrekken tot het evalueren van de ernst van sepsis of septische ARDS, acuut respiratoir distress syndroom.Het is algemeen aanvaard dat het reguleren van stortplaatsen of schade-geassocieerde moleculaire patronen een sleutel is tot het verbeteren van de klinische toestand van sepsis. Het grootste voordeel van deze methode is de nauwkeurige kwantificering van circulerende NET-restanten zoals myeloperoxidase-DNA en neutrofiele elastase-DNA in korte tijd. Het is raadzaam om de monsters vóór de test te laten draaien en herhaaldelijk ontdooien te voorkomen.Het is belangrijk om de incubatietijden te volgen zoals aangegeven in het protocol. Begin met het verdunnen van vers geïsoleerde polymorfonucleaire neutrofielen tot 10.000 cellen per milliliter in fenolroodvrije RPMI 1640. Zeef ze in kweekschalen van 35 millimeter.Om neutrofiele extracellulaire vallen of NET's te induceren, stimuleert u eerst de polymorfonucleaire neutrofielen met 25 nanomolaire PMA. Verwerk vervolgens de extracellulaire vallen gedeeltelijk door 0,6 microgram per milliliter DNase I toe te voegen en incuber het mengsel gedurende 50 minuten bij kamertemperatuur. Voeg nu vijf-millimolaire EDTA toe om de DNase-activiteit te stoppen en verzamel het medium dat de gesynthetiseerde NET's bevat.Centrifugeer om het celafval te verwijderen. Verzamel de supernatanten van vier gezonde controles. Meng ze bij min 80 graden Celsius voor verder gebruik.Pipetteer 100 microliter verdund anti-myeloperoxidase met 0,05 microgram van het antilichaam in een ELISA-plaat. Bedek nu de plaat met een zelfklevende plastic hoes om verdamping van het monster te voorkomen en incuber het monster 's nachts bij vier graden Celsius om de binding van de afvangantistoffen mogelijk te maken. Gooi de volgende dag de verdunde antilichaamoplossing uit de putjes weg en pipetteer 300 microliter wasoplossing in elk putje.Tik de plaat droog op een papieren handdoek om de overtollige PBS te verwijderen. Blokkeer elk putje van de plaat met 200 microliter van de blokkeerbuffer. Bedek het met een zelfklevende plastic hoes en belemmer de putten door het te incuberen.Nadat je de blokkerende oplossing uit de putjes hebt weggegooid en de plaat drie tot vier keer hebt gewassen, tik je hem droog op een papieren handdoek. Pipetteer vervolgens 25 microliter plasma in alle putjes behalve de blanco. En verdun het met 75 microliter PBS, waardoor de uiteindelijke put 100 microliter wordt.Voeg vervolgens 100 microliter PBS toe aan de lege put. Meng de monsters door de plaat gedurende 10 seconden bij 250 tpm bij kamertemperatuur op een shaker te plaatsen. Voeg twee microliter van 100 volledig verdunde DNase I toe aan alle putjes en plaats de verzegelde plaat gedurende 10 seconden op de shaker om de monsters grondig te mengen.Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Voeg een microliter van 0,5 molaire EDTA toe aan elke put om de DNase-reactie te stoppen. Plaats vervolgens de verzegelde plaat gedurende 15 seconden op de shaker om de monsters grondig te mengen.Incubeer ten slotte de plaat 's nachts bij vier graden Celsius om de eiwitcomponenten van de NET's te laten hechten aan de afvangantistoffen. Gooi de volgende dag de oplossing uit de putten. Na meerdere putwasbeurten, pipetteer 100 microliter van het verdunde peroxidase-geconjugeerde anti-DNA-detectieantilichaam in elke put.Incubeer de plaat gedurende 1 1/2 uur en gooi de oplossing vervolgens in de putjes weg. Na het driemaal wassen van de putten, pipetteer 100 microliter ABTS-substraatoplossing in elke put en incuber de verzegelde plaat op een shaker in het donker. Stop de reactie door 50 microliter twee-molair zwavelzuur toe te voegen.Meng de inhoud van de put door voorzichtig op de zijkanten van de plaat te tikken. Sluit vervolgens de microplaatlezer aan op de computer en start de softwaretoepassing. Maak op de statusbalk een nieuw experiment en geef het een naam.Stel vervolgens de plaatleesparameters in door Absorptie te selecteren als het leestype, Eindpunt als de leesmodus en twee als de golflengten. Stel vervolgens lambda één in als 405 nanometer, lambda twee als 490 nanometer. Selecteer nu de uit-status voor zowel Automix als Blanking terwijl u de AutoCalibration als Aan houdt.Selecteer vervolgens Hele plaat lezen onder Strips.Stel ten slotte de kolomgolflengteprioriteit in met Normaal als de wagensnelheid en selecteer vervolgens Uit onder AutoRead. Plaats de plaat goed in de instrumentlade en sluit deze. Klik op Lezen zodat de plaat direct gelezen wordt.Lees de absorptie van elke put op 405 nanometer en voer automatische aftrekking uit van de absorptie van het testmedium van alle onbekende monsters. Betrouwbare standaardkalibratiecurven werden verkregen voor zowel MPO-DNA als NE-DNA wanneer de absorptiewaarden niet hoger waren dan respectievelijk 0,93 en 0,9. De hoogste OD werd verkregen wanneer 0,6 microgram per milliliter DNase I werd aangebracht.De inter-assay variabiliteitscoëfficiënten voor de complexen in gezonde controles waren respectievelijk 1,871 en 0,987, terwijl de COVID-19-patiënten variabiliteitscoëfficiënten van respectievelijk 2,532 en 2,010 vertoonden. De gemiddelde inter-assay variabiliteitscoëfficiënten voor MPO-DNA en NE-DNA waren respectievelijk 6.524 en 4.389. De specificiteit van de capture-antilichamen voor de MPO-DNA- en NE-DNA-complexen toonde aan dat de iso-type controleantistoffen weinig reageerden op de complexen.Het percentage van beide complexen was hoger in het plasma van patiënten met COVID-19 ten opzichte van de gezonde controles. De verteringstijd van DNase moet worden geoptimaliseerd, anders zal overmatige spijsvertering de absorptie verminderen.

