Antigeen-Capture Enzyme-Linked Immunosorbent Assay voor specifieke detectie van Mycoplasma pneumoniae

Zoals voor alle patiënten met mycoplasma, is hun diagnose van Mycoplasma pneumoniae een uitdaging vanwege kruisreacties. Onze voorgestelde ELISA is gebaseerd op de selectieve uitputting van niet-specifieke Mycoplasma pneumoniae antigenen met behulp van een adsorptietechniek. De in-house antigeen capture ELISA die in deze video wordt beschreven, garandeert een hoge ruimtelijke specificiteit.

En eigenlijk heeft het bewezen een betrouwbare gescreende test te zijn voor een nauwkeurige diagnose van Mycoplasm pneumoniae-infectie. De pre-ELISA-stappen worden gedemonstreerd door Imen Chniba, een promovendus. En de ELISA-stappen zijn Nadine Khadraoui, een technicus van ons laboratorium.

Om de antigeenadsorptieprocedure te starten, trekt u de 12 heterologe bacteriële antigenen in een microcentrifugebuis en past u de eiwitconcentratie aan die overeenkomt met de helft van het te adsorberen antiserum. Centrifugeer vervolgens het antigeenmengsel op 14.000 G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius om de pellet te verzamelen. Suspensie vervolgens de pellet opnieuw met de gezuiverde polyklonale anti-Mycoplasma pneumoniae IgG en incubeer gedurende twee uur bij 37 graden Celsius met langzame agitatie.

Aan het einde van de incubatie, centrifugeer de suspensie opnieuw bij 14.000 G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius en herstel het supernatant dat overeenkomt met het specifieke polyklonale Mycoplasma pneumoniae antiserum. Om een ELISA-plaat met 96 putten te coaten met een opvangantilichaam, verdunt u het antilichaam tot 10 microgram per milliliter en 0,1 molaire carbonaatbicarbonaatbuffer bij pH 9,6. Voeg vervolgens 100 microliter van het verdunde antilichaam toe aan elk putje van de microplaat en incubeer 's nachts bij vier graden Celsius.

Verwijder de volgende dag de coatingoplossing en was de plaat vijf keer met de wasbuffer. Blokkeer vervolgens de ongebonden oppervlakken van de gecoate putten door 100 microliter van de blokkerende oplossing aan elke put toe te voegen. Nadat u de plaat vanaf een uur bij kamertemperatuur hebt geïncubeerd, verwijdert u de blokkerende oplossing met een pipet en wast u de plaat zoals eerder gedemonstreerd.

Voeg een gelijke hoeveelheid Mycoplasma pneumoniae hele eiwitten toe in een concentratie van 10 nanogram per put en laat de antigeen-antilichaamreactie gedurende twee uur bij kamertemperatuur plaatsvinden. Verwijder na incubatie het overtollige antigeen en was de plaat zoals aangetoond. Verdun vervolgens de menselijke serumtestmonsters en verwijs naar positieve en negatieve serumcontroles.

Voeg vervolgens 100 microliter van de verdunde testmonsters en controles toe aan de juiste putten en duplicaten. Markeer de putjes die noch antigeen noch sera bevatten als blanco. Nadat u de plaat gedurende 90 minuten op kamertemperatuur hebt geïncubeerd, verwijdert u de serumoplossing en wast u de plaat vijf keer met de wasbuffer.

Pipetteer 100 microliter van het geschikte verdunde enzym geconjugeerde detectieantistoffen naar elke put en incubeer gedurende een uur bij 37 graden Celsius in het donker. Nadat u de ongebonden detectielichamen hebt verwijderd en de plaat hebt gewassen, voegt u 100 microliter TMB Chromogen-oplossing toe om de antigeen-antilichaambinding te visualiseren. Laat de plaat 30 minuten op kamertemperatuur ontwikkelen.

Stop vervolgens de reactie door 100 microliter 7,5% zwavelzuur toe te voegen. Lees ten slotte de absorptie op 450 nanometer met behulp van een microplaatlezer en sorteer de resultaten op basis van de berekening van de positiviteitsindex. Immunoblotanalyse tussen de Mycoplasma pneumoniae niet-geadsorbeerd polyklonaal antiserum en heterologe bacteriële antigenen onthulde kruisreactiviteit, maar met verschillende intensiteit.

Mycoplasma gallisepticum en Mycoplasma imitans antigenen vertoonden bijvoorbeeld de sterkste reactiviteit ondanks dat ze aviaire mycoplasma's waren. Daarentegen vertoonde geen van de twee humane klinische isolaten van Ureaplasma urealyticum enige reactie. Antigenen van de resterende menselijke genitale mycoplasmasoorten en andere bacteriële antigenen leverden echter aanzienlijke kruisreacties op met het antiserum.

Immunoblotanalyse bevestigde de efficiëntie van de Mycoplasma pneumoniae polyklonale antiserumadsorptie tegen de heterologe bacteriële antigenen. De adsorptieprocedure elimineerde alle kruisreacties, waardoor de Mycoplasma pneumoniae antiserum specifiek werd voor alle daaropvolgende serologische en immunoblottingtests. Verder bleek de set menselijke sera getest met behulp van de antigeenvangst ELISA ontwikkeld in deze studie positief voor Mycoplasma pneumoniae IgG met een goede specificiteit.

De specificiteit van deze ELISA wordt voornamelijk verzekerd door de adsorptietechniek, omdat het primordiaal is om deze kritieke stap zorgvuldig uit te voeren en minstens twee of drie keer te herhalen. Het principe van deze techniek kan worden toegepast om andere mycoplasmasoorten of andere bacteriën in het algemeen te diagnosticeren. De selectie van bacteriële antigenen voor adsorptie moet echter irrelevant en adequaat zijn.