Kwantificeren van myeloperoxidase-DNA en neutrofiele elastase-DNA-complexen van neutrofiele extracellulaire vallen met behulp van een gemodificeerde sandwich-ELISA

NET's hebben de laatste tijd de aandacht getrokken, maar het kwantificeren van NET's in vivo is een uitdaging gebleken. Dit protocol biedt een wenselijke, zeer gevoelige en waardevolle methode voor het onderzoeken van de kenmerken van NET's in klinische omgevingen. Deze techniek moet zich uitstrekken tot het evalueren van de ernst van sepsis of septische ARDS, acuut respiratoir distress syndroom.

Het is algemeen aanvaard dat het reguleren van stortplaatsen of schade-geassocieerde moleculaire patronen een sleutel is tot het verbeteren van de klinische toestand van sepsis. Het grootste voordeel van deze methode is de nauwkeurige kwantificering van circulerende NET-restanten zoals myeloperoxidase-DNA en neutrofiele elastase-DNA in korte tijd. Het is raadzaam om de monsters vóór de test te laten draaien en herhaaldelijk ontdooien te voorkomen.

Het is belangrijk om de incubatietijden te volgen zoals aangegeven in het protocol. Begin met het verdunnen van vers geïsoleerde polymorfonucleaire neutrofielen tot 10.000 cellen per milliliter in fenolroodvrije RPMI 1640. Zeef ze in kweekschalen van 35 millimeter.

Om neutrofiele extracellulaire vallen of NET's te induceren, stimuleert u eerst de polymorfonucleaire neutrofielen met 25 nanomolaire PMA. Verwerk vervolgens de extracellulaire vallen gedeeltelijk door 0,6 microgram per milliliter DNase I toe te voegen en incuber het mengsel gedurende 50 minuten bij kamertemperatuur. Voeg nu vijf-millimolaire EDTA toe om de DNase-activiteit te stoppen en verzamel het medium dat de gesynthetiseerde NET's bevat.

Centrifugeer om het celafval te verwijderen. Verzamel de supernatanten van vier gezonde controles. Meng ze bij min 80 graden Celsius voor verder gebruik.

Pipetteer 100 microliter verdund anti-myeloperoxidase met 0,05 microgram van het antilichaam in een ELISA-plaat. Bedek nu de plaat met een zelfklevende plastic hoes om verdamping van het monster te voorkomen en incuber het monster 's nachts bij vier graden Celsius om de binding van de afvangantistoffen mogelijk te maken. Gooi de volgende dag de verdunde antilichaamoplossing uit de putjes weg en pipetteer 300 microliter wasoplossing in elk putje.

Tik de plaat droog op een papieren handdoek om de overtollige PBS te verwijderen. Blokkeer elk putje van de plaat met 200 microliter van de blokkeerbuffer. Bedek het met een zelfklevende plastic hoes en belemmer de putten door het te incuberen.

Nadat je de blokkerende oplossing uit de putjes hebt weggegooid en de plaat drie tot vier keer hebt gewassen, tik je hem droog op een papieren handdoek. Pipetteer vervolgens 25 microliter plasma in alle putjes behalve de blanco. En verdun het met 75 microliter PBS, waardoor de uiteindelijke put 100 microliter wordt.

Voeg vervolgens 100 microliter PBS toe aan de lege put. Meng de monsters door de plaat gedurende 10 seconden bij 250 tpm bij kamertemperatuur op een shaker te plaatsen. Voeg twee microliter van 100 volledig verdunde DNase I toe aan alle putjes en plaats de verzegelde plaat gedurende 10 seconden op de shaker om de monsters grondig te mengen.

Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Voeg een microliter van 0,5 molaire EDTA toe aan elke put om de DNase-reactie te stoppen. Plaats vervolgens de verzegelde plaat gedurende 15 seconden op de shaker om de monsters grondig te mengen.

Incubeer ten slotte de plaat 's nachts bij vier graden Celsius om de eiwitcomponenten van de NET's te laten hechten aan de afvangantistoffen. Gooi de volgende dag de oplossing uit de putten. Na meerdere putwasbeurten, pipetteer 100 microliter van het verdunde peroxidase-geconjugeerde anti-DNA-detectieantilichaam in elke put.

Incubeer de plaat gedurende 1 1/2 uur en gooi de oplossing vervolgens in de putjes weg. Na het driemaal wassen van de putten, pipetteer 100 microliter ABTS-substraatoplossing in elke put en incuber de verzegelde plaat op een shaker in het donker. Stop de reactie door 50 microliter twee-molair zwavelzuur toe te voegen.

Meng de inhoud van de put door voorzichtig op de zijkanten van de plaat te tikken. Sluit vervolgens de microplaatlezer aan op de computer en start de softwaretoepassing. Maak op de statusbalk een nieuw experiment en geef het een naam.

Stel vervolgens de plaatleesparameters in door Absorptie te selecteren als het leestype, Eindpunt als de leesmodus en twee als de golflengten. Stel vervolgens lambda één in als 405 nanometer, lambda twee als 490 nanometer. Selecteer nu de uit-status voor zowel Automix als Blanking terwijl u de AutoCalibration als Aan houdt.Selecteer vervolgens Hele plaat lezen onder Strips.

Stel ten slotte de kolomgolflengteprioriteit in met Normaal als de wagensnelheid en selecteer vervolgens Uit onder AutoRead. Plaats de plaat goed in de instrumentlade en sluit deze. Klik op Lezen zodat de plaat direct gelezen wordt.

Lees de absorptie van elke put op 405 nanometer en voer automatische aftrekking uit van de absorptie van het testmedium van alle onbekende monsters. Betrouwbare standaardkalibratiecurven werden verkregen voor zowel MPO-DNA als NE-DNA wanneer de absorptiewaarden niet hoger waren dan respectievelijk 0,93 en 0,9. De hoogste OD werd verkregen wanneer 0,6 microgram per milliliter DNase I werd aangebracht.

De inter-assay variabiliteitscoëfficiënten voor de complexen in gezonde controles waren respectievelijk 1,871 en 0,987, terwijl de COVID-19-patiënten variabiliteitscoëfficiënten van respectievelijk 2,532 en 2,010 vertoonden. De gemiddelde inter-assay variabiliteitscoëfficiënten voor MPO-DNA en NE-DNA waren respectievelijk 6.524 en 4.389. De specificiteit van de capture-antilichamen voor de MPO-DNA- en NE-DNA-complexen toonde aan dat de iso-type controleantistoffen weinig reageerden op de complexen.

Het percentage van beide complexen was hoger in het plasma van patiënten met COVID-19 ten opzichte van de gezonde controles. De verteringstijd van DNase moet worden geoptimaliseerd, anders zal overmatige spijsvertering de absorptie verminderen.