quantifying-myeloperoxidase-dna-neutrophil-elastase-dna-complexes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Neutrofielen extracellulaire Vallen (NET's) zijn een belangrijk aangeboren immuun mechanisme om pathogene bacteriën, schimmels en parasieten te bestrijden. Hier beschrijven we methoden om neutrofiele granulocyten isoleren uit menselijk bloed en ze te activeren om netten te vormen. We presenteren bereidingstechnieken aan netten in licht-en elektronenmicroscopie te visualiseren.

Neutrofielen Extracellulaire Traps: Hoe te genereren en te visualiseren

This video demonstrates the induction and visualization of neutrophil extracellular traps or NETs in pre-labeled neutrophils using patient serum containing anti-neutrophil cytoplasmic antibodies. Furthermore, using an impermeable DNA dye and fluorescence microscopy enables the visualization of NETs.

Induction and Visualization of Neutrophil Extracellular Traps in Pre-Labeled Neutrophils

Er worden high throughput-assays gepresenteerd die in combinatie uitstekende tools bieden om NET-afgifte van humane neutrofielen te kwantificeren.

High Throughput Meting van extracellulaire DNA los en Kwantitatieve NET Formation in menselijke neutrofielen<em&gt; In Vitro</em

Lipiden is bekend dat ze een belangrijke rol in cellulaire functies spelen. We beschrijven een werkwijze om de lipidesamenstelling van neutrofielen te bepalen, met de nadruk op het cholesterolgehalte, door zowel HPTLC en HPLC aan een beter begrip van de onderliggende mechanismen van neutrofielen extracellulaire val vorming krijgen.

Methoden om te studeren Lipidenveranderingen in neutrofielen en de daaropvolgende vorming van neutrofielen Extracellulaire Traps

Neutrofielen extracellulaire vallen (NET's) zijn netwerken van DNA, histonen en neutrofielen eiwitten. Hoewel een deel van de aangeboren immuunrespons zijn NET betrokken bij autoimmuniteit en trombose. Dit protocol beschrijft een eenvoudige werkwijze voor honden neutrofielen isolatie en kwantificering van netten met een microplaat fluorescentie assay.

A Simple Fluorescence Assay voor het kwantificeren van Canine neutrofielen extracellulaire inklembeveiliging

We beschrijven de methoden om te isoleren canine neutrofielen van volbloed en visualiseren van netto vorming in levende neutrofiele granulocyten met behulp van fluorescentie microscopie. Ook beschreven zijn protocollen te kwantificeren netto vorming en citrullinated Histon H3 (citH3)-expressie met immunofluorescentie microscopie.

In Vitro Canine neutrofiele extracellulaire Trap vorming: Dynamische en kwantitatieve analyse door fluorescentie microscopie

Hier presenteren we een protocol voor het genereren van neutrofiele extracellulaire vallen (netten) en het bedienen van NETQUANT, een volautomatische software optie voor het kwantificeren van netten in immunofluorescentie beelden.

Geautomatiseerde kwantificering van neutrofiele extracellulaire traps met behulp van NETQUANT

Dit protocol beschrijft een zeer gevoelige en hoge doorvoer neutrofiele extracellulaire val (NET) assay voor de semi-automatische kwantificering van ex vivo NET vorming door immunofluorescentie driedimensionale confocale microscopie. Dit protocol kan worden gebruikt voor het evalueren van de netto vorming en afbraak na verschillende prikkels en kan worden gebruikt voor het bestuderen van potentiële NET-gerichte therapieën.

Een High-throughput Assay voor het beoordelen en kwantificeren van neutrofiele extracellulaire Trap vorming

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de inductie en analyse van in vitro neutrofiele extracellulaire vallen (NET's). Kwantificering van DNA, cathelicidin (LL37) en enzymactiviteit leverde gegevens op die de variabiliteit in de samenstelling en morfologie van NET's geïnduceerd door microbiële en chemische stimuli onder vergelijkbare gecontroleerde omstandigheden aantonen.

Morfologische en compositorische analyse van neutrofiele extracellulaire vallen geïnduceerd door microbiële en chemische stimuli

We presenteren een geautomatiseerde high-throughput methode om neutrofiele extracellulaire vallen (NET's) te kwantificeren met behulp van het live cell analysesysteem, gekoppeld aan een membraanpermeabiliteit-afhankelijke dual-dye benadering.

Real-time High Throughput-techniek om de vorming van extracellulaire neutrofielen in menselijke neutrofielen te kwantificeren

Dit gedefinieerde protocol beschrijft een real-time high-throughput microscopiebenadering om de afgifte van humane neutrofielen extracellulaire val (NET) in vitro te visualiseren en te kwantificeren. De reproduceerbare methode maakt onderzoek mogelijk naar de kenmerken en kinetiek van NETosis-afgifte na stimulatie met verschillende NETosis-inductoren en maakt beoordeling van de farmacologie van NETosis-antagonisten mogelijk.

Realtime, high-throughput microscopische kwantificering van de afgifte van extracellulaire vallen van menselijke neutrofielen en beoordeling van de farmacologie van antagonisten

Leer een gemodificeerde sandwich-ELISA voor de kwantificering van myeloperoxidase-DNA en neutrofiele elastase-DNA-complexen uit neutrofiele extracellulaire vallen. Deze gevoelige methode ondersteunt klinisch onderzoek naar sepsis.

Kwantificeren van myeloperoxidase-DNA en neutrofiele elastase-DNA-complexen van neutrofiele extracellulaire vallen met behulp van een gemodificeerde sandwich-ELISA (Video) | JoVE Journal

Kwantificeren van myeloperoxidase-DNA en neutrofiele elastase-DNA-complexen van neutrofiele extracellulaire vallen met behulp van een gemodificeerde sandwich-ELISA

Meer video's verkennen